固相萃取柱凈化-高效液相色譜法測定小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

羅穎鵬，陳正行，王 韌，羅小虎，李永富，李亞男，邵慧麗，王 莉*

（江南大學(xué)食品學(xué)院，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

固相萃取柱凈化-高效液相色譜法測定小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

羅穎鵬，陳正行，王 韌，羅小虎，李永富，李亞男，邵慧麗，王 莉*

（江南大學(xué)食品學(xué)院，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

建立固相萃取-高效液相色譜對小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）進(jìn)行測定的方法。從提取溶劑、凈化方式、流動相組成以及流動相流速等條件優(yōu)化DON檢測方法。結(jié)果表明，當(dāng)樣品提取溶劑為乙腈-水（84∶16，V/V），Bond Elut Mycotoxin固相萃取柱凈化，流動相組成為乙腈-水（6∶94，V/V），流速為0.9 mL/min時，DON檢測結(jié)果最好，該檢測方法的DON回收率達(dá)到90.12%～106.25%，日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.51%和6.12%。該方法快速、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，適合DON污染小麥樣品的大批量檢測。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；小麥；高效液相色譜；固相萃取；檢測

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）又稱嘔吐毒素，是鐮刀菌屬的禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌等的次級代謝產(chǎn)物，是真菌毒素常見的一種，其廣泛存在于小麥、大麥、玉米等糧食作物中，每年全世界谷物類糧食都受到DON的困擾，造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。人和動物長期大量攝入DON可抑制蛋白質(zhì)的合成，造成嘔吐、腹瀉、厭食、惡心、神經(jīng)紊亂等毒性效應(yīng)[3-5]。DON的性質(zhì)十分穩(wěn)定，烘焙、高溫、高壓等食品加工方法對它的影響很小，120 ℃的高溫仍然不能使其降解，當(dāng)溫度升高到210 ℃處理30～40 min才能被破壞[6-7]。為減少DON對人類的危害，目前很多地區(qū)和國家都制訂了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)來限制糧食中DON的含量，我國和聯(lián)合國糧農(nóng)組織規(guī)定食用糧中DON的限量為1 mg/kg[8]。

小麥?zhǔn)俏覈饕Z食作物，但由于收獲、儲藏和氣候等原因，容易被DON等真菌毒素污染[9-10]。熊凱華等[11]調(diào)查表明，安徽省和河南省小麥中的DON檢出率分別為76.7%和75.3%，其他省份的DON檢出率也有60%。針對糧食或飼料中的DON污染嚴(yán)重，迄今有一系列的檢測方法，常用的有氣相色譜法[12]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[13-15]以及酶聯(lián)免疫吸附測定法[16]，另外還有薄層色譜法[17]和熒光法[18]等。

目前DON的檢測方法研究較多，但實際應(yīng)用較少，主要原因是分析方法靈敏度相對較低、分析速度較慢、溶劑消耗量大、很難定量測定[19-20]。因此，建立一個快速、簡便、有效的DON檢測方法是很有必要的。本實驗在優(yōu)化小麥中DON的提取和凈化條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化了HPLC檢測過程中不同流動相組成與配比、流速等條件，研究出適宜快速提取檢測小麥中DON方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DON污染與未污染小麥 合肥市購；乙腈（色譜純） 美國Fisher公司；超純水（電阻≥18.2 MΩ）；DON標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.8%） 百靈威科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1260系列HPLC儀帶紫外檢測器、ZORBAX SB C18色譜柱、Bond Elut Mycotoxin（BEM）固相萃取柱 美國Agilent科技有限公司；MycoSep 227#固相萃取柱 美國Romer Labs公司；DCY-12G型氮吹儀 青島海科儀器股份有限公司；Simplicity UV型超純水儀 美國Millipore公司；BSA124S-CW分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SHZ-B型水浴恒溫振蕩器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取5.00 mg的DON標(biāo)準(zhǔn)品（精確至0.01 mg），將其用色譜純甲醇溶解，得到質(zhì)量濃度為100 μg/mL的DON標(biāo)準(zhǔn)儲備液，－20 ℃保藏；取1 mL的DON標(biāo)準(zhǔn)儲備液，50 ℃氮氣吹干，流動相配成0.10、0.20、0.40、0.80、1.00、5.00、10.00 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品前處理

樣品提?。喝?5.00 g過30 目篩的小麥樣品到250 mL錐形瓶中，加入100 mL乙腈-水（84∶16，V/V）溶液，40 ℃水浴恒溫200 r/min振蕩30 min，樣品過濾。

樣品凈化：將DON樣品提取液濾液加入到固相萃取柱中，待提取液濾過固相萃取柱后，取5 mL凈化液50 ℃條件下N2吹干，殘余物用1 mL乙腈-水（6∶94，V/V）復(fù)溶，渦旋30 s。再用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，2 mL進(jìn)樣瓶收集濾液，樣品待測。

1.3.3 HPLC條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；紫外檢測器檢測波長：218 nm；流動相：乙腈-水（6∶94，V/V）；流速：0.9 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的提取

研究[13,21]表明，食品中DON易溶于水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯等極性溶劑。由于乙酸乙酯、丙酮等毒性較大，而乙醇等容易將樣品中雜質(zhì)溶解出[15]。本研究以小麥為基質(zhì)，分別采用水、乙腈、甲醇和不同比例的乙腈-水、甲醇-水作為提取溶劑，同時在樣品中添加DON標(biāo)準(zhǔn)品，通過計算各提取溶劑的加標(biāo)回收率比較不同溶液的提取效率。結(jié)果表明，純水提取時DON回收率較高，但純水提取的樣品檢測時，雜質(zhì)對目標(biāo)物干擾較大，且樣品經(jīng)固相萃取柱凈化后，回收率大大降低；而乙腈-水（84∶16，V/V）提取時，回收率與純水相比，沒有顯著差別，但乙腈-水體系沉淀樣品中蛋白質(zhì)等干擾物的效果優(yōu)于純水，且樣品經(jīng)MycoSep 227#和BEM固相萃取柱凈化后，回收率依然良好。因此，本實驗確定乙腈-水（84∶16，V/V）為樣品提取液。

2.2 樣品的凈化

目前，樣品溶液中DON凈化方式主要有固相萃取柱和免疫親和柱（immuno affinity column，IAC）凈化[22-23]。由于固相萃取柱操作簡便、成本較低、能有效分離雜質(zhì)和目標(biāo)物損失較小，目前最為常用[24]。本研究比較MycoSep 227#和BEM這兩種固相萃取柱對樣品的凈化效果，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，未凈化樣品的色譜圖雜峰多，嚴(yán)重干擾了DON的定量。而樣品經(jīng)MycoSep 227#和BEM凈化，目標(biāo)峰兩邊的雜峰都明顯減少，干擾減少，測定結(jié)果更準(zhǔn)確。Moazami等[22]研究了4 種凈化方式，其中使用MycoSep 227#凈化柱的DON回收率只有53%；而Stecher等[25]用MycoSep 227#凈化樣品，回收率達(dá)到了93.84%，造成上述結(jié)果差異顯著的原因可能是所用提取溶劑不同而造成的。本研究中的MycoSep 227#與BEM柱凈化效果相比，回收率分別為87.96%和92.30%，BEM凈化效果較好，回收率較高，且成本較低。因此選用BEM凈化柱。

1.未凈化；2. MycoSep 227#柱凈化；3. BEM柱凈化；4. DON標(biāo)準(zhǔn)品。

2.3 流動相的選擇優(yōu)化

流動相是影響目標(biāo)物分離效果的重要因素，根據(jù)DON易溶于極性溶劑，本實驗選用反相色譜常用的流動相水、乙腈、甲醇，研究不同比例的水-乙腈-甲醇體系下的分離效果[24,26-27]。根據(jù)目標(biāo)物峰面積、保留時間、峰形等因素確定最佳的流動相比例。如圖2所示，流動相中水的比例越大，目標(biāo)物的保留時間越長，與雜質(zhì)的分離程度越高，當(dāng)流動相為乙腈-水（6∶94，V/V），靈敏度和分離度良好。且從圖3可看出，當(dāng)流動相為乙腈-水（6∶94，V/V）時，DON峰面積顯著高于其他流動相，表明該流動相條件下能更靈敏的測定目標(biāo)物。因此，本研究選用乙腈-水（6∶94，V/V）為檢測小麥中的DON含量流動相。

圖2 不同流動相組成的DON樣品色譜圖Fig.2 DON chromatograms with different mobile phases

圖3 不同流動相DON檢測結(jié)果Fig.3 Recovery of DON with different mobile phases

2.4 流動相流速的選擇

流動相流速也顯著影響樣品中DON的分離檢測[26,28-29]。本實驗結(jié)合前人研究結(jié)果，選擇流速為0.8～1.1 mL/min進(jìn)行研究，結(jié)果圖4所示，當(dāng)流速為0.9 mL/min時，目標(biāo)物受雜質(zhì)影響小，分離效果最好，峰面積顯著高于其他流動相流速。因此本研究選擇流動相流速為0.9 mL/min。

圖4 流動相流速對DON檢測結(jié)果的影響Fig.4 Effect of different fl ow rates of mobile phase on DON recovery

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

移取適量標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（0.10、0.20、0.40、0.80、1.00、5.00、10.00 μg/mL），每一質(zhì)量濃度測定5 次，根據(jù)DON的保留時間定性，以測得的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣質(zhì)量（ng）為橫坐標(biāo)（X），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=1 497.990X＋0.494，R2=0.999，線性范圍為2～200 ng。

2.6 檢測限與定量限

根據(jù)峰高法以3 倍信噪比的峰響應(yīng)值作為最低檢測線，10 倍的信噪比的峰響應(yīng)值作為最低定量限進(jìn)行計算，得出此方法的最低檢測限為60 μg/kg，最低定量限200 μg/kg，符合實際分析的要求。

2.7 回收率與精密度

取未污染DON的小麥樣品，分別配成500、1 000、2 000 μg/kg的DON加標(biāo)樣品，按前述樣品前處理方法處理后，在上述液相色譜檢測條件下進(jìn)行測定，每個加標(biāo)樣做3 個重復(fù)，得到方法的回收率。將加標(biāo)量為1 000 μg/kg的樣品每天提取3 次，重復(fù)3 d，測定方法的日內(nèi)和日間精密度。其結(jié)果見表1，樣品的加標(biāo)回收率在90.12%～106.25%之間，日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為4.51%和6.12%。本方法與現(xiàn)有文獻(xiàn)[6,13,26-28,30-31]相比，也有著較高回收率，較低檢測限等優(yōu)點（表2）。按前述方法制備DON加標(biāo)樣品，采用GB/T 23503—2009《食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定：免疫親和層析凈化高效液相色譜法方法》測定加標(biāo)樣品回收率、日內(nèi)和日間精密度結(jié)果表明，與GB/T 23503—2009相比，本研究方法在測定小麥中DON時，也具有較高的回收率和較低的RSD，且本研究方法操作較簡便，成本較低。

表1 本方法與GB/T 23503—2009方法樣品加標(biāo)回收率與精密度實驗結(jié)果Table1 Recoveries and precision of this method and GB/T 23503—2009

表2 本方法與其他液相色譜方法對比Table2 Comparison of this method with other HPLC methods in the literature

3 結(jié) 論

本研究考察了小麥樣品中DON的提取溶劑、凈化方式、流動相組成以及流動相流速對DON檢測結(jié)果的影響，結(jié)果當(dāng)提取溶劑為乙腈-水（84∶16，V/V），BEM固相萃取柱凈化，流動相為乙腈-水（6∶94，V/V），流速為0.9 mL/min時，HPLC-紫外檢測器對DON的分離檢測效果最好。該方法在測定小麥樣品中的DON時，具有良好的線性范圍及檢測限，且方法經(jīng)回收率、日內(nèi)和日間精密度考察，重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。該方法操作簡便、快速準(zhǔn)確，適合大批量污染DON的小麥樣品檢測。

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Determination of Deoxynivalenol in Wheat Grains by HPLC Using Solid-Phase Extraction Cleanup Column

LUO Yingpeng, CHEN Zhengxing, WANG Ren, LUO Xiaohu, LI Yongfu, LI Yanan, SHAO Huili, WANG Li*
(National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Deoxynivalenol (DON) is a ubiquitous mycotoxin present in cereal grains such as wheat and corn. This mycotoxin causes huge damage to human and animal health. This study optimized the experimental conditions including extraction solvent, cleanup column, composition and flow rate of mobile phase for DON detection by high-performance liquid chromatography (HPLC) after solid-phase extraction (SPE) cleanup. The optimized HPLC method was established when the extraction was performed using a mixture of acetonitrile (ACN) and water (84:16, V/V) followed by SPE cleanup on a Bond Elut Mycotoxin column using a mobile phase consisting of ACN and water (6:94, V/V) at a fl ow rate of 0.9 mL/min. Under these conditions, the recoveries of DON with this method ranged from 90.12% to 106.25%, with intra- and inter-day relative standard deviations between 4.51% and 6.12%, respectively. The proposed method is applicable to determine DON in grains because of its rapidity as well as good accuracy, repeatability and stability.

deoxynivalenol; wheat; high performance liquid chromatography (HPLC); solid-phase extraction; detection

TS207

A

1002-6630（2015）20-0222-04

10.7506/spkx1002-6630-201520043

2014-12-02

公益性行業(yè)（糧食）科研專項（201313005）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201203037）；

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD34B02）；國家自然科學(xué)基金面上項目（31371874；311717835）；

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31101383；31201381；31501579）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項（JUSRP11510）

羅穎鵬（1990—），男，碩士研究生，研究方向為糧食質(zhì)量與安全。E-mail：lyp_jiangnan@163.com

*通信作者：王莉（1981—），女，副教授，博士，研究方向為糧食精深加工與糧食質(zhì)量與安全。E-mail：legend0318@hotmail.com