飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚生長性能、免疫調(diào)控與抗海豚鏈球菌感染的影響

強 俊 孫意嵐* 黃 永 楊 弘＊＊ 徐 跑＊＊ 袁慶華何 杰 朱志祥 蘇田平

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點實驗室，無錫 214081;2.無錫幾丁生物新材料科技發(fā)展有限公司，無錫 2014026;3.江蘇德仁生物科技發(fā)展有限公司，金壇 213200)

當前中國，魚類疾病的預(yù)防與治療主要通過有限的抗生素與化學(xué)藥物，然而，長期使用抗生素會引起病原菌產(chǎn)生抗性，降低藥用效果［1］。伴隨著抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的嚴格限制，大量免疫增強劑和免疫調(diào)控劑得以迅速發(fā)展與推廣，這其中主要包括一些天然物質(zhì)與合成物質(zhì)，如:左旋咪唑、β－葡聚糖、肽聚糖、殼多糖、幾丁聚糖、維生素混合物以及各種中草藥制劑等。這些物質(zhì)可以有效地通過增強細胞與體液的免疫防御來預(yù)防疾?。?］。

甲殼素作為一種天然高分子物質(zhì)，廣泛存在于甲殼類動物、昆蟲與真菌中。在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)行業(yè)的應(yīng)用中，蝦殼與蟹殼是甲殼素及其脫乙酰產(chǎn)物幾丁聚糖(殼聚糖)的重要商業(yè)用料來源［3］。甲殼素與幾丁聚糖可以有效地抑制多種真菌與細菌生長，其調(diào)控原理是幾丁聚糖與細胞表面的負電荷殘基之間的質(zhì)子化氨基(NH2)基團通過靜電力相互作用，從而增強細胞表面的抗菌活性［4］。同時，幾丁聚糖是天然的可生物降解的多糖，也是自然界中唯一帶正電荷的生物活性多糖［5］，通過口服幾丁聚糖來提高免疫力已呈現(xiàn)出良好的發(fā)展前景。幾丁聚糖在水產(chǎn)動物上的研究已有一些報道，如飼料中添加幾丁聚糖可以在一定程度上提高褐石斑魚(Epinephelus bruneus)［2］、鯉魚(Cyprinus carpio)［6］、軍 曹 魚 (Rachycentron canadum)［1］、草魚(Ctenopharyngodon idellus)［7］、香魚(Plecoglbssus altivelis)［8］、星斑川鰈(Platichthys stellatus)［9］和 異 育 銀 鯽 (Carassius auratus gibelio)［10－11］的免疫力。然而，近年來，隨著幾丁聚糖研發(fā)工藝的發(fā)展，傳統(tǒng)工藝獲取的幾丁聚糖因分子質(zhì)量巨大、聚合度高、吸收率低以及提取工藝成本較高等原因制約了其推廣應(yīng)用。相比之下，通過無拮抗作用的微生物發(fā)酵與酶解產(chǎn)生的新型幾丁聚糖，分子質(zhì)量?。刍瘜W(xué)式為(C6H11NO4)n，相對分子質(zhì)量為(161.9)n］，易于吸收。同時，其提取工藝較為簡單，成本較低，安全性已經(jīng)通過日本政府600項農(nóng)藥殘留檢測，毒性低于食鹽［半數(shù)致死量(LD50)＞20 000 mg/kg］［12］。

羅非魚(Oreochromis niloticus)是世界主要養(yǎng)殖魚類之一，近年來，由于高密度養(yǎng)殖、養(yǎng)殖水體污染以及配合飼料營養(yǎng)不均衡等問題，羅非魚感染疾病的幾率大大升高。其中，無乳鏈球菌和海豚鏈球菌引起的羅非魚鏈球菌病，是羅非魚病害中最為棘手的，該病不僅死亡率高，而且死亡速度極快，治療起來極其困難，該疾病給養(yǎng)殖從業(yè)者帶來了嚴重的經(jīng)濟損失，已經(jīng)成為嚴重制約羅非魚產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的枷鎖［13－15］。本研究擬以此新型幾丁聚糖為飼料添加劑，通過對照組與不同添加量間的比較，分析飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚生長性能、血常規(guī)與血清生化參數(shù)、頭腎中免疫相關(guān)基因表達的影響;同時，比較海豚鏈球菌感染后的累計死亡率，從而篩選出幾丁聚糖的最適添加量。本研究結(jié)果可以為新型幾丁聚糖在羅非魚飼料中的應(yīng)用與推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚

試驗魚取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興基地自繁的“吉富”品系尼羅羅非魚幼魚，選擇無病無傷、活力強的個體作為試驗用魚。試驗前在室內(nèi)水泥池［水溫(29±1)℃，pH 7.4±0.2］中暫養(yǎng)10 d，自然光周期。暫養(yǎng)期間使用循環(huán)水連續(xù)充氣，每天08:00和15:00各投喂沉水性飼料(粗蛋白質(zhì)含量為29.0%、粗脂肪含量為8.0%)1次，投喂量為體重的8%。

1.2 試驗設(shè)計與分組

首先配制基礎(chǔ)飼料，然后在每千克基礎(chǔ)飼料中分別添加10、20、30和40 mL的幾丁聚糖溶液(購于江蘇德仁生物科技有限公司，幾丁聚糖的有效濃度為0.6%)，另配制成4種試驗飼料，分別用1、2、3和4組表示。幾丁聚糖溶液的具體添加方法為:每種飼料按照基礎(chǔ)飼料配方(表1)分別配制10 kg的飼料后，采用移液槍分別準確地吸取100、200、300和400 mL的幾丁聚糖液體溶液，先將幾丁聚糖溶液添加至水中，混勻后，然后用噴壺均勻噴灑到飼料中。同時設(shè)置不添加幾丁聚糖的基礎(chǔ)飼料為對照組。將各飼料使用飼料制粒機制成顆粒，陰涼處風(fēng)干，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗在封閉的水循環(huán)系統(tǒng)中進行，選取15個容積800 L的塑料桶，每個塑料桶添加曝氣3 d后的自來水700 L。利用控溫系統(tǒng)將溫度保持在(29.0±0.3)℃，試驗開始前對幼魚的體重進行測量，試驗用魚平均體重為(2.97±0.02)g，隨機分為5組，每組3個重復(fù)(塑料桶)，每個重復(fù)放養(yǎng)25尾魚。各組試驗魚初始體重沒有顯著差異(P＞0.05)。每組試驗魚隨機飼喂1種飼料，每次投喂量為體重的5% ～8%，每周投喂6 d，停飼1 d，試驗周期共計63 d。試驗期間連續(xù)充氣，采用虹吸法清除桶底糞便，每隔3 d換水1/3，保持換水前后溫差不超過±0.5℃，溶氧保持在5 mg/L以上，pH 7.6±0.2，氨氮和亞硝酸鹽濃度分別不高于 0.003 和0.004 mg/L，自然光周期。

1.4 生長性能指標測定

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，統(tǒng)計各養(yǎng)殖桶的魚尾數(shù)，稱取每桶魚的總重后，隨機選取5尾魚，用濃度為200 mg/L的MS－222進行快速深度麻醉，分別稱體重后，立即剖開腹腔，剝離出內(nèi)臟和肝臟并稱重。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

分別按下式計算特定生長率(specific growth rate，SGR)、飼料效率(feed efficiency，F(xiàn)E)、成活率(survival ratio，SR)、肝體比(hepatosomatic index，HSI)、內(nèi)臟比(viscerasomatic index，VSI):

式中:W0為魚的初始均體重(g);Wt為魚的終末均體重(g);t為飼養(yǎng)天數(shù)(d);F為每尾魚的平均總攝食量(濕重，g);N0為初始魚尾數(shù);Nt為終末魚尾數(shù);Wh為每尾魚終末肝臟重(g);Wv為每尾魚終末內(nèi)臟重(g);Wb為每尾魚終末體重(g)。

1.5 采樣與處理

每個養(yǎng)殖桶隨機再選取4尾魚，為了降低取樣應(yīng)激，利用過量的MS－222(2%)深度麻醉后，取頭腎與血液樣品檢測相關(guān)指標的變化。一部分血樣用于血常規(guī)指標的檢測，一部分血樣于4℃冰箱中靜置2 h，在4℃、3 500 r/min下離心10 min制備血清，上清液移置－70℃冰箱中保存?zhèn)溆?頭腎樣品用液氮速凍后，于－70℃保存，用于分子生物學(xué)分析。

1.5.1 血常規(guī)指標的測定

血常規(guī)中紅細胞(red blood cells，RBC)、白細胞(white blood cells，WBC)數(shù)目，血紅蛋白(haemoglobin，Hb)濃度與紅細胞壓積(haematocrit，Hct)在邁瑞B(yǎng)C－5300Vet全自動五分類動物血液細胞分析儀上測定，試劑盒均購自無錫中潤醫(yī)藥有限公司。

1.5.2 血清生化指標的測定

血清皮質(zhì)醇(cortisol，COR)含量及溶菌酶(lysozyme，LZM)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性采用酶聯(lián)免疫吸附法測定，通過BioTek EonTM微孔板分光光度計進行讀數(shù)，試劑盒購自上海朗頓生物有限公司。血清總蛋白(total protein，TP)、葡萄糖(glucose，GLU)、甘油三酯(triglyceride，TC)、膽固醇(cholesterol，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)含量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspertate aminotransferase，AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)活性在邁瑞全自動生化分析儀(BS－400)上測定，試劑盒均購自無錫中潤醫(yī)藥有限公司。

1.5.3 頭腎免疫相關(guān)基因定量表達

根據(jù)GenBank中羅非魚白細胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factorα，TNF-α)和干擾素 γ(interferon γ，IFN-γ)的序列，設(shè)計3個基因的特異性引物，引物序列見表2。用羅非魚的 β－肌動蛋白(β-actin)(EU887951.1)作為內(nèi)參基因，設(shè)計β-actin引物，引物序列見表2。所有引物由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成，取羅非魚頭腎20 mg左右，參照RNeasy Mini Handbook(QIAGEN公司)說明書用試劑盒提取總RNA，所得總RNA的OD260/OD280為1.90左右。熒光定量PCR反應(yīng)液的制備與反應(yīng)條件參照Qiang等［13］的方法。

在基因表達與β-actin的定量PCR擴增效率基本一致的前提下，計算目的基因mRNA相對表達量。以羅非魚β-actin為內(nèi)參，對得到的各樣品Ct值進行均一化處理，以對照組的相對表達量為基準，應(yīng)用 2－ΔΔCt法［16］確定不同幾丁聚糖添加水平下各基因mRNA的相對表達量。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.6 感染試驗

為了減少取樣應(yīng)激，試驗結(jié)束繼續(xù)飼養(yǎng)10 d后，每個養(yǎng)殖桶選取10尾魚進行海豚鏈球菌感染試驗，海豚鏈球菌的培養(yǎng)與計數(shù)、菌液注射感染等方法參照Qiang等［13］的方法。正式感染試驗前，隨機選取30尾備用吉富羅非魚(攝食對照組飼料)，通過感染不同濃度梯度的菌液進行預(yù)試驗，確定感染菌液的半數(shù)致死量。本試驗注射感染所用的海豚鏈球菌菌液濃度為6.15×106CFU/mL，注射劑量為每100 g體重300μL，計算感染192 h時各組的累計死亡率。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行方差分析及Duncan氏法多重比較，顯著水平為P＜0.05。結(jié)果用平均值±標準差(mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚生長性能的影響

飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚生長性能的影響見表3。2組的終末體重和FE均顯著高于對照組與3和4組(P＜0.05)。各組SGR無顯著差異(P＞0.05)。各組 63 d的 SR介于93.3% ～97.3%，組間無顯著差異(P＞0.05)。與對照組相比，飼料中幾丁聚糖溶液添加量為10和20 mL/kg時能顯著降低 HSI(P＜0.05)，幾丁聚糖溶液添加量為20和40 mL/kg時能顯著降低VSI(P＜0.05)。

2.2 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚血常規(guī)指標的影響

飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚血常規(guī)指標的影響見表4。與對照組相比，飼料中幾丁聚糖溶液添加量為10和20 mL/kg時能顯著增加血液中RBC和WBC數(shù)目以及Hb濃度和Hct(P＜0.05);繼續(xù)增加幾丁聚糖溶液的添加量后各血常規(guī)指標均有所下降。4組中血液中RBC數(shù)目、Hb濃度和Hct與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)，但其血液中WBC數(shù)目顯著低于其他各組(P＜0.05)。

2.3 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚血清生化指標的影響

飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚血清生化指標的影響見表5。1、2組血清COR含量顯著低于對照組和4組(P＜0.05)。1組血清 LZM活性顯著高于對照組及 2、3、4 組(P＜0.05)。1、2、3和4組血清SOD活性均顯著高于對照組(P＜0.05)。2組血清 ALT、AST活性及 GLU和 TG含量均較低，顯著低于對照組及1組(P＜0.05)。各組血清TP含量無顯著差異(P＞0.05)。3與4組血清TC含量顯著低于對照組及1和2組(P＜0.05)。1、2和4組血清AKP活性顯著高于3組(P＞0.05)。同時，2組血清LDL-C含量顯著低于其他各組(P＜0.05)，而血清HDL-C含量則顯著高于3和4組(P＜0.05)。

表3 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚生長性能的影響Table 3 Effects of chitosan supplementation on growth performance of juvenile GIFT tilapia

表4 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚血常規(guī)指標的影響Table 4 Effects of chitosan supplementation on hematological parameters of juvenile GIFT tilapia

2.4 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚頭腎中免疫相關(guān)基因表達的影響

由圖 1可知，1和2組頭腎 IL-1β和 TNF-α mRNA相對表達量均顯著高于對照組和4組(P＜0.05)。1組頭腎IFN-γmRNA相對表達量顯著高于其他各組(P＜0.05)，隨著幾丁聚糖溶液添加量的增加，IFN-γmRNA相對表達量呈下降趨勢。

2.5 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚感染海豚鏈球菌192 h后累計死亡率的影響

飼喂63 d后，采用6.15×106CFU/mL的海豚鏈球菌菌液進行腹腔注射感染，192 h后累計死亡率結(jié)果見圖2。1、2和3組的累計死亡率介于30.06% ～39.95%，顯著低于對照組的 51.19%與4 組的 77.55%(P＜0.05)。

3 討論

3.1 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚生長性能的影響

飼料中添加幾丁聚糖對水產(chǎn)動物生長的影響已見一些報道，不同魚類之間存在較大差異。研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加幾丁聚糖可以提高鯉魚［6］與牙鲆(Paralichthys olivaceus)的生長速度［17］。然而，Kono等［18］發(fā)現(xiàn)，飼料中添加幾丁聚糖對真鯛(Pagrosomus major)、日本鰻(Anguilla japonica)與 魚(Seriola quinqueracliata)的生長無影響。關(guān)于羅非魚方面的研究僅見Shiau等［19］的報道。Shiau等［19］發(fā)現(xiàn)飼料中添加2% ～10%的幾丁聚糖能夠明顯抑制奧尼羅非魚(O.niloticus×O.aureus)的生長。這可能與從蝦殼、蟹殼獲取的幾丁聚糖分子質(zhì)量巨大、聚合度高、吸收率低，從而制約添加效果有關(guān)。本試驗添加的無拮抗作用的微生物發(fā)酵產(chǎn)生的小分子質(zhì)量幾丁聚糖，具有較高的吸收與利用率。當飼料中幾丁聚糖溶液添加量為20 mL/kg時，63 d后，吉富羅非魚幼魚的生長速度與FE顯著高于對照組，可能是因為適量的幾丁聚糖有助于增加微生物合成，提高酶的活力，促進營養(yǎng)物質(zhì)消化與吸收［20］，從而提高了生長與飼料利用。然而，飼料中幾丁聚糖溶液添加量為40 mL/kg時明顯抑制了吉富羅非魚生長，說明過量的幾丁聚糖可能會影響腸道對于飼料脂肪的消化與吸收，使脂肪通過糞便而排泄到體外［19］。同時，本試驗中發(fā)現(xiàn)，飼料中幾丁聚糖溶液添加量為10和20 mL/kg時能顯著降低吉富羅非魚的HSI與VSI，這在水產(chǎn)健康養(yǎng)殖中具有重要的應(yīng)用前景。

3.2 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚血常規(guī)指標的影響

本試驗中，飼料中幾丁聚糖溶液添加量為10和20 mL/kg時能顯著提高吉富羅非魚幼魚血液RBC數(shù)目。血液RBC數(shù)目的升高可能與魚體的營養(yǎng)狀態(tài)有關(guān)。適量的幾丁聚糖有助于提高魚體的消化與代謝反應(yīng)速率，增加氧氣需要量，從而導(dǎo)致 RBC數(shù)目與 Hb濃度的升高［13］。同時，10 mL/kg添加量下血液WBC數(shù)目顯著高于其他組，這與Lin等［21］的研究結(jié)論相似，說明飼料中添加幾丁聚糖有助于提高魚體的非特異性免疫力。然而，幾丁聚糖溶液添加量為40 mL/kg時血液RBC數(shù)目、Hb濃度和Hct與對照組相比無顯著差異，同時，其血液WBC數(shù)目顯著低于對照組。這說明過量的幾丁聚糖可能會影響細胞代謝與免疫調(diào)控，從而影響了血液中RBC、WBC數(shù)目及Hb濃度與 Hct。

3.3 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚血清生化指標的影響

魚類通過調(diào)節(jié)能量代謝水平來適應(yīng)環(huán)境變化。應(yīng)激狀態(tài)下，為了生長與繁殖，魚體往往需要通過加強代謝活動來維持生理平衡。急性與慢性應(yīng)激均與代謝率的提高相關(guān)聯(lián)［22］。本研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中幾丁聚糖溶液添加量為10和20 mL/kg時能顯著降低血清COR含量，增加生長速度，這可能與魚體的代謝率降低有關(guān)。然而，飼料中幾丁聚糖溶液添加量為40 mL/kg時血清COR含量顯著高于添加量為10 mL/kg時，說明過量的幾丁聚糖可能會引起魚體產(chǎn)生代謝壓力，提高代謝率。

圖1 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚頭腎IL-1β、TNF-α和IFN-γmRNA相對表達量的影響Fig.1 Effects of chitosan supplementation on IL-1β，TNF-α and IFN-γ mRNA relative expression levels in head kidney of juvenile GIFT tilapia

圖2 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚感染海豚鏈球菌192 h后累計死亡率的影響Fig.2 Effects of chitosan supplementation on cumulative mortality of juvenile GIFT against Streptococcus iniae after 192 h

LZM具有殺菌活性，能夠作為一種調(diào)理素激活機體的補體系統(tǒng)與吞噬細胞，從而防止病害入侵［6］。本研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中幾丁聚糖添加量為10 mL/kg時血清LZM活性顯著高于對照組。Geng 等［1］、Gopalakannan 等［6］和常青等［23］也得出類似結(jié)論。血清SOD活性同樣也是一個重要的非特異性免疫指標。本試驗中，飼料中幾丁聚糖溶液添加量為10和20 mL/kg時血清SOD活性顯著高于對照組。Lin等［21］在鯉魚研究中也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)論。因此，飼料中幾丁聚糖溶液添加量為10～20 mL/kg時能夠顯著降低吉富羅非魚幼魚血清COR含量，提高血清LZM和SOD活性。

血清中ALT與AST活性可以作為肝臟損傷的重要指示物［24］，本研究中發(fā)現(xiàn)飼料中幾丁聚糖溶液添加量為20 mL/kg時血清ALT、AST活性顯著低于對照組，說明飼料中幾丁聚糖溶液添加量為20 mL/kg時能夠起到保護肝臟的作用。血清中GLU含量是魚類面對脅迫時代謝調(diào)控的重要指示物。擁擠與溫度脅迫、病菌感染等均能增加吉富羅非魚血清 GLU 含量［15，22，24］。本研究中，飼料中幾丁聚糖溶液添加量為20 mL/kg時血清GLU含量顯著低于對照組，這與其相應(yīng)較低的血清COR含量相一致。血清中TG含量的變化反映了魚體脂肪代謝水平，TG含量升高表明肝臟中脂肪沉積較多，容易引起脂肪肝。本研究中發(fā)現(xiàn)飼料中幾丁聚糖溶液添加量為20 mL/kg時血清TG含量顯著低于對照組，說明適量的幾丁聚糖能提高飼料中脂肪的利用［25］。然而，隨著飼料中幾丁聚糖溶液添加量的增加，魚體的脂肪代謝能力下降，血清TG與HSI均出現(xiàn)上升。

本研究中，各組血清TP指標未出現(xiàn)顯著變化，可能是因為這個指標在血液中相對穩(wěn)定，在本試驗處理下不足以產(chǎn)生明顯改變。AKP是一種溶酶體酶，廣泛存在于各組織細胞中，參與水產(chǎn)動物骨骼礦化與細胞膜轉(zhuǎn)運［24］。血清中AKP活性的增加與促進成骨細胞活性、膽汁郁積或慢性脅迫相關(guān)聯(lián)［26］。飼料中幾丁聚糖溶液添加量為10和20 mL/kg時有較高的血清AKP活性，可能歸因于吉富羅非魚較快的生長速度;然而，飼料中幾丁聚糖溶液添加量為40 mL/kg時有較高的血清AKP活性則與魚體在慢性脅迫下代謝紊亂有關(guān)。LDL-C和HDL-C屬于血脂蛋白，血清LDL-C含量升高易引起TG在血管沉積，并與其他物質(zhì)一起堵塞血管;而HDL-C能將肝臟外的TG運輸?shù)礁闻K分解排出體外［27］。本研究中，飼料中幾丁聚糖溶液添加量為40 mL/kg時，吉富羅非魚幼魚血清TG與LDL-C含量均顯著高于添加量為20 mL/kg時，而血清HDL-C含量則顯著低于添加量為20 mL/kg時，表明過量的幾丁聚糖可能導(dǎo)致魚體脂質(zhì)代謝紊亂與血脂沉積。

3.4 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚頭腎中免疫相關(guān)基因表達的影響

隨著病害發(fā)生與防治研究的進一步深入，許多細胞因子基因的功能研究已廣泛開展。在魚類中，IL-1β、TNF-α 和 IFN-γ 作為重要的免疫調(diào)控細胞因子基因，在機體非特異性免疫方面發(fā)揮著重要作用［28］。關(guān)于幾丁聚糖對魚體細胞因子的研究尚未見到相關(guān)報道，僅在雞［29］與小鼠［30－31］上見到類似研究。殼聚糖是以幾丁聚糖為原料，經(jīng)生物技術(shù)降解而成的低分子質(zhì)量產(chǎn)品。張小邊［30］與紀瑩［31］研究均發(fā)現(xiàn)，飼料中添加殼聚糖后，能夠顯著增強小鼠巨噬細胞IL-1β和TNF-α基因的表達，提高機體的非特異性免疫力。王紅衛(wèi)等［29］也報道，飼料中添加200 mg/kg分子質(zhì)量為3 ku的殼聚糖能顯著提高蛋雞脾臟白細胞介素－2(IL-2)和TNF-αmRNA表達水平。本研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中添加10 mL/kg含小分子質(zhì)量幾丁聚糖的幾丁聚糖溶液能顯著提高吉富羅非魚頭腎IL-1β、TNF-α和 IFN-γmRNA的相對表達量，這該組較高的WBC數(shù)目及血清LZM與SOD活性等相一致。

3.5 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚感染海豚鏈球菌192 h后累計死亡率的影響

不同幾丁聚糖添加量下，吉富羅非魚幼魚飼養(yǎng)63 d后，采用6.15×106CFU/mL的海豚鏈球菌菌液進行腹腔注射感染。192 h后，添加量為10 mL/kg的組累計死亡率最低，其次是添加量為20 mL/kg的組。這與前面討論中提及的幾丁聚糖溶液添加量為10、20 mL/kg時具有較高的血清與頭腎非特異性免疫活性相一致。本試驗中添加的幾丁聚糖是通過微生物發(fā)酵后提取的，具有分子質(zhì)量小、溶解性與吸收性較好等優(yōu)勢，因此作用效果更明顯。

4 結(jié)論

①飼料中幾丁聚糖溶液添加量為20 mL/kg時可以促進吉富羅非魚幼魚生長，提高FE，減少肝臟損傷與血清TG含量，有利于健康養(yǎng)殖。

②飼料中幾丁聚糖溶液添加量為10和20 mL/kg時有助于提高血液 WBC數(shù)量、血清LZM和SOD活性，上調(diào)頭腎細胞免疫因子的表達，降低海豚鏈球菌感染后的累計死亡率。

③本試驗條件下，建議吉富羅非魚幼魚飼料中幾丁聚糖溶液的添加量為10～20 mL/kg。

［1］ GENG X，DONG X H，TAN B P，et al.Effects of dietary chitosan and Bacillus subtilis on the growth performance，non-specific immunity and disease resistance of cobia，Rachycentron canadum［J］.Fish ＆Shellfish Immunology，2011，31(3):400－406.

［2］ HARIKRISHNAN R，KIM J S，BALASUNDARAM C，et al.Immunomodulatory effects of chitin and chitosan enriched diets in Epinephelus bruneus against Vibrio alginolyticus infection［J］.Aquaculture，2012，326－329:46－52.

［3］ EL GHAOUTH A，ARUL J，GRENIER J，et al.Antifungal activity of chitosan on two postharvest pathogens of strawberry fruits［J］.Phytopathology，1992，82(4):398－402.

［4］ GOODAY G W.Aggressive and defensive roles for chitinases［M］//JOLLèS P，MUZZARELLI R A A.Chitin and chitinases.Basel:Birkh?user Verlag，1999，87:157－169.

［5］ TSAI G J，SU W H.Antibacterial activity of shrimp chitosan against Escherichia coli［J］.Journal of Food Protection，1999，62(3):239－243.

［6］ GOPALAKANNAN A，ARUL V.Immunomodulatory effects of dietary intake of chitin，chitosan and levamisole on the immune system of Cyprinus carpio and control of Aeromonas hydrophila infection in ponds［J］.Aquaculture，2006，255(1/2/3/4):179－187.

［7］ 王紅權(quán)，趙玉蓉，余建波.殼聚糖對草魚非特異性免疫功能的影響［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2010，36(2):215－217.

［8］ 金思，龔一富，章麗，等.殼聚糖對香魚溶菌酶活性和hsp70基因表達的影響［J］.生物學(xué)雜志，2012，25(9):11－14.

［9］ 王際英，蔣錦坤，張利民，等.殼聚糖對星斑川鰈幼魚生長、脂肪含量及抗氧化能力的影響［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2013，29(8):64－70.

［10］ 曹志華，嚴書林，羅靜波，等.殼聚糖對異育銀鯽非特異性免疫功能的影響［J］.長江大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2010，7(2):29－31.

［11］ 陳勇，華雪銘，周洪琪，等.殼聚糖和益生菌對異育銀鯽非特異免疫功能及血清甲狀腺激素、皮質(zhì)醇水平的影響［J］.水產(chǎn)學(xué)報，2010，34(5):711－718.

［12］ 茍晨晨.創(chuàng)新生物農(nóng)藥太激的特性及使用［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報，2012，18(11):115－116.

［13］ QIANG J，YANG H，WANG H，et al.Interacting effects of water temperature and dietary protein level on hematological parameters in Nile tilapia juveniles，Oreochromis niloticus(L.)and mortality under Streptococcus iniae infection［J］.Fish ＆Shellfish Immunology，2013，34(1):8－16.

［14］ 強俊，徐跑，何杰，等.氨氮與擁擠脅迫對吉富品系尼羅羅非魚幼魚生長和肝臟抗氧化指標的聯(lián)合影響［J］.水產(chǎn)學(xué)報，2011，35(12):1837－1848.

［15］ 強俊，楊弘，王輝，等.海豚鏈球菌感染對不同品系羅非魚血液生化指標和肝臟HSP70 mRNA表達的影響［J］.水產(chǎn)學(xué)報，2012，36(6):958－968.

［16］ LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2－△△CTmethod［J］.Methods，2001，25(4):402－408.

［17］ CHA S H，LEE J S，SONG C B，et al.Effects of chitosan-coated diet on improving water quality and innate immunity in the olive flounder，Paralichthys olivaceus［J］.Aquaculture，2008，278(1/2/3/4):110－118.

［18］ KONO M，MATSUI T，SHIMIZU C.Effect of chitin，chitosan and cellulose as diet supplements on the growth of cultured fish［J］.Nippon Suisan Gakkaishi，1987，53(1):125－129.

［19］ SHIAU SY，YU Y P.Dietary supplementation of chitin and chitosan depresses growth in tilapia，Oreochromis niloticus×O.aureus［J］.Aquaculture，1999，179(1/2/3/4):439－446.

［20］ NIU J，LIU Y J，LIN H Z，et al.Effects of dietary chitosan on growth，survival and stress tolerance of postlarval shrimp，Litopenaeus vannamei［J］.Aquaculture Nutrition，2011，17(2):e406－e412.

［21］ LIN SM，MAO SH，GUAN Y，et al.Effects of dietary chitosan oligosaccharides and Bacillus coagulans on the growth，innate immunity and resistance of koi(Cyprinus carpio koi)［J］.Aquaculture，2012，342/343:36－41.

［22］ QIANG J，YANG H，WANG H，et al.Physiological responses and HSP70 mRNA expression in GIFT tilapia juveniles，Oreochromis niloticus under short-term crowding［J］.Aquaculture Research，2013，46(2):335－345，doi:10.1111/are.12189.

［23］ 常青，梁萌青，王家林，等.殼聚糖對花鱸生長和非特異性免疫力的影響［J］.海洋水產(chǎn)研究，2006，27(5):17－22.

［24］ 強俊，楊弘，王輝，等.急性溫度應(yīng)激對吉富品系尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)幼魚生化指標和肝臟HSP70 mRNA表達的影響［J］.海洋與湖沼，2012，43(5):943－953.

［25］ DEUCHI K，KANAUCHI O，IMASATO Y，et al.Decreasing effect of chitosan on the apparent fat digestibility by rats fed on a high-fat diet［J］.Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，1994，58(9):1613－1616.

［26］ WOLF P L.Clinical significance of an increased or decreased serum alkaline phosphatase level［J］.Archives of Pathology ＆ Laboratory Medicine，1978，102(10):497－501.

［27］ 文遠紅，曹俊明，黃燕華，等.蠅蛆粉替代魚粉對黃顙魚幼魚生長性能、體組成和血漿生化指標的影響［J］.動物營養(yǎng)學(xué)報，2013，25(1):171－181.

［28］ ?KUGOR S，?KUGOR A，TODOR?EVI C'M，et al.Exposure to lipopolysaccharide induces immune genes in cultured preadipocytes of Atlantic salmon［J］.Fish＆ Shellfish Immunology，2010，29(5):817－824.

［29］ 王紅衛(wèi)，孫敏敏，孟曉，等.不同分子質(zhì)量殼寡糖對蛋雞生產(chǎn)性能、腸道 微生物及脾臟白細胞介素－2和腫瘤壞死因子－α基因表達的影響［J］.動物營養(yǎng)學(xué)報，2013，25(11):2660－2667.

［30］ 張小邊.殼寡糖對巨噬細胞IL-1β、TNF-α基因表達的影響［D］.碩士學(xué)位論文.杭州:浙江大學(xué)，2002.

［31］ 紀瑩.殼寡糖對經(jīng)IFN-γ預(yù)刺激的巨噬細胞IL-1β、TNF-α基因表達的影響［D］.碩士學(xué)位論文.杭州:浙江大學(xué)，2003.