德化黑雞線粒體DNA控制區(qū)全序列測定及起源研究

賈曉旭　陸俊賢　唐修君　顧榮　葛慶聯(lián)　高玉時

摘要：根據(jù)紅色原雞基因組DNA序列設計引物，獲得了德化黑雞線粒體DNA D-loop區(qū)全序列，結(jié)合GenBank已經(jīng)測出Dloop區(qū)全序列的紅色原雞序列，探討了德化黑雞的母系起源。結(jié)果表明，德化黑雞線粒體DNA D-loop區(qū)全長1 231 bp，T、C、A、G 平均含量分別為33.5%、26.5%、26.7%、13.3%。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，德化黑雞與紅色原雞滇南亞種（Gallus gallus spadiceus）聚為一類，推測德化黑雞可能起源于云南省或者附近的紅色原雞滇南亞種。

關鍵詞：德化黑雞；線粒體DNA；D-loop區(qū)；系統(tǒng)發(fā)育關系

中圖分類號： S831.2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0031-02

我國烏骨雞遺傳資源豐富。德化黑雞因原產(chǎn)自福建省德化縣而得名，是我國珍稀的烏骨雞地方品種之一，具有適應性強、肉質(zhì)細嫩、清香甘潤、味道鮮美、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點，以其黑皮、黑肉、黑骨、黑內(nèi)臟等烏色性狀深受當?shù)厝罕娤矏踇1-2]。線粒體Dloop 區(qū)序列是親緣關系較近的群體進行遺傳分化研究的理想分子標記，已被廣泛用于家禽起源與進化、群體遺傳結(jié)構(gòu)、品種間的系統(tǒng)發(fā)育關系等研究中[3]。線粒體 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA） 是動物核外的遺傳物質(zhì)，具有母系單倍體遺傳特性、在世代傳遞過程中不發(fā)生 DNA 重組、較核 DNA 突變率高及進化速率快等優(yōu)點，根據(jù)其序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹能很好地反映物種的母系遷徙歷史。利用 mtDNA 序列差異研究物種的起源和進化，有助于了解物種的馴化經(jīng)歷[4-6]。mtDNA 控制區(qū) （D-loop 區(qū)） 的進化速率較其他區(qū)域高 5 ～10 倍。德化黑雞飼養(yǎng)歷史悠久，了解其自然群體的遺傳結(jié)構(gòu)及其遺傳多樣性狀況有助于有效保種并選育利用德化黑雞。筆者測定了德化黑雞線粒體DNA D-loop區(qū)的全序列，并結(jié)合GenBank已經(jīng)測出線粒體D-loop區(qū)全序列的紅色原雞的序列，從分子水平上探討了德化黑雞的起源，旨在為開發(fā)利用德化黑雞資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

5羽德化黑雞均采集于德化縣，翅靜脈采血，ACD抗凝，采用常規(guī)的酚/氯仿法提取血液基因組DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。選取紅色原雞5個亞種Gallus gallus bankiva（NC007237）、 Gallus gallus gallus（AB007725、NC007236）、Gallus gallus murghi（HE793430、GU261707～ GU261709）、Gallus gallus jabouillei（GU261674、GU261696）、Gallus gallus spadiceus （NC007235、GU261690、GU261692、GU261693、GU261695、GU261702～GU261704、GU261706、GU261716）等已經(jīng)測出線粒體DNA D-loop區(qū)全序列的19條序列，從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載其線粒體DNA D-loop區(qū)全序列，與德化黑雞進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 根據(jù)紅色原雞線粒體基因組的已知DNA序列（GenBank序列號：NC_007235）作為參考序列，在D-loop區(qū)上游、下游用Primer Premier 5.0軟件設計1對引物，引物序列分別為：PF：5′-AAACACCCAAACTCACTAAC-3′；PR：5′-CACTGGGATGCGGATACTTGC-3′。預計擴增長度1 600 bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 PCR擴增和測序 PCR擴增體系（50 μL）：25 μL PCRMix（南京博爾迪公司），10 μmol/L引物各1.5 μL，模板 2 μL，滅菌水20 μL。反應程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán)；72 ℃ 4 min。1.5%低熔點瓊脂糖（Promega公司）凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，用試劑盒回收純化，交由上海英駿生物技術(shù)有限公司進行測序。所有序列采用雙向測序，以便比對核實。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理和分析 將得到的序列與 GenBank 中紅色原雞參考序列進行比對，剪掉引物及多余的序列，DNA 序列片段經(jīng) DNAStar 5.02 軟件的SeqMan程序拼接。用 MEGA 4.0 進行轉(zhuǎn)換與顛換數(shù)目的統(tǒng)計和堿基組成分析，采用鄰接法（Neighbor-Jointing，NJ） 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)育樹選用 Kimura 2 模型，1 000 次重復[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 德化黑雞mtDNA D-loop區(qū) PCR擴增

對德化黑雞DNA模板進行PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明1 600 bp左右有1條特異性條帶，與預期結(jié)果一致（圖1）。

2.2 德化黑雞線粒體DNA D-loop區(qū)序列分析

設計的引物在德化黑雞基因組中得到了較好的擴增，將測序結(jié)果剪掉引物及多余的序列，發(fā)現(xiàn)5羽德化黑雞個體序列相同，沒有發(fā)現(xiàn)堿基突變，長度為1 231 bp，T、C、A、G 4種堿基含量分別為33.5%、26.5%、26.7%、13.3%，其中A+T

含量（60.3%）明顯高于G+C含量（39.7%），線粒體DNA D-loop區(qū)為非編碼區(qū)，富集A/T堿基，能被RNA聚合酶等特異分子識別，從而作為轉(zhuǎn)錄的起始序列。與參考序列相NC007235比較（圖2），德化黑雞共發(fā)現(xiàn)8處多態(tài)位點，變異區(qū)在167～215 bp之間，全部為轉(zhuǎn)換，其中T-C轉(zhuǎn)換5處，A-G轉(zhuǎn)換3處。

2.3 德化黑雞與原雞系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)德化黑雞線粒體DNA D-loop區(qū)全序列，采用NJ法構(gòu)建了德化黑雞與原雞的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。德化黑雞先與原雞滇南亞種GGS7聚為一類，節(jié)點的自舉置信度（BP）值為95%；然后與原雞滇南亞種GGS1、 GGS4聚為一類，節(jié)點的自舉置信度（BP）值為76%；最后與原雞海南亞種（GGJ1、GGJ2）聚為一類，節(jié)點的自舉置信度（BP）值為51%。根據(jù)GenBank上的信息，GGS7（GU261695）樣本采自云南省，GGS4（GU261704）樣本采集于緬甸。

3 結(jié)論與討論

國內(nèi)外有關雞mtDNA D-loop區(qū)的研究大都集中在高變區(qū)[8-10]，區(qū)域較小，得到的信息可能不全面。德化黑雞D-loop區(qū)全序列同參考序列相比，686、1 215 bp處存在堿基轉(zhuǎn)換。因此筆者認為，用mtDNA D-loop區(qū)全序列進行遺傳多樣性、起源進化分析更為準確。本研究發(fā)現(xiàn)，5羽德化黑雞個體序列相同，沒有發(fā)現(xiàn)堿基突變，可能與樣本量少有關，也可能因為德化黑雞是較封閉的原始雞種，未受其他外來雞種的侵入，因而變異程度較低。線粒體DNA在遺傳過程中，遺傳物質(zhì)通過卵細胞質(zhì)傳遞，較少發(fā)生DNA 重組，其野生祖先的線粒體DNA 類型一般能得以保持。這種遺傳方式，1個個體就能代表1個母性集團，因此只需少量個體樣本便能反映1個群體的遺傳結(jié)構(gòu)。研究者可以從復雜的遺傳背景中分辨不連續(xù)的母系血統(tǒng)，即使經(jīng)過幾千年的雜交繁育，系統(tǒng)關系依然明晰[11]。德化黑雞先與原雞滇南亞種GGS7（GU261695）聚為一類，然后與GS1 （NC_007235）、GGS4（GU261704聚為為一類，說明原雞滇南亞種（Gallus gallus spadiceus）在德化黑雞形成過程貢獻最大，最后與原雞海南亞種（GGJ1、GGJ2）聚為一類，說明原雞海南亞種與德化黑雞親緣關系也較近。參照Liu等對線粒體DNA D-loop區(qū)單倍型劃分標準，德化黑雞應屬于A分支[8]。章學東等研究發(fā)現(xiàn)，東鄉(xiāng)綠殼蛋雞也是以A分支為主，說明兩者關系較近，從形態(tài)學上，兩者個體多為黑羽、烏膚、烏冠，并且都有紅冠個體，也驗證了兩者親緣關系較近，在地理位置上，福建省和江西省毗鄰，推測可能兩者存在基因交流[12]。

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