一種快速提取絲核菌(Rhizoctonia spp.)DNA的方法

張正禹，包文靜，岳蕊，楊根華(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650201)

絲核菌(Rhizoctonia spp.)常以菌絲或菌核的形態(tài)習(xí)居于土壤中，不產(chǎn)生任何無性孢子，在自然界中廣泛存在于土壤及各種不同類型的寄主植物上，許多類群屬于植物病原真菌，能侵染多種植物如水稻、玉米、大麥、小麥、大豆等引起嚴(yán)重的病害［1］。該類真菌種類繁多，根據(jù)營養(yǎng)菌絲隔膜的結(jié)構(gòu)，絲核菌可分成兩類:子囊絲核菌和擔(dān)子絲核菌(Ceratobasidium spp.);根據(jù)細(xì)胞核數(shù)量多少，擔(dān)子絲核菌又分為雙核和多核絲核菌;在擔(dān)子絲核菌中最有用的分類依據(jù)是菌絲融合群和 5.8S rDNA-ITS 序列［2－4］。

有關(guān)絲核菌DNA的提取，國內(nèi)外普遍采用CTAB提取法［5］和基因組 DNA 提取試劑盒法［6－8］，這幾種方法共同缺點(diǎn)是需要大量菌體，操作步驟麻煩，需要耗費(fèi)大量的時(shí)間，效率較低，且在DNA提取過程中需要加入酚、氯仿、異戊醇等有機(jī)溶劑，這些有機(jī)溶劑大部分為有毒試劑，對實(shí)驗(yàn)人員健康有害，也會(huì)污染周邊環(huán)境，同時(shí)提取試劑或試劑盒的價(jià)格昂貴，也增加了DNA提取成本。因此，探索一種快捷、安全、有效的DNA提取方法，用于絲核菌菌株大規(guī)模的分類鑒定及分子檢測顯得非常必要。

為建立一套快捷、安全、有效的絲核菌菌株DNA提取方法。筆者采用Chelex-100法提取絲核菌菌株DNA擴(kuò)增5.8S rDNA-ITS序列，以期得到整齊、明亮、清晰和專一性強(qiáng)、產(chǎn)量高的PCR條帶，為快捷、有效地對絲核菌菌株的大規(guī)模分類鑒定和分子檢測奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 菌株:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存絲核菌菌株12株。雙核絲核菌菌株:J-4，X-4-3-1，J-25，X-4-6-1，BN-J-1，BN-J-2，BN-J-4，BNJ-5，BN-J-7，BN-J-8，BN-J-9;多核絲核菌菌株:BN-J-3。

試劑與儀器:Chelex-100、2 ×Power Taq PCR Master Mix，昆明碩陽生物科技有限公司。引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')、ITS4(5'-TCCTCGCTTATTGATATGC-3')［9］，由上海生工生物工程有限公司合成。EDC-810型PCR儀，東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

馬鈴薯瓊脂(PDA)培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，補(bǔ)充蒸餾水至1 000 ml，pH自然，121℃高壓蒸汽滅菌30 min。

5%(W/V)Chelex-100 溶液:Chelex-100 5 g，ddH2O 100 ml，pH 7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，4 ℃保存。

1.2 方法 基因組DNA的提取采用Chelex-100法:用無菌竹簽從PDA培養(yǎng)基上挑取少量菌絲放入裝有50 μl 5%(W/V)菌Chelex-100溶液(pH 7.0)的PCR管中，在旋渦混合器上振蕩5 s，EDC-810型PCR儀中94℃加熱10 min，自然條件下冷卻至室溫后，12 000 r/min離心1 min。上清即為PCR模板，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5.8 S rDNA-ITS片段擴(kuò)增:將Chelex-100法提取的基因組DNA作為PCR擴(kuò)增模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 25 μl包括:1 μl DNA 模板，12.5 μl 2 × Power Taq PCR Master Mix 溶液，正、反向引物各 1 μl(10 μmol/L)，ddH2O 9.5 μl。反應(yīng)在EDC-810型PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性1 min，51℃退火1 min，72℃延伸1 min，35次循環(huán);最后72℃延伸10 min。取5 μl PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠120 V電泳40 min，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察PCR條帶質(zhì)量并拍照。

2 結(jié)果與分析

結(jié)果表明，所有雙核、多核絲核菌菌株采用Chelex-100法提取的基因組DNA，以其作為PCR擴(kuò)增模板，都能夠有效地?cái)U(kuò)增出5.8S rDNA-ITS序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳檢測，條帶整齊、清晰、明亮，專一性強(qiáng)，產(chǎn)量大，無雜帶，目的片段大小約700 bp(圖1)，可以直接用于測序分析，符合預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果。PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測序，結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物均能滿足測序要求，且無雜合或者高級(jí)結(jié)構(gòu)，都能夠得到正確的序列，測序結(jié)果較為理想。

圖1 供試菌株5.8S rDNA-ITS區(qū)段PCR擴(kuò)增結(jié)果

3 結(jié)論與討論

Chelex-100是一種化學(xué)螯合樹脂，能夠螯合多價(jià)離子，特別是對高價(jià)的金屬離子具有很高的親和力和螯合作用;在低離子強(qiáng)度、堿性以及煮沸的條件下，能夠使細(xì)胞膜破裂，蛋白質(zhì)變性，有效地除去非核酸類有機(jī)物，通過離心去除Chelex-100顆粒，使DNA與其結(jié)合的物質(zhì)分離。Chelex-100法廣泛應(yīng)用于細(xì)菌DNA提?。?0］，放線菌DNA 提?。?1］，血痕或全血DNA 提?。?2－13］，動(dòng)物源飼料 DNA 提取［14］，植物轉(zhuǎn)基因檢測模板DNA的制備［15］以及薯蕷植物炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)和枯萎病菌(Fusarium oxysporum)的DNA提取［16］等領(lǐng)域。關(guān)于Chelex-100法提取絲核菌菌株的DNA尚未見報(bào)道。

該研究采用Chelex-100法提取的絲核菌DNA能夠直接用于5.8S rDNA-ITS序列PCR擴(kuò)增模板，電泳條帶整齊、明亮、清晰，無雜帶，產(chǎn)量大，符合測序要求，測序結(jié)果準(zhǔn)確;具有快速簡便、省時(shí)省力和經(jīng)濟(jì)高效的特點(diǎn)，在絲核菌的快速分類鑒定和分子檢測方面具有重要意義。

［1］黃江華，楊媚，周而勛，等.絲核菌研究進(jìn)展［J］.仲凱農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，15(1):61 －67.

［2］YANG G H，CONNER R L，CHEN Y Y.First report of damping-off of Swiss chard caused by Rhizoctonia solani AG-4 HG I and binucleate Rhizoctonia AG-A in China［J］.Plant Disease，2007，91(11):1516.

［3］YANG G H，NAITO S，DONG W H.Identification and pathogenicity of Rhizoctonia spp.causing wirestem of Betula nigra in China［J］.Journal of Phytopathology，2006，154(2):80 －83.

［4］SHARON M，KUNINAGA S，HYAKUMACHI M，et al.Classification of Rhizoctonia spp.using rDNA-ITS sequence analysis supports the genetic basis of the classical anastomosis grouping［J］.Mycoscience，2008，49(2):93–114.

［5］郭良.豆類絲核菌的分離鑒定及苦馬豆素的提取［D］.楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

［6］郭英鵬.我國部分地區(qū)禾谷絲核菌的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析及其定量檢測［D］.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

［7］HUA G K H，BERTIER L，SOLTANINEJAD S，et al.Cropping systems and cultural practices deter mine the Rhizoctonia anastomosis groups associated with Brassica spp.in Vietnam［J］.PLoS ONE，2014，9(11):111750.

［8］PENTON C R，GUPTA V V S R，TIEDJE J M，et al.Fungal community structure in disease suppressive soils assessed by 28S LSU gene sequencing［J］.PLoS ONE，2014，9(4):93893.

［9］曹永軍，程萍，喻國輝，等.利用ITS1和ITS4通用引物擴(kuò)增香蕉枯萎病菌核酸片段鑒定其生理小種［J］.熱帶作物學(xué)報(bào)，2010，31(7):1098－1102.

［10］錢雪琴，張軍，沈芳.Chelex-100法和堿性裂解法提取細(xì)菌DNA的比較［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18(8):1565 －1566.

［11］周雙清，黃小龍，黃東益，等.Chelex-100快速提取放線菌DNA作為PCR 擴(kuò)增模板［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2010(2):123－125.

［12］戴文申，徐銀龍，葉健，等.溫度對Chelex 100法提取血斑DNA的影響［J］.新疆警官高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2007，27(1):34 －38.

［13］周月琴，朱偉，劉志萍，等.用Chelex-100快速提取微量血痕中的DNA［J］.復(fù)旦學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2003，30(4):379 －380.

［14］趙秀玲，文偉剛，余旭平，等.Chelex-100快速提取動(dòng)物源飼料DNA方法的建立［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)科學(xué)版，2004，22(1):82 －85.

［15］王永，張莉，蘭青闊，等.Chelex-100快速提取用于轉(zhuǎn)基因檢測DNA模板的研究［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2008(2):143－145.

［16］陳吉良，黃小龍，吳安迪，等.一種快速高效提取病原真菌DNA作為PCR 模板的方法［J］.菌物學(xué)報(bào)，2011，30(1):147－149.