腦創(chuàng)傷模型大鼠腦組織中SBDP145和SBDP120的水平測定

黃 銳

湖北襄陽市中醫(yī)院神經(jīng)外科 襄陽 441000

腦創(chuàng)傷模型大鼠腦組織中SBDP145和SBDP120的水平測定

黃 銳

湖北襄陽市中醫(yī)院神經(jīng)外科 襄陽 441000

目的 檢測大鼠重型顱腦損傷模型腦組織中SBDP140和SBDP120濃度，分析其在創(chuàng)傷急性期釋放趨勢。方法

創(chuàng)傷性腦損傷；SBDPS

αII-spectrin大量存在于在神經(jīng)元的軸突和突觸前末梢，能夠被calpain分解為SBDP150和SBDP145，被caspase-3分解為SBDP120。由于calpain和caspase-3是腦缺血和腦損傷發(fā)生時促進細胞凋亡壞死的重要因子［1］，因此SBDPS（αII-spectrin break down Products）可能與顱腦損傷造成的腦細胞損害存在著聯(lián)系，可以成為一種腦損傷的標志物。本研究檢測了大鼠重型顱腦損傷CSF中SBDP145和SBDP120濃度，分析其在創(chuàng)傷急性期釋放趨勢。

1 資料和方法

1.1 實驗動物及分組 健康成年雄性SD大鼠70只（湖北省實驗動物中心提供），體質量250～300g，隨機分為對照組（假手術組）10只，實驗組（重型腦損傷組）60只。

1.2 大鼠腦挫裂傷模型制作方法 以氯胺酮按照60mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠后，大鼠腦立體定位儀固定大鼠頭部，剪去頂部皮毛，消毒皮膚后，正中切開頂部頭皮，剝離骨膜顯露左頂骨，于中線左側旁開約3mm，前囪后約2mm處用開直徑5mm圓形骨窗，保持硬膜完整。采用自由落體打擊裝置，以40g砝碼于25cm高處通過金屬導桿落下，撞擊置于硬腦膜上的圓錐上致重型腦挫裂傷，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮。

1.3 標本制備 分別于模型制作成功后6h、12h、24h、48 h、72h、120h迅速斷頭處死小鼠，各時間點處死10只，制備腦組織勻漿，取挫傷的大腦組織（去除小腦和延髓部分），稱重后移入玻璃勻漿管中，加入9倍體積的預冷生理鹽水，4℃條件下充分研碎勻漿，制備10％勻漿，離心機4 000rpm離心10min，取上清液，-80℃凍儲存。

1.4 檢測方法 所有標本均采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定分析方法ELSISA的方法進行檢測，用抗大鼠SBDP145、SBDP120單抗分別包被于酶標板上，標準品和樣品中的SBDP145、SBDP120與單抗結合，加入生物素化的抗人SBDP145、SBDP120形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液，在450nm處測OD值，SBDP145、SBDP120濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中SBDP145、SBDP120濃度。

1.5 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)分析均使用SPSS 17.0，計量資料以均數(shù)±標準差表示，比較Mann-Whitney檢驗，2組或3組間的數(shù)值比較采用Kruskal-Wallis檢驗，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

本次研究共包括60只重型顱腦損傷大鼠模型作為實驗組，10只假手術模型作為對照組，實驗組所有患者SBDP145 和SBDP120的平均濃度明顯高于對照組（P＜0.05）（表1）。SBDP145的釋放方式明顯不同于SBDP120，SBDP145在傷后6h就能夠檢測到明顯的變化，而SBDP120在傷后在其變化不明顯，直到到傷后72h達到峰值（圖1）。

表1 實驗組各時間點和對照組SBDP145和SBDP120的濃度比較（ng/mL）

圖1 實驗組各時間點和對照組SBDP145 和SBDP120的濃度曲線

3 討論

目前，在創(chuàng)傷性腦損傷發(fā)生早期對創(chuàng)傷的嚴重性和預后進行預測，仍沒有十分確切的辦法，臨床中經(jīng)常應用的一些措施如GCS評分等，雖然應用多年，且經(jīng)過很多臨床試驗的研究檢驗，但仍有一些局限性。近年來，幾種膠質細胞或神經(jīng)元合成的蛋白被認為可以作為中樞神經(jīng)細胞損傷的標記物，但沒有臨床應用的充分證據(jù)，這些標志物如NSE、S100、UCH-L1等，NSE被認為可以用來評估腦細胞的損害，但代謝時間較長，難以評估原發(fā)性損傷的程度，且難以區(qū)分原發(fā)性和繼發(fā)性損傷，且受到血細胞溶血的影響。S100研究較充分，并且與GCS評分和神經(jīng)影像學表現(xiàn)相關性較高，然而其特異性不高，當其他部位出現(xiàn)損傷時其表達仍然增多［2］。最近的研究表明UCH-L1在重型顱腦損傷患者的CSF中濃度明顯增高，而且與腦損傷程度GCS、CT、6周內(nèi)的致死率有相關［3］。

許多研究者認為出現(xiàn)創(chuàng)傷性腦損傷時，SBDPS可以作為一種潛在的標志物，Brophy等人［6］進行了腦脊液的動力學分析，認為在創(chuàng)傷性腦損傷急性期與caspase-3相比calpain介導的細胞凋亡可能起更重要的作用。因此SBDPS不僅在腦損傷程度方面能夠提供重要的信息，而且能夠解釋腦細胞凋亡壞死相關的病理損傷機制，本次研究通過ELISA的方法進一步證實在創(chuàng)傷性腦損傷的病理變化過程中，calpain和caspase-3介導的蛋白水解作用其重要的作用，而且SBDPS表現(xiàn)的表達水平持續(xù)的增高的現(xiàn)象對腦損傷的程度的評估有很大的幫助。Farkas等人的研究中［4］，發(fā)現(xiàn)腦脊液中的SBDPS的濃度在腦外傷患者中明顯高于對照組，Pineda等［1］的研究也發(fā)現(xiàn)在腦脊液中SBDP145的釋放形式不同于SBDP120，在我們的研究中，SBDP145的最大峰值出現(xiàn)在傷后6 h，而持續(xù)時間長，降低緩慢，直到傷后5d，而SBDP120則在傷后的濃度變化較慢，在傷后3d到達峰值，這種現(xiàn)象意味著，在傷后5d內(nèi)細胞凋亡和壞死的機制以不同的形式被激活。αII-spectrin大量存在于軸突和突觸前末梢，而軸突是容易受到機械性損傷的影響，McCracken等的研究表明［5］，在創(chuàng)傷性腦損傷的患者中，傷后軸突的遲發(fā)性損害可能是由于蛋白水解酶介導的細胞結構的破壞，盡管一定數(shù)量的軸索在創(chuàng)傷發(fā)生時已經(jīng)斷離（原發(fā)性損傷），但更多的損傷是有繼發(fā)性損害造成的，而且是不可逆的。另外的一些學者認為，這種軸突神經(jīng)傳導作用的改變能夠導至一些酶類如calpain和caspase-3的釋放，而這種改變進一步促進軸突細胞結構的破壞［6］，因此SBDPS也許能夠作為一種軸突損害程度的標志物?？傊?，腦組織中的SBDPS與創(chuàng)傷性腦損傷后有明顯的變化，隨著研究的不斷深入，SBDPS可能成為一種對創(chuàng)傷性腦損傷有臨床應用價值的標志物。

［1］Pineda JA，Lewis SB，Valadka，et al.Clinical significance of alphaII-spectrin break down products in cerebrospinal fluid after severe traumatic brain injury［J］.J Neurotrauma，2007，24（3）：354-366.

［2］Papa L，Robinson G，Oli M，et al.Use of biomarkers for diagnosis and management of traumatic brain injury［J］.Expert Opin Med Diagn，2008，28（7）：1-9.

［3］Papa L，Akinyi，Liu MC，et al.Ubiquitin C-terminal hydrolase is a novel biomarker in humans for severe traumatic brain injury ［J］.Crit Care Med，2009，38（12）：138-144.

［4］Farkas O，Polgar B，Szekeres-Bartho，et al.Spectrin break down products in the cerebrospinal fluid in severe head injury-preliminary observations［J］.Acta Neurochir Wien，2005，1 478（4）：855-861.

［5］McCracken E，Hunter AJ，Patel S，et al.Calpain activation and cytoskeletal protein break down in the corpus callosum of headinjured patients［J］.J Neurotrauma，1999，169（3）：749-761.

［6］Povlishock JT，Christman CWJ.The pathobiology of traumatically induced axonal injury in animals and humans：a review of current thoughts［J］.Neurotrauma，1995，124（9）：555-564.

（收稿2014-07-23）

R-332

B

1673-5110（2015）10-0068-02

隨機將70只成年雄性SD大鼠分為對照組（假手術組）10只，重型腦損傷組60只，于模型制作成功后處死小鼠，制備腦組織勻漿，所有標本均采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定分析方法進行檢測SBDPS的濃度。結果 SBDP145和SBDP120濃度，在不同的時間點上實驗組明顯高于對照組，SBDP145在傷后6h就能夠檢測到明顯變化，而SBDP120直到到傷后72h才有明顯的升高。結論 創(chuàng)傷性腦損傷腦組織中的SBDPS與腦損傷的嚴重性有關。