混合乳酸菌對(duì)筍殼青貯品質(zhì)的影響

劉大群 陳文烜 華 穎

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所，浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310021)

青貯是保存飼料作物及牧草采后營養(yǎng)成分的一種常用方法，其基本原理是利用好氣性微生物和植物細(xì)胞本身的呼吸作用使青貯窖內(nèi)盡快形成厭氧環(huán)境，然后乳酸菌在厭氧條件下將飼料中的可溶性糖發(fā)酵成以乳酸為主的有機(jī)酸，形成酸性厭氧環(huán)境從而抑制有害微生物的生長使飼料的營養(yǎng)成分得以保持［1］。

竹筍加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量的廢棄物，主要為筍殼。據(jù)統(tǒng)計(jì)，筍肉與筍殼(含筍蒲頭、下腳料)的比例約為 5.5∶4.5，僅新鮮筍殼年產(chǎn)量就達(dá)1 570萬t，產(chǎn)量巨大。鮮筍殼營養(yǎng)豐富，與鮮筍的營養(yǎng)成分基本相同，主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，并富含19種微量元素和15種游離氨基酸，還含植物甾醇、多糖、黃酮類、酚等多種生物活性物質(zhì)［2］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，筍殼中粗蛋白質(zhì)(CP)含量高于玉米秸稈、小麥秸、稻秸等秸稈飼料，稍低于小麥麩，粗脂肪(EE)、中性洗滌纖維(NDF)、粗灰分(ash)、鈣(Ca)、磷(P)含量與玉米秸稈等常見粗飼料相近［3］。經(jīng)過蒸煮后的筍殼含水量高，在高溫高濕環(huán)境中極易腐敗變質(zhì)，不處理會(huì)污染環(huán)境，且其具有堅(jiān)硬的外殼，特別是筍蔸比例高的筍殼，也無法直接飼喂動(dòng)物。對(duì)筍殼進(jìn)行青貯發(fā)酵，近年來成了研究者們感興趣的研究課題。王力生等［4］通過添加不同種類的青貯劑研究其對(duì)筍殼青貯品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值的影響。也有研究者通過添加麥麩、稻稈的同時(shí)添加氨水、尿素、碳酸氫銨進(jìn)行氨化青貯［5］，為筍殼飼料的開發(fā)做了一些嘗試。本研究參考賈燕芳等［6］的方法并加以改進(jìn)，以10%的麥麩為發(fā)酵介質(zhì)，為便于青貯發(fā)酵過程中同型發(fā)酵和異型發(fā)酵同時(shí)進(jìn)行，以干酪乳桿菌(Lactobacillus casei，Lc)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum，Lp)為發(fā)酵菌株，分析不同乳酸菌配比和乳酸菌混合液接種量以及對(duì)竹筍廢棄物干物質(zhì)(DM)損失的影響，研究不同處理方式對(duì)竹筍廢棄筍殼青貯效果的影響，以期確定竹筍廢棄物青貯的條件，為有效利用筍殼開發(fā)青貯飼料提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)原料

筍殼:新鮮竹筍經(jīng)蒸煮加工后剩下的副產(chǎn)物(筍殼、筍頭)，由杭州富陽千禧筍廠提供，其主要營養(yǎng)成分如下(g/kg，DM 基礎(chǔ)):DM 134.6、粗灰分 49.2、CP 33.4、可溶性碳水化合物(WSC)34.1、NDF 748.0、酸性洗滌纖維(ADF)384.1、粗纖維(CF)60.3、EE 2.7、磷 0.3、鈣 0.3。麥麩:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所提供。

1.1.2 試驗(yàn)菌株

干酪乳桿菌、植物乳桿菌各1株，引自中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)。

1.1.3 主要儀器

氣相色譜儀:GC－14A，日本島津(Shimadza)公司;手持式色差儀:CR－400，日本柯尼卡美能達(dá)公司;數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱:HPX－9162－MBE，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;UDK－127型高效凱式定氮儀:嘉盛(香港)科技有限公司;真空封口機(jī):DZQ－400/500，溫州市兄弟包裝食品機(jī)械有限公司;TM－3000型掃描電鏡:日本日立(HITACH)公司;冷凍干燥:FD－1C－5，北京博醫(yī)康儀器有限公司;超低溫冰箱:MDF－192，日本三洋電機(jī)株式會(huì)社。藥品均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 青貯用乳酸菌混合液的篩選

1.2.1.1 菌株的活化與培養(yǎng)

將保存于冰箱中的植物乳桿菌、干酪乳桿菌取出，待恢復(fù)至常溫后分別接種于制備完成的MRS液體培養(yǎng)基上活化1～2次，然后將活化后的菌株再次分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于35℃條件下培養(yǎng)24～36 h，當(dāng)菌數(shù)密度≥109CFU/g后作為乳酸菌液備用。

1.2.1.2 筍殼原料的處理

將竹筍加工廢棄物干燥至含水量為70%～80%，然后分切至2～3 cm。

1.2.1.3 乳酸菌配比篩選

將1.2.1.1活化后的植物乳桿菌、干酪乳桿菌菌液分別以 1∶0、1∶1、1∶2、2∶1、0∶1 的配比混合，按照干燥后的竹筍廢棄物的15%添加，攪拌均勻后，用真空包裝機(jī)脫氣密封于真空聚乙烯袋中青貯，每袋2 kg，重復(fù)3次，每隔15 d取樣1次測DM含量，計(jì)算DM 損失率，共青貯90 d。

1.2.1.4 乳酸菌混合液接種量篩選

以1.2.1.3得出的最佳配比，按照干燥后的竹筍廢棄物質(zhì)量的5%、10%、15%、20%添加乳酸菌混合液，攪拌均勻后，按照1.2.1.3的方法進(jìn)行青貯。

1.2.2 添加乳酸菌混合液和麥麩的青貯

確定的最佳乳酸菌混合液配比和添加水平后，筍殼(處理同 1.2.1.2)分別添加 10% 麥麩、15%乳酸菌混合液(干酪乳桿菌∶植物乳桿菌為1∶1，菌數(shù)密度≥109CFU/g)、10%麥麩+15%乳酸菌混合液進(jìn)行青貯，以不添加麥麩和乳酸菌的筍殼單獨(dú)青貯為對(duì)照。青貯90 d后，開袋檢測。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 常規(guī)營養(yǎng)成分

按常規(guī)方法［7］測定筍殼青貯前后DM和CP含量，采用 Van Soest等［8］的方法測定 NDF 和ADF含量，按Dubois等［9］方法測定WSC含量。

1.3.2 有機(jī)酸和氨態(tài)氮(NH3-N)

按《青貯飼料質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)(試行)》［10］制取浸提液后，采用 pH計(jì)測定 pH，并采用 GB/T 6432—1994測定青貯筍殼的NH3-N/總氮(TN)。

乙酸、丙酸、丁酸、乳酸含量用氣相色譜法測定。色譜條件:氫火焰離子化檢測儀(FID);分析柱為PEG20M，彈性石英毛細(xì)管柱內(nèi)徑0.53 mm，液膜厚度0.25μm，30 m長;柱溫220℃，汽化室、檢測器溫度260℃;氮?dú)饬魉?.5 kg/cm2，氫氣流速 0.6 kg/cm2，空氣流速 0.5 kg/cm2;分流比為30 ∶1。

1.3.3 感觀評(píng)價(jià)

筍殼經(jīng)青貯后，感官性狀評(píng)價(jià)參考《青貯飼料質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)(試行)》［10］進(jìn)行，采用色差計(jì)進(jìn)行色澤測定。L*值表示明亮程度［11］(0 ～100)，數(shù)值越大表示越亮。a*正值表示紅色，正值越大紅色越深;負(fù)值表示綠色，負(fù)值越小則綠色越深。b*正值表示黃色，正值越大黃色越深;負(fù)值表示藍(lán)色，負(fù)值越小則藍(lán)色越深?！鱁值表示所測樣品與鮮筍殼之間的色差值，其公式為:

式中:L、a、b為新鮮筍殼顏色測定值，L*、a*、b*為處理后的筍殼顏色測定值。

以上每個(gè)處理方式取樣3次，每樣不同角度旋轉(zhuǎn)3次分別讀數(shù)，取9次讀數(shù)的平均值。

1.3.4 表面結(jié)構(gòu)觀察

依筍殼青貯情況，挑選顏色為黃色、有光澤、質(zhì)地松軟的青貯筍殼進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)筍殼的大小、部位等選取基本相同的，切取中央面積(0.5～1.0)cm×(0.5 ～1.0)cm、厚約1 mm 的筍殼。將筍殼放在載玻片上并放入－70℃超低溫冰箱冷凍，真空冷凍干燥24 h后將筍殼用導(dǎo)電膠黏固定在樣品臺(tái)中央，在SBC－12型離子濺射儀上噴鍍金屬膜，制成掃描電鏡樣品，然后將樣品移入掃描電鏡觀察、拍照，方法參照文獻(xiàn)［12］。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 17.0和 Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及作圖，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，顯著水平為 P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 筍殼青貯用乳酸菌混合液的篩選

2.1.1 菌株配比

由表1可知，接種乳酸菌后，DM損失率隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增加。當(dāng)青貯15 d時(shí)，不同菌株配比對(duì)DM損失率的影響基本相當(dāng)，之后DM損失率差距開始逐漸拉大。當(dāng)植物乳桿菌∶干酪乳桿菌=1∶1時(shí)，相比于其他4種配比DM損失率增加較為平緩，青貯發(fā)酵DM損失率最小。單菌株青貯DM損失率都要高于組合復(fù)配菌株。所以試驗(yàn)選取植物乳桿菌∶干酪乳桿菌=1∶1為最佳配比。

2.1.2 乳酸菌混合液接種量

由表1可知，不同乳酸菌混合液接種量的DM損失率總體趨勢均隨著青貯時(shí)間的延長而增加。4個(gè)接種量中，接種量5%的DM損失率最大，這可能是由于接種量小，乳酸菌沒有快速的成為優(yōu)勢發(fā)酵菌，雜菌的生長利用了DM。另外，接種量5%和10%之間的差異總體要低于15%和20%之間的差異，4個(gè)處理在青貯90 d后DM損失率基本相當(dāng)。綜合考慮，選擇15%為乳酸菌混合液接種量。

表1 不同菌株配比和乳酸菌混合液接種量對(duì)筍殼青貯過程中DM損失率的影響Table 1 Effects of different proportions of bacteria and inoculation levels of LAB mixture on DM loss rate of bamboo shoots shell during silage %

2.2 添加乳酸菌混合液和麥麩對(duì)青貯筍殼常規(guī)營養(yǎng)成分含量的影響

由表2可見，經(jīng)90 d厭氧發(fā)酵，相比于對(duì)照，另外3個(gè)處理青貯筍殼中DM、WSC含量均顯著下降(P＜0.05)，而添加10%麥麩+15%乳酸菌混合液青貯以上含量最低，CP含量顯著高于對(duì)照(P＜0.05)。這說明經(jīng)過90 d的青貯發(fā)酵，添加麥麩增加營養(yǎng)成分含量的同時(shí)，隨著乳酸菌的大量繁殖，乳酸菌能夠利用較多的WSC，而導(dǎo)致了DM的損失。另外，經(jīng)過90 d青貯發(fā)酵后，相比于對(duì)照，添加10%麥麩+15%乳酸菌混合液處理也顯著降低了NDF含量(P＜0.05)，ADF 含量有降低趨勢(P＞0.05)，而單獨(dú)添加10%麥麩只顯著降低了NDF含量(P＜0.05)，ADF含量顯著增加(P＜0.05)。

表2 添加乳酸菌混合液和麥麩對(duì)青貯筍殼常規(guī)營養(yǎng)成分含量的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 2 Effects of supplementations of LAB mixture and wheat bran on common nutrient composition contents of bamboo shoots shell silage(DM basis) g/kg

2.3 添加乳酸菌混合液和麥麩對(duì)青貯筍殼有機(jī)酸和NH 3-N含量的影響

由表3可知，添加10%麥麩+15%乳酸菌混合液處理pH最低，顯著低于其他處理(P＜0.05)。對(duì)照處理中NH3-N/TN顯著高于其他處理(P＜0.05)，丁酸含量也顯著高于其他處理(P＜0.05)，對(duì)照處理乳酸含量顯著低于其他處理(P＜0.05)，15%乳酸菌混合液、10%麥麩+15%乳酸菌混合液處理乳酸含量較高。這說明筍殼以乳酸菌發(fā)酵為主。

表3 添加乳酸菌混合液和麥麩對(duì)青貯筍殼有機(jī)酸和氨態(tài)氮含量的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 3 Effects of supplementations of LAB mixture and wheat bran on organic acid and NH3-N contents of bamboo shoots shell silage(DM basis)

2.4 添加乳酸菌混合液和麥麩對(duì)青貯筍殼表面結(jié)構(gòu)的影響

筍殼微生物發(fā)酵預(yù)處理后其細(xì)胞壁成分被降解，會(huì)導(dǎo)致筍殼表面的物理結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。如圖1所示，不同處理筍殼表面結(jié)構(gòu)也不同。未經(jīng)微生物預(yù)處理的青貯筍殼(對(duì)照)的表面結(jié)構(gòu)緊密規(guī)整，結(jié)構(gòu)致密，而試驗(yàn)處理青貯筍殼厭氧發(fā)酵后筍殼表面都出現(xiàn)了鋸齒蝕痕，特別是添加10%麥麩+15%乳酸菌混合液處理的，其表面結(jié)構(gòu)已被破壞，存在很多的裂縫和孔洞。

2.5 添加乳酸菌混合液和麥麩對(duì)青貯筍殼感官評(píng)價(jià)的影響

由表4可知，各處理的青貯筍殼亮度L*值、紅度a*值和黃度b*值有較大變化。其中，添加10%麥麩+15%乳酸菌混合液處理b*值最大，顏色黃，對(duì)照處理L*值最小，所以顏色偏黑。同時(shí)對(duì)△E值的分析可看出，各處理之間有顯著差異(P＜0.05)。相比于新鮮筍殼，色澤指標(biāo)均發(fā)生了較大的變化，10%麥麩+15%乳酸菌混合液處理△E值最小。

圖1 添加乳酸菌混合液和麥麩對(duì)青貯筍殼表面結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of supplementations of LAB mixture and wheat bran on surface structure of bamboo shoots shell silage(5 000×)

表4 添加乳酸菌混合液和麥麩對(duì)青貯筍殼感官評(píng)價(jià)的影響Table 4 Effects of supplementation of LAB mixture and wheat bran on sensory evaluation of bamboo shoots shell silage

3 討論

3.1 乳酸菌混合液對(duì)青貯筍殼DM損失率的影響

DM回收率是評(píng)價(jià)青貯飼料質(zhì)量的重要指標(biāo)，在保證青貯飼料的色澤、氣味和質(zhì)地結(jié)構(gòu)良好的前提下，DM回收率越高，也就是DM損失越少，說明青貯料發(fā)酵過程中碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)的降解越少。據(jù) Whiter等［13］研究報(bào)道，在青貯過程中，對(duì)DM含量高的青貯原料，發(fā)酵菌株以液體形式添加比以固體形式添加更加有效，且液體發(fā)酵添加形式比固體發(fā)酵添加形式乳酸菌生長更快，發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸更多，pH下降的更快。本試驗(yàn)中，在接種不同乳酸菌發(fā)酵菌株以及不同接種量后，DM損失率隨著青貯發(fā)酵時(shí)間增加都有明顯的增加，且接種量5%的DM損失率最大。這可能與不同青貯發(fā)酵階段微生物活動(dòng)有關(guān)。在青貯發(fā)酵后期，由于乳酸菌的大量積累，其在厭氧、微酸性環(huán)境和較低溫度的條件下生長繁殖旺盛，通過利用原料中豐富的碳水化合物作為碳源產(chǎn)生乳酸、醋酸、丁酸等酸類物質(zhì)，減少了由于雜菌發(fā)酵而引起的DM損失。另外，本試驗(yàn)中按植物乳桿菌∶干酪乳桿菌=1∶1接種時(shí)，DM損失率最小，這可能是在青貯過程中同型發(fā)酵和異型發(fā)酵同時(shí)進(jìn)行，一定程度上可以保證營養(yǎng)和提高有氧穩(wěn)定性［14］。因此，乳酸菌能否快速地成為優(yōu)勢發(fā)酵菌，從而有效地遏制不耐酸的腐敗菌生長是青貯飼料能否成功的關(guān)鍵。

3.2 乳酸菌混合液對(duì)筍殼青貯品質(zhì)的影響

經(jīng)過蒸煮后的筍殼青貯含水量高，WSC含量低，這一特點(diǎn)將不利于筍殼直接進(jìn)行青貯。而WSC是青貯飼料發(fā)酵過程中乳酸菌繁殖發(fā)酵的基質(zhì)，在原料中足夠的WSC可確保乳酸菌快速大量地形成乳酸，促使pH迅速下降，有效地抑制不良發(fā)酵，提高青貯的品質(zhì)和成功率。在青貯飼料中，pH、NH3-N/TN和有機(jī)酸含量是評(píng)定品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)。一般認(rèn)為pH、NH3-N/TN和有機(jī)酸中丁酸含量越低，乳酸占總有機(jī)酸比例越高，說明青貯過程中乳酸菌發(fā)酵占優(yōu)勢，青貯料品質(zhì)就好［15］。添加高密度的乳酸菌可以保證在青貯的初期發(fā)酵所需的乳酸菌數(shù)量，增加乳酸含量，能盡快讓青貯原料進(jìn)入乳酸發(fā)酵階段，從而pH迅速下降，減少青貯飼料中NH3-N/TN，影響蛋白質(zhì)分解作用，而降低丁酸含量，提高青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)和適口性。本試驗(yàn)中，添加10%麥麩+15%乳酸菌混合液處理降低了NDF和ADF含量的同時(shí)，顯著降低了青貯飼料pH、NH3-N/TN及丙酸含量，丁酸的含量大幅下降而乳酸的含量大幅提高。這可能由于添加外源乳酸菌直接增加了乳酸菌數(shù)量，從而抑制其他雜菌的繁殖生長，減少青貯原料的蛋白質(zhì)消耗，同時(shí)加快了乳酸菌對(duì)可溶性糖類的分解利用。

3.3 乳酸菌混合液對(duì)筍殼青貯感官評(píng)價(jià)的影響

在青貯飼料調(diào)制完成后，應(yīng)當(dāng)正確地評(píng)定其營養(yǎng)價(jià)值和發(fā)酵質(zhì)量。在生產(chǎn)實(shí)踐中常常采用一些簡單而直觀的方法來判斷青貯質(zhì)量，例如pH、色澤、氣味和質(zhì)地等。品質(zhì)優(yōu)良的青貯通常具有輕微的酸味和水果香味(由于存在乳酸所致);霉變說明壓得不實(shí)，空氣進(jìn)入了青貯容器(或青貯堆)內(nèi)，引起飼料霉變;陳腐的脂肪臭味以及令人作嘔的氣味，說明產(chǎn)生了很多丁酸［16］。本試驗(yàn)中，添加10%麥麩+15%乳酸菌混合液處理與對(duì)照處理從青貯料感官性狀、色差值以及表面結(jié)構(gòu)結(jié)果來看，差異均較明顯。相比于對(duì)照處理筍殼的褐色、散發(fā)氨味、有滲濾液等感官性狀，添加10%麥麩+15%乳酸菌混合液處理具有散發(fā)酸香味、質(zhì)地松軟且保持完整、無黏手現(xiàn)象、色澤為黃色等特點(diǎn)。這一結(jié)果與《青貯飼料質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)(試行)》［10］以及《青貯詞料的合理調(diào)制與質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)》［16］中青貯飼料的氣味、顏色、質(zhì)地綜合評(píng)定相吻合。

4 結(jié)論

添加15%植物乳桿菌∶干酪乳桿菌為1∶1的混合液以及10%的麥麩能改善筍殼青貯品質(zhì)，可以獲得較理想的青貯筍殼飼料，青貯筍殼呈亮黃色，散發(fā)酸香味，質(zhì)地松軟，無黏手現(xiàn)象。

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