十字花科根腫病研究進(jìn)展

索 歡，陳龍正，徐 海，宋 波，樊小雪，袁希漢，何長(zhǎng)征

(1．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128;2．江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，江蘇南京 210014)

十字花科作物根腫病是一種世界性病害，所有十字花科作物的感病品種都能被侵染。該病最早發(fā)現(xiàn)于地中海兩岸和歐洲南部，目前很多國(guó)家都有發(fā)生，特別是溫帶地區(qū)［1］。根腫病菌主要危害十字花科作物，尤其是具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的蕓薹屬蔬菜作物，包括白菜、甘藍(lán)、油菜、青菜、抱子芥、莖瘤芥(榨菜)、蘿卜和蕪菁等，人工接種也可侵染非十字花科植物［2］。近年來，隨著全球氣候的逐年變暖、土壤酸化程度的增加以及我國(guó)人們生活水平的提高，人類對(duì)蔬菜消費(fèi)的需求量逐年增加，十字花科作物栽培面積不斷擴(kuò)大，種植基地蔬菜生產(chǎn)輪作年限增加，南北菜和種子的相互調(diào)運(yùn)使得十字花科作物根腫病發(fā)生面積迅速擴(kuò)大，危害程度也是逐年加重，根腫病已成為十字花科作物的重要病害之一。筆者概述了國(guó)內(nèi)外十字花科作物根腫病研究進(jìn)展，以期為我國(guó)根腫病研究提供借鑒。

1 根腫病的危害

十字花科作物根腫菌是一種土傳病害，其致病菌為蕓薹根腫菌(Plasmodiophora brassicae Woron)，根腫菌的病原菌抗逆性強(qiáng)，以休眠孢子在土壤中越冬越夏。土壤的含菌量影響著發(fā)病的嚴(yán)重程度，而休眠孢子的萌發(fā)程度直接關(guān)系著該病的發(fā)生及流行，萌發(fā)條件決定著萌發(fā)程度。田間一旦受到根腫菌的污染，將會(huì)長(zhǎng)期帶菌，不再適合種植十字花科植物，嚴(yán)重威脅其可持續(xù)生產(chǎn)［3］。十字花科作物的整個(gè)生育期都能發(fā)病，且受侵害越早發(fā)病越重。發(fā)病初期病癥不明顯，也不易被檢測(cè)，但隨著受害根部腫瘤的膨大，病株生長(zhǎng)變得遲緩，葉片萎垂淡綠，基部葉片或葉片邊緣褪綠變黃變干，嚴(yán)重者整株枯死。我國(guó)目前根腫病常年危害面積為320萬～400萬hm2，占十字花科作物種植面積的30%以上，在大流行年份，根腫病發(fā)生和危害面積更是達(dá)到900萬hm2，平均產(chǎn)量損失為20% ～30%，嚴(yán)重田塊直接產(chǎn)量損失可達(dá)60%以上［4］。

2 十字花科根腫病病原菌

2．1 根腫菌病原菌分類 對(duì)于根腫菌的分類一直存在分歧。1995年以前，普遍認(rèn)為該菌屬鞭毛菌亞門根腫菌屬(學(xué)名)［5］。但因?yàn)楸廾鷣嗛T的生活史不存在原生質(zhì)團(tuán)階段，而根腫菌生活史中存在原生質(zhì)團(tuán)階段，Ainswort在1995年將該病原菌劃分為原生動(dòng)物界根腫菌門根腫菌屬蕓苔根腫菌(學(xué)名)［6］。

2．2 根腫菌的致病性分化 Honig［7］首次證明了根腫菌存在小種分化。目前通用的根腫菌鑒別體系為Williams法和ECD歐洲鑒別寄主法。Williams法是根據(jù)Jersey Queen、Badger Shipper、Laurentian和Wilhelmsburger 4種十字花科植物品種受根腫菌侵染后的反應(yīng)類型制定的一種鑒定根腫菌生理小種的方法。沈向群等［8］用Williams法對(duì)我國(guó)根腫菌進(jìn)行鑒定，認(rèn)為4號(hào)是優(yōu)勢(shì)生理小種，主要分布于平原大白菜主產(chǎn)區(qū)。根腫菌研究者們利用ECD法，在全世界已鑒定出24個(gè)根腫菌生理小種，同時(shí)認(rèn)為我國(guó)至少分為能夠侵染甘藍(lán)和與不侵染甘藍(lán)2個(gè)生理小種;我國(guó)臺(tái)灣已鑒定出2個(gè)生理小種，分別為ECD16/0/0和ECD 16/0/31菌系。Jone等［9］進(jìn)行單孢接種后，利用ECD法獲得4個(gè)生理小種，且已經(jīng)成功將該4個(gè)已知基因型的根腫菌用于抗病育種。

2．3 根腫菌的生物學(xué)特征 根腫菌在土壤中以休眠孢子存活，在寄主根部腫大細(xì)胞內(nèi)以休眠孢子囊存在，孢子囊密集在一起呈淡黃色;魚卵塊狀或者球形，比較疏松，受擠壓分散。單胞無色或略帶灰色，且膜壁不光滑。不同寄主根腫病菌的休眠孢子和游動(dòng)孢子的大小也不同。研究報(bào)道，油菜根腫菌休眠孢子直徑為1．90 ～4．30 μm(平均 3．50 μm)，游動(dòng)孢子大小為 1．60 ～3．80 μm(平均 2．80 μm)［10］;甘藍(lán)根腫菌休眠孢子直徑為2．10 ～3．10 μm(平均 2．50 μm)，游動(dòng)孢子大小為 1．60 ～3．60 μm［11］;莖瘤芥根腫菌休眠孢子囊直徑為2．10 ～2．60 μm，游動(dòng)孢子大小為 3．50 μm［12］。休眠孢子最適萌發(fā)溫度為24．0 ℃，4．0 ～40．0 ℃范圍內(nèi)均可萌發(fā)［10］;土壤含水量在45% ～98%都可發(fā)病，70% ～90%時(shí)發(fā)病較重，最適pH范圍為5．4 ～6．7，致死溫度為45．0 ℃［11］，也有研究報(bào)道其致死溫度為48．0℃［10］，可能是因?yàn)椴煌闹鞯牟【嬖诓町?。根腫病發(fā)生的土壤溫度為10．0～30．0℃，最適土溫為19．0～25．0℃。寄主根組織腐爛促進(jìn)休眠孢子萌發(fā)［13］。Friberg等［14］報(bào)道非寄主黑麥草的根部組織分泌物比寄主根部組織分泌物更能促進(jìn)休眠孢子萌發(fā)。

2．4 根腫菌的侵染方式 根腫菌以休眠孢子的形式殘存土中，休眠孢子壁裂開后釋放出1個(gè)游動(dòng)孢子，一段時(shí)間后游動(dòng)孢子鞭毛脫落且囊化形成休止孢，圓形的休止孢大小為1.10 ～1．60 μm(平均為 1．32 μm)，游動(dòng)孢子在囊化時(shí)還發(fā)育出1 個(gè)管腔(長(zhǎng)管狀空腔，長(zhǎng)為 2．10 ～2．50 μm，寬為 0．90～1．00 μm)［10］。殘留土中的休眠孢子數(shù)量是影響其發(fā)病程度的重要因素，休眠孢子萌發(fā)的條件與病害發(fā)生程度密切相關(guān)。根腫菌從植株根毛或根部傷口處侵入，并借助于灌溉水、雨水、昆蟲的活動(dòng)、農(nóng)事操作等方式近距離傳播。通常帶病植株的調(diào)運(yùn)和帶菌種子以及帶菌泥土的轉(zhuǎn)移是根腫菌的主要遠(yuǎn)距離傳播途徑。在條件適宜時(shí)，植株只需8～10 d就能表現(xiàn)出根腫癥狀。病根組織被雜菌侵入造成腐爛后，其內(nèi)部大量的休眠孢子又沉積在土壤或堆肥中，可對(duì)十字花科作物進(jìn)行再侵染或休眠。

2．5 根腫菌的侵染癥狀 植株受到侵染后，根部薄壁細(xì)胞因受根腫菌的刺激而大量分裂、增生和膨大形成根部腫瘤，影響維管束組織的正常發(fā)育，輸導(dǎo)系統(tǒng)不連貫，植株吸收水分和養(yǎng)分困難，病株表現(xiàn)為生長(zhǎng)遲緩，葉片萎垂，嚴(yán)重者整株死亡，給蔬菜生產(chǎn)帶來巨大損失。苗期感病，腫瘤多出現(xiàn)在主根，形狀多樣(呈紡錘形、圓筒形或手指形等)，腫瘤表面大多光滑，病苗比健康苗稍微矮化，葉片萎垂且淡綠，植株表現(xiàn)缺水癥狀，有的植株基部葉片葉緣變黃、嚴(yán)重缺水;成株期感病，腫瘤多出現(xiàn)在側(cè)根以及主根的下部，形狀同苗期，主根的腫瘤體積大但數(shù)量少，側(cè)根的腫瘤體積小但數(shù)量多，須根上的腫瘤可成串，病株比健康植株生長(zhǎng)緩慢且矮化，植株葉片常萎蔫，再嚴(yán)重時(shí)葉片逐漸變黃呈失水狀。腫瘤形成初期表面光滑，后期常龜裂而粗糙，且病根易被雜菌侵入造成腐爛。

2．6 根腫菌的檢測(cè) 植株誘導(dǎo)法是評(píng)估新型診斷技術(shù)的有效方法，具體操作是在可控環(huán)境條件下，調(diào)整土壤濃度達(dá)到接種要求，隨即種植植株，數(shù)周后觀察根腫病的癥狀，該方法要求高濃度接種癥狀才會(huì)表現(xiàn)出來，同時(shí)還受土壤類型和環(huán)境條件的限制。Takahashi等［15］用熒光染色技術(shù)對(duì)土壤中提取的休眠孢子進(jìn)行檢測(cè)與定量。Lange等［16］、Wakeham等［17］都成功地對(duì)分離自根腫組織和土壤的根腫菌進(jìn)行了掃描電鏡以及血清學(xué)檢測(cè)。Shoko等［18］應(yīng)用ELISA血清學(xué)方法成功地對(duì)人工接種的根腫組織和土壤的休眠孢子進(jìn)行了特異性檢測(cè)。Hee等［19］及 Faggian等［20］利用病原菌基因組中ITS區(qū)段設(shè)計(jì)特異性引物，成功地?cái)U(kuò)增出根腫菌特異性DNA片段，并將其用于檢測(cè)根腫組織和土壤的病原菌。Ito等［21］用SNT PCR擴(kuò)增到根腫菌特異性DNA片段。楊佩文等［22］用PCR技術(shù)擴(kuò)增到白菜、青菜、甘藍(lán)、芥藍(lán)、花椰菜以及土壤中的根腫菌全基因組DNA中的特異片段。李金萍等［23］利用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)技術(shù)檢測(cè)到接種5 d后的大白菜根組織中的根腫菌。

2．7 根腫菌的發(fā)病規(guī)律 楊蓮等［24］研究表明云南省1～3月為根腫病病害低發(fā)期，4～5月進(jìn)入發(fā)病高峰前期，6～9月是發(fā)病高峰期，10～12月由高峰末期轉(zhuǎn)到緩慢發(fā)展期;結(jié)合氣象資料分析表明該地區(qū)田間白菜根腫病發(fā)生發(fā)展的適溫為20．2～24．7℃;從受害作物各生育期病情發(fā)展分析看，處于高峰發(fā)病時(shí)段時(shí)，白菜2葉1心期到6葉1心期發(fā)病速度快，6葉1心期后發(fā)病速度有所減慢。上海地區(qū)十字花科根腫病主要發(fā)病期為9～11月，且9月中下旬至10月上中旬是病害高峰時(shí)期［25］。

3 十字花科作物抗根腫病育種

3．1 根腫菌的接種方法 抗病育種研究中，簡(jiǎn)單有效的接種方法是基礎(chǔ)，要求能在通常條件下發(fā)病穩(wěn)定一致，菌濃度不高時(shí)也能準(zhǔn)確鑒定大量群體的抗病性，還需要盡可能避免病菌不必要的擴(kuò)散和污染。目前，被研究者采用的接種方法有插入法、菌土法和沾泥漿法。插入法是把根腫組織用粉碎機(jī)粉碎，過濾制成一定濃度的孢子懸浮液，直接注入移栽后的無菌土作為基質(zhì)的培養(yǎng)缽中接種，通常在接種后45～60 d調(diào)查病情指數(shù)。菌土法是把根腫組織用粉碎機(jī)粉碎，過濾制成一定濃度的孢子懸浮液，直接注入用無菌土作為基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽中，播種后45～60 d調(diào)查病情指數(shù)。沾泥漿法是把根腫組織用粉碎機(jī)粉碎，與無菌土按一定比例充分混合制成菌土，使種子在潮濕環(huán)境中發(fā)芽至根長(zhǎng)為1 cm，然后放入菌土中，與菌土充分混合，然后播種在無菌土作為基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽中，并用菌土覆蓋，播種后45～60 d調(diào)查病情指數(shù)。

3．2 根腫病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 病害發(fā)病等級(jí)記載標(biāo)準(zhǔn)為:0級(jí)——根部無腫瘤，植株生長(zhǎng)正常;1級(jí)——側(cè)根有腫瘤，植株生長(zhǎng)正常;3級(jí)——主根腫大有腫瘤，其直徑小于2倍莖基部，植株地上部可見生長(zhǎng)輕度受阻;5級(jí)——主根腫大，其直徑是莖基部2～3倍，側(cè)根脫落，植株地上部輕度受阻;7級(jí)——主根腫大，其直徑是莖基部3～4倍，側(cè)根脫落，植株地上部明顯矮小、萎黃;9級(jí)——主根腫大，其直徑是莖基部4倍以上或龜裂，側(cè)根大量死亡，植株嚴(yán)重萎蔫或死亡［25］。

病情指數(shù)按以下公式計(jì)算:

根據(jù)病情指數(shù)進(jìn)行如下抗性差異分類:高感＞80．0，50．0 ＜ 感病≤80．0，40．0 ＜ 低感/低抗≤50．0，30．0 ＜ 抗病≤40．0，高抗≤30．0。

3．3 十字花科不同作物的抗性反應(yīng) 所有的十字花科蔬菜均有不同程度的根腫病發(fā)生，相對(duì)而言，白菜類易感病，其次是甘藍(lán)類，蘿卜最不易感病。在十字花科作物中，日本蘿卜表現(xiàn)最抗病。楊佩文等［26］進(jìn)行大白菜不同品種抗性比較試驗(yàn)，結(jié)果表明大白菜根腫病發(fā)生危害程度在品種間有顯著差異。鄢洪海［27］進(jìn)行的大白菜品種抗根腫病鑒定結(jié)果表明拱式品種對(duì)大白菜根腫病均表現(xiàn)不同程度感病，未發(fā)現(xiàn)高抗或者免疫的品種。劉勇等［28］在對(duì)國(guó)內(nèi)外46個(gè)油菜品種進(jìn)行抗病鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)可將其分為4個(gè)類群，四川主栽油菜無抗根腫病品種，而德國(guó)油菜品種Lisek和Oase病情指數(shù)均小于30，對(duì)根腫病表現(xiàn)高抗。符明聯(lián)等［29］對(duì)16個(gè)油菜品種進(jìn)行抗性研究發(fā)現(xiàn)“云油雙1號(hào)”、“花油7號(hào)”和“A35”在全生育期均表現(xiàn)較強(qiáng)抗性。上述抗性鑒定的研究可為根腫病重災(zāi)區(qū)篩選合適的抗性栽培品種以及育種材料的選擇提供依據(jù)。

3．4 十字花科根腫病的抗病遺傳 一般認(rèn)為，結(jié)球白菜和其他白菜類作物的抗性通過1個(gè)顯性基因遺傳;甘藍(lán)和其他甘藍(lán)類作物抗性不完全顯性，特別當(dāng)溫度很高時(shí)呈多基因遺傳，而羽衣甘藍(lán)、結(jié)球甘藍(lán)類型，青花菜型，花椰菜型，孢子甘藍(lán)類型等通過1個(gè)隱性基因遺傳。Roeland［30］研究表明蕓苔屬植物的根腫病抗性基因?qū)儆陔[性遺傳，由少數(shù)基因主控制且具有累加效應(yīng)。Kuginuki等［31］研究歐洲型油菜育成的白菜時(shí)發(fā)現(xiàn)3個(gè)與抗根腫病主效基因連鎖的標(biāo)記，并推測(cè)蕓苔種的抗性與歐洲型油菜相同，均受控于1個(gè)主效基因和多個(gè)微效基因。Landery等［32］研究根腫病多個(gè)生理小種的抗性基因，定位后確定pb2和pb7分別位于連鎖群的6和2上。Voorrips等［33］用 AFLP、RFLP 標(biāo)記圖譜定位了 pb3 和 pb4 基因的幾個(gè)QTLs位點(diǎn)，為根腫病多個(gè)生理小種綜合研究提供了新方法。孫保亞等［34］研究表明大白菜根腫病是由1對(duì)顯性核基因控制。同時(shí)，品種的抗病性同病菌生理小種的區(qū)系分布有很大關(guān)系，有的抗病品種雖然抗病，但也含有不合要求的性狀，例如對(duì)病毒病的抗性降低、質(zhì)量差或者易患缺鈣癥等。

4 十字花科根腫病的防治

4．1 農(nóng)業(yè)防治 根腫病的發(fā)生危害程度與土壤中根腫菌的含量以及病殘?bào)w的殘存量直接相關(guān)，因此，輪作、清除病殘?bào)w、夏季曬壟等以減少土壤中病菌含量為目的的農(nóng)業(yè)防治措施均可有效減輕病害的發(fā)生程度。多用有機(jī)肥，少用化學(xué)肥料，施足有機(jī)基肥，熟化土壤，改良土壤，優(yōu)化氮、磷、鉀及微量元素配方是防治根腫病的有效措施。合理安排茬口，做到3～4年以上輪作、育苗移栽、清除病殘?bào)w、無病土育苗等栽培措施能降低根腫病的發(fā)病率。合理整地，深溝高畦，溝深為40 cm左右，畦高為20 cm以上。推廣應(yīng)用滴灌澆水的方式抗旱，抗旱中小水勤澆有利于減輕病害發(fā)生，大水漫灌則加重病害傳播。適期播種即將常年播栽適期推遲或者提前一定天數(shù)。對(duì)種子進(jìn)行消毒，避免病害區(qū)蔬菜調(diào)運(yùn)。利用非十字花科植物誘導(dǎo)土壤中休眠孢子萌發(fā)，減少土壤菌量以減輕病害。

4．2 化學(xué)防治 Tremblay等［35］認(rèn)為土壤中增施石灰加氰氨化鈣，可以提高土壤pH，進(jìn)而控制根腫菌病害。Murakami等［36］報(bào)道土壤撒石灰可抑制休眠孢子萌發(fā)，減輕根腫菌病害，其控病效果與提高土壤pH及土壤可交換的鈣元素有關(guān)。選用石灰氮作氮肥，加入適量增效劑，利用其較強(qiáng)的堿性及轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生的氰胺化物對(duì)土壤進(jìn)行消毒，在發(fā)病地區(qū)使用，既可提供氮素營(yíng)養(yǎng)又能防治病害。采用五氯硝基苯藥劑、五氯硝基苯、75%五氯硝基苯可濕性粉劑、10%氰霜唑懸浮劑、75%達(dá)科寧、百菌清和氟啶胺等防治根腫菌有一定效果。

4．3 生物防治 近年來，應(yīng)用拮抗微生物防治根腫病的研究越來越多，同時(shí)，生物防治因其安全、有效、無污染的優(yōu)勢(shì)，在根腫病防治中越來越受關(guān)注。國(guó)內(nèi)外篩選得到的拮抗微生 物 Heteroconium chaetospira、Trichoderma isolates(TC32、TC45、TC63)、Phoma glomerata JCM 9972、枯草芽孢桿菌 XF-1、鏈霉菌A316與A10等在生防實(shí)踐中取得了良好的防治效果。孫良菲等［37］篩選出放線菌YN-6、真菌XP-F2，試驗(yàn)顯示其對(duì)白菜根腫病的防治效果分別為56．30%、61．80%。曹易丹等［38］研究發(fā)現(xiàn)大蒜浸提液對(duì)青梗菜根腫病有一定的防治效果。王勝等［39］研究表明蚯蚓糞能降低土壤酸性，提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，對(duì)油菜根腫病的防效達(dá)56．3% ～61．4%。

5 展望

我國(guó)大陸各省份的根腫菌屬于何種小種、如何分布尚不清楚。目前，我國(guó)急需研究國(guó)內(nèi)根腫菌的小種分化和分布以及不同地區(qū)該菌的遺傳差異，為促進(jìn)根腫病研究篩選?；剐云贩N創(chuàng)造前提條件;還需研究各地病害流行規(guī)律，探索病害流行的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)技術(shù);進(jìn)一步研究合適的抗病鑒定方法，明確抗性遺傳機(jī)制，成功篩選到抗原，最終能夠?qū)⒖乖D(zhuǎn)育到品種中，育成能被市場(chǎng)認(rèn)可的抗病或耐病新品種;同時(shí)還需不斷摸索優(yōu)化的栽培和耕作方法，研究生物和化學(xué)防治方法，防范該病的發(fā)生和流行，避免該病造成大的經(jīng)濟(jì)損失和危害。

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