養(yǎng)豬廢水中重金屬-抗生素雙抗菌的篩選

謝麗金，郭海珊，謝秀禎

（海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，海南海口571158）

長(zhǎng)期以來(lái)，某些抗生素和重金屬被添加于動(dòng)物飼料已非常普遍.在黃浦江、海河、北江等水域都被檢出常見(jiàn)獸用抗生素和抗生素抗性基因的普遍存在.這些流域的抗生素污染以磺胺類和四環(huán)素為主，而磺胺類和四環(huán)素類為養(yǎng)殖業(yè)常用抗生素，這些河周邊剛好密集著大量的禽畜養(yǎng)殖場(chǎng)[1-3].在長(zhǎng)期使用豬糞的作物中檢測(cè)出銅、鋅、砷均比未使用大型養(yǎng)豬場(chǎng)豬糞的含量高（P＜0.05），也有研究在施有機(jī)豬糞肥的土壤中也檢測(cè)出土霉素和金霉素[4-5].如果土壤被污染后，大量的重金屬和抗生素會(huì)隨著食物鏈和食物網(wǎng)進(jìn)入生物有機(jī)體，損害機(jī)體健康[6]，而對(duì)環(huán)境敏感的微生物可通過(guò)環(huán)境選擇馴化形成重金屬和抗生素協(xié)同抗性的雙重抗性細(xì)菌.有研究從在漁業(yè)養(yǎng)殖場(chǎng)中分離到的假單胞菌屬細(xì)菌有雙重抗性，在廣東某大型養(yǎng)豬場(chǎng)也篩選出多個(gè)雙抗菌株[6-8]，當(dāng)這些攜帶抗重金屬和抗抗生素基因的雙抗細(xì)菌在環(huán)境中進(jìn)行傳播、擴(kuò)散，對(duì)公共健康和食品、飲用水安全等生態(tài)環(huán)境安全構(gòu)成威脅[9-11].

海南現(xiàn)代特色農(nóng)業(yè)既要求規(guī)?；笮突忠苊庖?guī)?；斐傻沫h(huán)境污染.目前對(duì)養(yǎng)殖業(yè)廢水中有機(jī)污染物及其處理比較重視，而對(duì)新的抗生素污染和重金屬污染還沒(méi)有引起足夠的重視.但是許多微生物對(duì)重金屬和抗生素具有抗性和富集能力，所以在重金屬污染的土壤修復(fù)中微生物成為一種具有較好前景的修復(fù)工具[12-13].因此，本論文通過(guò)采集海南大型規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)養(yǎng)殖廢水進(jìn)行重金屬和抗生素雙抗實(shí)驗(yàn)，以期篩選出同時(shí)抗抗生素和抗重金屬的雙抗菌株，為以后研究抗性基因作用機(jī)理提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

養(yǎng)豬廢水樣品采自海南省海口市三江鎮(zhèn)某大型養(yǎng)豬廠沉淀池，養(yǎng)豬廢水內(nèi)含有大量的固體糞便顆粒懸浮物、尿和清洗水.

1.2 培養(yǎng)基配制

1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：牛肉膏3g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂15 g蒸餾水1000 mL pH7.0～7.2，滅菌（121 ℃，20 min）后倒平板備用.

2）試驗(yàn)培養(yǎng)基：以養(yǎng)殖廢水代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蒸餾水，滅菌（121℃，20 min）后倒平板備用，用于篩選養(yǎng)豬廢水中的部分細(xì)菌.

3）抗性試驗(yàn)培養(yǎng)基：試驗(yàn)培養(yǎng)基冷卻到60 ℃后加入CuCl2、NaAsO2、ZnSO4·7H2O 溶液，終濃度分別為：0.5mmol/L、2mmol/L 、1mmol/L；或加入鹽酸四環(huán)素、磺胺二甲嘧啶、紅霉素、桿菌肽鋅溶液，終濃度分別為：10 μg/mL、280 μg/mL、50 μg/mL、32 μg/mL.將4種抗生素3種重金屬，兩兩混勻，共12組，重金屬和抗生素的交叉組合見(jiàn)表1.

表1 重金屬和抗生素的交叉組合Tab.1 Cross combination of heavy metals and antibiotics

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 養(yǎng)豬廢水中優(yōu)勢(shì)菌的篩選

取10mL 過(guò)濾好的養(yǎng)豬廢水樣品，10 倍倍比梯度稀釋后，將10-4和10-5稀釋度的水樣涂布在養(yǎng)豬廢水配制的選擇培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度做3 個(gè)重復(fù).37 ℃培養(yǎng)1～2 d后觀察.對(duì)具有明顯特征的菌落劃線培養(yǎng)，直至得到單一菌落，對(duì)菌株進(jìn)行編號(hào)并記錄菌落特征，以斜面培養(yǎng)基保存該優(yōu)勢(shì)菌，用于后續(xù)抗性實(shí)驗(yàn).將分離純化后得到的單菌落制片后用革蘭氏染色液染色后用100×顯微鏡鏡檢，拍照并描述菌株特征.

1.3.2 菌株交叉抗性實(shí)驗(yàn)

將4 種抗生素3 種重金屬，兩兩混勻，共12 組，重金屬和抗生素的交叉組合見(jiàn)表1.在試驗(yàn)培養(yǎng)基冷卻至60 ℃時(shí)，加入試驗(yàn)培養(yǎng)基中，搖勻后倒板.將篩選后以斜面培養(yǎng)基保存的菌株挑菌后重懸，菌液分別涂布在不同雙抗板上，培養(yǎng)1～2 d，觀察菌株的生長(zhǎng)情況，篩選出雙抗菌株，記錄抗性結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

2.1 養(yǎng)豬廢水中優(yōu)勢(shì)菌的篩選結(jié)果

用養(yǎng)豬廢水選擇試驗(yàn)培養(yǎng)基分離出優(yōu)勢(shì)菌共有10種，菌落特征見(jiàn)表2.對(duì)這10株菌進(jìn)行革蘭氏染色后，在100×生物顯微鏡下觀察到鏡檢圖片如圖1 所示.根據(jù)圖1觀察分析可知，分離得到的這10株優(yōu)勢(shì)菌均為細(xì)菌，其中6 株為革蘭氏陰性菌，4 株為革蘭氏陽(yáng)性菌；4株為球狀菌，6株為桿狀菌.顏色呈現(xiàn)白色、黃色和橙紅色.

2.2 交叉抗性菌株的篩選結(jié)果

由表3可見(jiàn)，10株優(yōu)勢(shì)菌中，除了10#菌株，其他9種菌株均有不同的重金屬和抗生素交叉抗性.7#菌株能在11種交叉抗性板上生長(zhǎng)，是交叉抗性最多的菌；1#、3#、4#、5#、8#、9#菌株有3種及以上的交叉抗性；2#和6#菌株僅具有1種交叉抗性.抗鹽酸四環(huán)素的菌株有7 種：1#、3#、4#、5#、7#、8#、9#；抗磺胺二甲嘧啶的菌株有5種：1#、3#、7#、8#、9#；抗紅霉素的菌株有3 種：3#、7#、9#；抗桿菌肽鋅的菌株有9 種：1#-9#.抗NaAsO2的菌株有6種：1#、2#、4#、5#、7#、8#；抗CuCl2和ZnSO4·7H2O 的菌株一樣，都是7 種：1#、3#、4#、5#、7#、8#、9#.

表2 養(yǎng)豬廢水中優(yōu)勢(shì)菌菌落特征Tab.2 Colonial morphology of dominant bacteria in swine farm effluent

10株養(yǎng)殖廢水優(yōu)勢(shì)菌中大多數(shù)菌株對(duì)鹽酸四環(huán)素、磺胺二甲嘧啶、桿菌肽鋅、NaAsO2、CuCl2、ZnSO4·7H2O產(chǎn)生抗性.不同菌株對(duì)抗生素和重金屬表現(xiàn)出不同的抗性.篩選到的10 種優(yōu)勢(shì)菌中，G-菌占60%，這與王曉濤等[14]研究臨床分離的抗生素抗性菌革蘭氏染色結(jié)果相似，G-菌比G+菌比例高.在抗性細(xì)菌中，G-菌比例偏高的原因可能跟細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有關(guān)，G-菌比G+菌具有更廣泛的抗性，抵抗多種重金屬和抗生素交叉.G-菌的細(xì)胞壁上有許多脂多糖，脂多糖跟細(xì)胞的免疫反應(yīng)有關(guān)，當(dāng)外界有抗生素或重金屬等脅迫時(shí)，菌群中G-菌被選擇所占比例變多.由此可見(jiàn)，采樣的?？谑薪寄仇B(yǎng)殖場(chǎng)已經(jīng)長(zhǎng)期存在不合理的濫用抗生素和重金屬.

圖1 10株優(yōu)勢(shì)菌的鏡檢照片（×100倍）Fig.1 Photomicrography of 10 dominant strains(×100)

表3 養(yǎng)豬廢水中優(yōu)勢(shì)菌的交叉抗性Tab.3 Cross-resistance of dominants bacteria in swine farm effluent

3 結(jié)論

從養(yǎng)豬場(chǎng)廢水中篩選得到10種優(yōu)勢(shì)菌株，這10株菌株對(duì)該養(yǎng)豬廢水環(huán)境適應(yīng)，G-菌占菌群的60%，具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和抵抗性.不同菌株表現(xiàn)出對(duì)不同抗生素和重金屬的交叉抗性.其中7#菌株能在11種抗生素和重金屬的交叉組合污染下正常生長(zhǎng)，是交叉抗性最強(qiáng)的菌；10 株養(yǎng)豬廢水優(yōu)勢(shì)菌中大多數(shù)菌株對(duì)鹽酸四環(huán)素、磺胺二甲嘧啶、桿菌肽鋅、Na?AsO2、CuCl2、ZnSO4·7H2O產(chǎn)生抗性，這些都是養(yǎng)豬飼料中最常用的添加劑，而相對(duì)少用的紅霉素，其抗性菌也較少.說(shuō)明微生物長(zhǎng)期處于這些抗生素和重金屬環(huán)境脅迫下已經(jīng)產(chǎn)生了適應(yīng)和微進(jìn)化，也反映出養(yǎng)豬業(yè)濫用抗生素和重金屬所帶來(lái)的嚴(yán)重生態(tài)影響，必須引起人們的高度重視.

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