• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    山羊瘤胃中單寧降解菌的分離、篩選和鑒定

    2015-12-21 08:24:34李興芳張勝男徐高蹺汪珊如王士長梁世忠
    動物營養(yǎng)學(xué)報 2015年6期
    關(guān)鍵詞:單寧瘤胃克隆

    李興芳 徐 雯 張勝男 徐高蹺 汪珊如 王士長 梁世忠*

    (1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,南寧 530005;2.南寧學(xué)院,南寧 530200)

    單寧是是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子,味澀,并且具有抑菌作用,影響動物對營養(yǎng)物質(zhì)的利用[1-3]。降解單寧的微生物能夠分泌一種酶,此酶可以對單寧產(chǎn)生抗性并使單寧發(fā)生降解[4-7]。

    一些家畜和野生動物(如綿羊、山羊、鹿和麋鹿)的消化道中有單寧降解菌,有助于這些動物利用高單寧飼料。Skene等[8]于1995年首次從飼喂富含單寧牧草的山羊瘤胃中分離出了的厭氧菌反芻月形單胞菌(Selenomonas ruminantium),該菌不僅能夠降解單寧,還可以利用其降解產(chǎn)物;Odenyo等[9]在一些非洲反芻動物的瘤胃液中也發(fā)現(xiàn)耐受單寧或降解單寧的微生物;Goel等[10]從沒有采食含單寧飼糧的山羊糞便中分離到6株可以分解單寧-蛋白質(zhì)結(jié)合物的革蘭氏陽性球菌(gram-positive cocci),并通過分析證明它們屬于不同的D型糞鏈球菌(Enterococcus faecalis),其中降解單寧能力最強的糞鏈球菌GF1在含單寧4%的培養(yǎng)基上也可以正常生長;Singh[11]從放養(yǎng)山羊瘤胃中分離出16株厭氧單寧降解菌,其中1株菌能夠耐受3.5%的單寧酸,并且能將單寧降解為沒食子酸和焦棓酸,經(jīng)分子生物學(xué)法鑒定為路德維希腸桿菌(Enterobacter ludwigii)GRT-1。

    本試驗從采食富含單寧的植物的原生態(tài)山羊瘤胃中分離好氧及兼性厭氧的細菌,通過單寧濃度耐受培養(yǎng)基和單寧酶活力鑒定培養(yǎng)基篩選降解單寧的細菌,并通過16S rDNA基因序列測定分析對4株菌進行初步鑒定,再將菌株在單寧濃度為0.5%、1%、1.5%的單寧酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng),進行胞內(nèi)酶活力測定,以期為單寧降解菌在實際生產(chǎn)中應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 試驗試劑及主要來源

    沒食子酸丙酯:購于上海生工生物工程有限公司。單寧酸(分子質(zhì)量1 701.20 ku)、蛋白胨、牛肉浸膏、瓊脂、Taq酶、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、X-gal、DNA Marker DL2000、胰蛋白胨、酵母提取物、氨芐青霉素(Sigma分裝)、氯化鈉、磷酸氫二鉀、乙二胺四乙酸、氫氧化鈉、飽和酚、氯仿、異戊醇、蛋白酶K、溶菌酶、十二烷基硫酸鈉、檸檬酸、Tris、冰乙酸、無水乙醇均為分析純,購于上海生工生物工程有限公司。引物:上海生工生物工程有限公司合成。

    1.1.2 樣品采集

    采集廣西省天然山林放牧養(yǎng)殖的隆林山羊瘤胃,在無菌環(huán)境下刮取瘤胃上皮和取瘤胃內(nèi)容物,過濾將樣品的固液相分離,立即用于菌株分離。

    1.1.3 培養(yǎng)基

    單寧濃度耐受培養(yǎng)基:牛肉浸膏2.5 g,蛋白胨 5 g,瓊脂 6 g,氯化鈉 2.5 g,磷酸氫二鉀 1 g,50 mL滅菌瘤胃液,超純水定容到450 mL,pH 7.2,滅菌,分別添加10%、20%、30%、40%的滅菌單寧酸水溶液50 mL,混合。得到的培養(yǎng)基單寧濃度分別為1%、2%、3%、4%。另配制用蒸餾水代替單寧酸水溶液的不含單寧的普通培養(yǎng)基。

    單寧酶鑒定培養(yǎng)基a:牛肉浸膏2.5 g,氯化鈉2.5 g,磷酸氫二鉀 1 g,蛋白胨 5 g,瓊脂 6 g,50 mL滅菌瘤胃液,超純水定容到400 mL,pH 4.5,滅菌,加15%的滅菌單寧酸水溶液50 mL,加0.04%的溴酚藍水溶液50 mL,混合。

    單寧酶鑒定培養(yǎng)基b:瓊脂6 g,50 mL滅菌瘤胃液,超純水定容到 400 mL,pH 4.5,滅菌,加15%的滅菌單寧酸水溶液50 mL,加0.04%的溴酚藍水溶液50 mL,混合。

    單寧酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基(液體):牛肉浸膏2.5 g,蛋白胨5 g,氯化鈉 2.5 g,磷酸氫二鉀 1 g,50 mL滅菌瘤胃液,超純水定容到 450 mL,pH 7.2,滅菌,分別添加5%、10%、15%的滅菌單寧酸水溶液50 mL,混合。得到的培養(yǎng)基單寧濃度分別為0.5% 、1% 、1.5% 。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 菌株篩選[11]

    1.2.1.1 初篩

    設(shè) A、B、C、D 4組,每組3個重復(fù)。A、B 組接種瘤胃液,C、D組接種瘤胃固相內(nèi)容物;A、C組0.27×10-3×g 37 ℃ 搖床過夜培養(yǎng);B、D 組放于37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。然后將A、B、C、D 4組富集培養(yǎng)的細菌接種到24個不加單寧的普通培養(yǎng)基上,37℃靜置培養(yǎng)。再將24個培養(yǎng)基上的細菌轉(zhuǎn)接到含不同單寧濃度耐受培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),將菌落純化后,保存。

    1.2.1.2 復(fù)篩

    1)將篩選出的幾株菌分別接種到含單寧酶鑒定培養(yǎng)基a和b上,當(dāng)菌落周圍顏色變?yōu)辄S色,則證明有單寧酶產(chǎn)生,觀察顏色的變化,從而確定出酶活力較強的幾株菌。

    2)將1)中篩出的幾株菌分別接種到不同單寧酶鑒定培養(yǎng)基上培養(yǎng),比較酶活力。

    3)將篩選出活力較高的菌株,分別接種于10 mL單寧酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,37 ℃ 0.27×10-3×g振蕩培養(yǎng)16~24 h,-80℃保存,用于菌株鑒定和酶活力測定。

    1.2.2 菌種鑒定

    1.2.2.1 所篩菌株基因組DNA的提取、PCR擴增

    提取所篩選菌株的基因組DNA,選用細菌通用引物,上游27F:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTGAG-3';下游 1492R:5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。對山羊瘤胃內(nèi)單寧降解菌的基因組DNA進行PCR擴增,終體積為25μL,PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,72 ℃ 10 min,共 30 個循環(huán)[12]。1.2.2.2 PCR 產(chǎn)物的電泳檢測

    取2~3μL產(chǎn)物與1μL溴酚藍上樣緩沖液混合,上樣到1%的瓊脂糖凝膠孔中,在100 V 60 mA條件下,電泳60 min,放置于溴化乙錠(EB)中染色15~20 min,并在紫外分析儀下觀測,然后放于凝膠成像系統(tǒng)中拍照,保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2.3 PCR 產(chǎn)物的克隆及測序

    純化與載體連接:采用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒進行純化。連接反應(yīng)采用pGEM-T載體試劑盒,將準(zhǔn)備好的反應(yīng)體系放于4℃孵育過夜,得到最大數(shù)目的轉(zhuǎn)化菌落。

    連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:1)輕微離心使連接產(chǎn)物匯集到管底,取2μL連接產(chǎn)物加到置于冰上的1.5 mL離心中,向管中加入50μL的DH5α感受態(tài)細胞,輕輕混勻,并在冰浴中放置30min;2)42℃水浴中熱激45 s后快速轉(zhuǎn)至冰浴中2 min,注意在此過程不要搖動離心管;3)向離心管中加入滅菌的500μL LB液體培養(yǎng)基(不含抗生素),混合均勻后在37℃ 0.76×10-3×g條件下培養(yǎng)1 h,復(fù)蘇細菌;4)分別取200μL已轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基涂到2個LB/氨芐/IPTG/X-Gal平板上,37℃正向放置1~2 h后,倒置過夜培養(yǎng);5)將過夜培養(yǎng)的平板放于4℃2~3 h后,每個平板挑取5個白色菌落分別接種于10 mL含50μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)過夜。

    陽性克隆的鑒定及測序:采用一種簡單的酚/氯仿/異戊醇抽提法,將重組質(zhì)粒DNA抽提出來,鑒定出陽性重組子。鑒定出的陽性克隆直接進行菌液PCR,再一次鑒定陽性克隆,將菌液直接送于華大基因公司測序。

    1.2.3 單寧酶活力測定

    采用沒食子酸丙酯作為單寧酶的底物。沒食子酸丙酯的濃度會隨著酶促反應(yīng)的進行而變小,從而引起在270 nm處的吸光值(OD)降低,根據(jù)沒食子酸丙酯吸光值的變化,計算出單寧酶的活力。將篩選得到的菌株接種到單寧酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基(單寧濃度0.5%、1%和1.5%)中,37 ℃,120 r/min 震蕩培養(yǎng),待 OD600nm約為0.4~0.6時,收集菌體,加入36 μL的溶菌酶(50 mg/mL)和3μL的Triton-100,37℃水浴15 min后,制得粗酶液,立即進行酶活力測定。酶活力的定義:40℃反應(yīng)條件下,100μL酶液每分鐘使沒食子酸丙酯溶液在270 nm處減少0.01個吸光度值定義為1個酶活力單位。

    酶活力計算公式:

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌株分離篩選結(jié)果

    經(jīng)過初篩和復(fù)篩,選出了4株菌,編號為No.1、No.2、No.3、No.4,結(jié)果表明,4 株菌對單寧的最大耐受濃度均為4%,但No.2、No.3 2株菌的長勢比No.1和No.4要好一些,通過單寧酶鑒定培養(yǎng)基看出菌株可以產(chǎn)生單寧酶,并且可以看出細菌在只有瓊脂和溴酚藍的單寧酶鑒定培養(yǎng)基b上與在含營養(yǎng)物質(zhì)和溴酚藍的單寧酶鑒定培養(yǎng)基a上相比生長緩慢,菌落周圍變色緩慢,并且變色范圍比較小,因此說明直接利用單寧作為營養(yǎng)物質(zhì)的能力很低。部分菌株的單寧耐受情況見圖1,部分菌株單寧酶初步鑒定結(jié)果如圖2。

    圖1 No.3菌株在不同單寧濃度耐受培養(yǎng)基上的生長狀況Fig.1 The growth status of the No.3 strain on tolerance culture medium with different tannic concentration

    圖2 No.2菌株在單寧酶鑒定培養(yǎng)基a(A)和b(B)上的生長情況Fig.2 The growth status of No.2 strain on tannase identification culture mediums a(A)and b(B)

    2.2 16S r DNA基因組序列測序結(jié)果

    將測序所得序列提交至GenBank進行Blast序列同源性比對。選取若干同源性較高的16S rDNA序列經(jīng)ClustalX1.84程序進行比對,采用 Kimura4參數(shù)模型計算進化距離通過鄰接法和最大簡約法,運用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖3所示。No.1菌株與登錄號為EF192136的細菌親緣關(guān)系最近,該菌屬于腸桿菌目,腸桿菌科,普羅威登斯菌屬,進一步比對得出No.1菌株屬于產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providencia alcalifaciens);No.2菌株與4株細菌親緣關(guān)系均比較近,基本都屬于伯克氏菌目,但經(jīng)分析判斷No.2菌株與克斯特菌屬親緣關(guān)系更為接近,因此屬于克斯特菌(Kerstersia);No.3菌株介于2大分支菌之間,但是更接近于下面1個分支菌,該菌也屬于普羅威登斯菌屬,通過比對得知No.3菌株為Providencia vermicola;No.4菌株與11株細菌親緣關(guān)系均較近,均屬于假單胞菌菌科,經(jīng)進一步分析得知屬于銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

    圖3 4株細菌與其同源細菌的進化樹Fig.3 Phylogenetic trees of the four strains and homologous bacteria

    2.3 4株篩選菌株的單寧酶活力

    由表1可知,各單寧酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基上均為No.2菌株的酶活力最高。各單寧濃度組酶活力比較得知,除了No.1菌株在0.5%組的單寧酶活力最大外,其他3株菌均在1%組具有最大酶活力,且這3株菌在1%組的酶活力均顯著高于0.5%與1.5%組(P<0.05);通過 0.5%組與1.5%組比較得知,除了No.4菌株在0.5%組低于1.5%組外,其他3株都與之相反。以上分析表明,單寧酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基1%的單寧濃度對于菌株單寧酶的產(chǎn)生具有很好的誘導(dǎo)作用,而0.5%和1.5%濃度組誘導(dǎo)作用略差,原因可能是濃度太小對菌株的刺激作用太小,而濃度太大又會對菌株生長及單寧酶的產(chǎn)生起到抑制作用。

    表1 單寧酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基單寧濃度對4株細菌酶活力的影響Table 1 Effects of tannin concentration of tannase inductive culture medium on enzyme activities of the four screened strains U/mL

    3 討論

    培養(yǎng)基的成分對于細菌生長所需的培養(yǎng)基,一般采用目前通用的細菌生長培養(yǎng)基即可,但是鑒于本試驗中所篩菌株的特殊性,考慮到山羊瘤胃液中可能存在菌株生長所需的特殊物質(zhì),因此在配制培養(yǎng)基時,均加入了10%的滅菌山羊瘤胃液,通過比較顯示,加入瘤胃液后,菌株的生長狀況確實要好一些。

    本試驗所篩選的菌株能夠在含單寧的培養(yǎng)基上生長,只能說明菌株能夠抵抗單寧的抑菌作用,并不能說明可以產(chǎn)生單寧酶而降解單寧,因此對于單寧降解菌的篩選需要一定的方法。目前所建立的篩選鑒定方法都是針對青霉與曲霉等真菌的。1977年Bradoo等[13]在培養(yǎng)基中只加入1%的單寧和3%的瓊脂,將菌株點種在平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后,觀察菌落周圍的透明圈,把透明圈直徑與菌落直徑的比值作為篩選鑒定的標(biāo)準(zhǔn)。2001年,郭魯宏[14]改進了篩選鑒定方法,在上述培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為0.004%的溴酚藍,利用菌落周圍培養(yǎng)基顏色變化范圍的大小與變色的程度直觀地判斷菌株是否可以產(chǎn)生單寧酶,以及產(chǎn)酶能力的大小。2008年,保玉心[15]也利用這種方法對其試驗菌株做了篩選鑒定,效果比較明顯,從而更好地證明了這種方法的可行性。因為本試試篩選的是細菌,因此針對細菌的生長需要,培養(yǎng)基也需要相應(yīng)改變,本試驗培養(yǎng)基需要在細菌生長培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入1%的單寧和0.004%的溴酚藍進行培養(yǎng)。

    目前國內(nèi)外對于單寧酶基因的報道都比較少,而現(xiàn)在可用于克隆表達且相對比較成功的一般是真菌的單寧酶基因,許彬[16]將米曲霉(Aspergillus oryzae)中單寧酶基因克隆于大腸桿菌和畢赤酵母中,并得到成功表達;黃小鳳等[17]又將Aspergillus oryzae中單寧酶基因成功的克隆表達在了黑曲霉中。對于細菌的單寧酶基因克隆表達也有相關(guān)報道,Noguchi等[18]從路鄧葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)中克隆了能夠編碼613個氨基酸,并能夠表達單寧酶活力的基因tanA,同時他們在Staphylococcus lugdunensis、植物乳桿菌(L.plantarum)、戊糖乳桿菌(L.pentosus)和解沒食子酸鏈球菌(S.gallolyticus)等菌種中用tanA目標(biāo)探針進行了Southen blot印記分析,發(fā)現(xiàn)探針只在鄧葡萄球菌中有明確反應(yīng);Rodrígueza 等[19]從植物乳酸菌 ATCC 14917T中克隆出了單寧酶的編碼基因tanLpl,并且在所有L.plantarum中進行了tanLpl基因的PCR擴增,得到了預(yù)期片段大小的目的DNA片段,在L.plantarum、類植物乳桿菌(L.paraplantarum)、L.pentosus和S.gallolyticus中進行了 Southen blot印記分析,結(jié)果表明在前2種菌中都有明顯反應(yīng)。本試驗對于單寧酶基因的擴增,所得的結(jié)果并不理想,因此后續(xù)試驗還可以通過現(xiàn)有報道的產(chǎn)單寧酶菌株的單寧酶基因序列來設(shè)計合適的引物,擴增所得菌株的單寧酶基因序列,或者應(yīng)用已知單寧酶基因片段做探針,對所篩菌的DNA進行Southern印跡雜交,從而找到所篩菌株的單寧酶基因,為以后將單寧酶基因克隆到合適的有益菌中,用于發(fā)酵香蕉葉來降低單寧含量或用于食品、化妝品等行業(yè)做準(zhǔn)備。

    4 結(jié)論

    ①山羊瘤胃中存在能夠降解單寧的菌株,經(jīng)分子生物學(xué)法鑒定,分別為Providencia alcalifaciens、Kerstersia、Providencia Vermicola 和 Pseudomonas aeruginosa。

    ②篩選出的4株菌單寧酶活力均較高,對單寧的最大耐受度均可達到4%。

    [1] FRAZIER R A,DEAVILLE E R,GREEN R J,et al.Interactions of tea tannins and condensed tannins with proteins[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2010,51(2):490-495.

    [2] GETACHEW G,PITTROFF W,PUTNAM D H,et al.The influence of addition of gallic acid,tannic acid,or quebracho tannins to alfalfa hay on in vitro rumen fermentation and microbial protein synthesis[J].Animal Feed Science and Technology,2008,140(3/4):444-461.

    [3] LI M S,YAO K,HE Q,et al.Biodegradation of gallotannins and ellagitannins[J].Journal of Basic Microbiology,2006,46(1):68-84.

    [4] FIELD J A,LETTINGA G.Toxicity of tannic compounds to microorganisms[M]//HEMINGWAY R W,LAKES P E.Plant Polyphenols.New York:Plenum Press,1992:673-692.

    [5] GOLDSTEIN J L,SWAIN T.The inhibition of en-zymes by tannins[J].Phytochemistry,1965,4(1):185-192.

    [6] CLOUTIER M M,GUERNSEY L.Tannin inhibits adenylate cyclase in airway epithelial cells[J].The American Journal of Physiology,1995,268(5):815-855.

    [7] OH H,HOFF JE.Effect of condensed grape tannins on the in vitro activity of digestive proteases and activation of their zymogens[J].Food Science,1986,51(3):577-580.

    [8] SKENE IK,BROOKERJD.Characterization of tannin acylhydrolase activity in the ruminal bacterium,Selenomonas ruminantium[J].Anaerobe,1995,1(6):321-327.

    [9] ODENYO A A,MCSWEENEY C A,PALMER B,et al.In vitro screening of rumen fluid samples from indigenous African ruminants provides evidence for rumen fluid with superior capacities to digest tannin-rich fodders[J].Australian Journal of Agricultural Research,1999,50(7):1147-1157.

    [10] GOEL G,PUNIYA A K,SINGH K.Phenotypic characterization of tannin-protein complex degrading bacteria from faeces of goat[J].Small Ruminant Research,2007,69(1/2/3):217-220.

    [11] SINGH B,BHAT T K,SHARMA O P,et al.Isolation of tannase-producing Enterobacter ludwigii GRT-1 from the rumen of migratory goats[J].Small Ruminant Research,2011,102(2/3):172-176.

    [12] 張武先,王金華,熊智,等.思茅松毛蟲2齡幼蟲腸道好氧細菌的篩選及毒力測定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(28):17288-17290.

    [13] BRADOO S,GUPTA R,SAXENA R K.Screening of extracellular tannase-producing fung:development of a rapid and simple plate assay[J].Journal of General and Applied Microbiology,1996,42(4):325-329.

    [14] 郭魯宏.單寧酶的制備及酶法制取沒食子酸及其丙酯研究[D].博士學(xué)位論文.沈陽:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所,1999.

    [15] 保玉心.固體發(fā)酵黑曲霉產(chǎn)單寧酶的研究[D].碩士學(xué)位論文.貴陽:貴州大學(xué),2008.

    [16] 許彬.米曲霉Aspergillus oryzae中單寧酶基因的克隆及其在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達[D].碩士學(xué)位論文.南寧:廣西大學(xué),2003.

    [17] 黃小鳳,韋宇拓,韋傳東,等.單寧酶基因在黑曲霉ST31中的克隆與表達[J].中國生物工程雜志,2005,25(9):74-77.

    [18] NOGUCHI N,OHASHI T,SHIRATORI T,et al.Association of tannase-producing Staphylococcus lugdunensis with colon cancer and characterization of a novel tannase gene[J].Journal of Gastroenterology,2007,42(5):346-351.

    [19] RODRíGUEZA H,DE LAS RIVASA B,GóMEZCORDOVéSB C,et al.Characterization of tannase activity in cell-free extracts of Lactobacillus plantarum CECT 748T[J].International Journal of Food Microbiology,2008,121(1):92-98.

    猜你喜歡
    單寧瘤胃克隆
    中西醫(yī)結(jié)合治療牛瘤胃酸中毒
    克隆狼
    瘤胃調(diào)控劑對瘤胃發(fā)酵的影響
    中國飼料(2022年5期)2022-04-26 13:42:34
    浙江:誕生首批體細胞克隆豬
    葡萄酒的靈魂
    ——“單寧”
    山東國資(2020年6期)2020-07-09 09:28:34
    抗BP5-KLH多克隆抗體的制備及鑒定
    羊瘤胃臌氣的發(fā)生及防治
    如何防治牛的瘤胃積食
    Galectin-7多克隆抗體的制備與鑒定
    香蕉皮單寧的提取工藝研究
    18禁国产床啪视频网站| 男女下面进入的视频免费午夜| 色综合婷婷激情| 啦啦啦韩国在线观看视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 精品第一国产精品| 欧美中文综合在线视频| 狂野欧美激情性xxxx| 国产精品亚洲av一区麻豆| 成人av在线播放网站| xxxwww97欧美| 精品午夜福利视频在线观看一区| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 欧美色欧美亚洲另类二区| 欧美色欧美亚洲另类二区| 欧美乱妇无乱码| 真人一进一出gif抽搐免费| 真人一进一出gif抽搐免费| 午夜精品久久久久久毛片777| 成人手机av| 国产精华一区二区三区| 亚洲一码二码三码区别大吗| 最好的美女福利视频网| 久久人人精品亚洲av| 大型黄色视频在线免费观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 精华霜和精华液先用哪个| 成年人黄色毛片网站| 国产人伦9x9x在线观看| 日韩欧美在线二视频| 欧美一级a爱片免费观看看 | 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 1024香蕉在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 老鸭窝网址在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区| e午夜精品久久久久久久| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 一级毛片精品| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产午夜福利久久久久久| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产主播在线观看一区二区| 久久精品影院6| 亚洲熟妇熟女久久| videosex国产| 嫩草影院精品99| 国产高清有码在线观看视频 | 高清在线国产一区| 两个人看的免费小视频| 亚洲av成人精品一区久久| 久久久久久久久免费视频了| 精品第一国产精品| 91九色精品人成在线观看| 99国产精品一区二区三区| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲av五月六月丁香网| 老司机靠b影院| 欧美日韩精品网址| 欧美成人午夜精品| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产精品综合久久久久久久免费| 久久久久亚洲av毛片大全| 午夜福利18| 欧美日本亚洲视频在线播放| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久精品国产亚洲av高清一级| 午夜福利视频1000在线观看| 国产亚洲欧美98| 可以在线观看毛片的网站| 欧美色视频一区免费| 最新在线观看一区二区三区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久 成人 亚洲| 欧美精品啪啪一区二区三区| 两个人的视频大全免费| 国产一区二区在线观看日韩 | 国产人伦9x9x在线观看| 一本综合久久免费| 在线观看www视频免费| 精华霜和精华液先用哪个| 久久香蕉国产精品| 久久亚洲真实| 亚洲人与动物交配视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 999久久久精品免费观看国产| 美女大奶头视频| 变态另类丝袜制服| 九色成人免费人妻av| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产成人aa在线观看| 亚洲中文字幕日韩| ponron亚洲| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 在线永久观看黄色视频| 国产av不卡久久| 欧美日韩乱码在线| 国产欧美日韩一区二区精品| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产av一区在线观看免费| 免费在线观看日本一区| 国产探花在线观看一区二区| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 在线观看66精品国产| 少妇粗大呻吟视频| 美女午夜性视频免费| 亚洲av美国av| 亚洲无线在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产精品久久视频播放| 操出白浆在线播放| 国产成人啪精品午夜网站| 香蕉久久夜色| 两个人的视频大全免费| av中文乱码字幕在线| 国产一区在线观看成人免费| 一个人免费在线观看的高清视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日本黄色视频三级网站网址| 国产一区二区在线观看日韩 | 亚洲欧美精品综合久久99| 国产99久久九九免费精品| 日韩精品中文字幕看吧| 国产高清视频在线播放一区| 国产不卡一卡二| 色综合站精品国产| 日韩大码丰满熟妇| e午夜精品久久久久久久| 亚洲人成网站高清观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 1024香蕉在线观看| 成人午夜高清在线视频| bbb黄色大片| 中文字幕最新亚洲高清| 国语自产精品视频在线第100页| 中文亚洲av片在线观看爽| 在线观看www视频免费| 欧美av亚洲av综合av国产av| 久久久国产欧美日韩av| 免费在线观看完整版高清| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 久久性视频一级片| 夜夜夜夜夜久久久久| 日本在线视频免费播放| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产一级毛片七仙女欲春2| 色在线成人网| 淫秽高清视频在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 欧美乱妇无乱码| 国产av在哪里看| 我的老师免费观看完整版| av国产免费在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 操出白浆在线播放| 欧美大码av| 在线a可以看的网站| 国产又色又爽无遮挡免费看| 在线免费观看的www视频| 夜夜爽天天搞| 国产日本99.免费观看| 看免费av毛片| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 午夜影院日韩av| 国产精品日韩av在线免费观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 人妻久久中文字幕网| 香蕉久久夜色| 波多野结衣高清无吗| 变态另类丝袜制服| 日韩大码丰满熟妇| 日韩欧美在线二视频| 日本熟妇午夜| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产高清激情床上av| 嫩草影院精品99| 真人一进一出gif抽搐免费| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 91九色精品人成在线观看| 不卡一级毛片| 亚洲美女视频黄频| 亚洲九九香蕉| 男插女下体视频免费在线播放| 99久久综合精品五月天人人| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 毛片女人毛片| www.精华液| 久久亚洲真实| 悠悠久久av| 久久中文看片网| 高清毛片免费观看视频网站| 久久久国产成人精品二区| 欧美乱色亚洲激情| 搡老岳熟女国产| 精品免费久久久久久久清纯| 欧美不卡视频在线免费观看 | 日本 欧美在线| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 看黄色毛片网站| 亚洲国产高清在线一区二区三| 午夜免费观看网址| 又大又爽又粗| 最新美女视频免费是黄的| 国产精品亚洲一级av第二区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲国产精品成人综合色| 久久久国产成人精品二区| 搞女人的毛片| 在线视频色国产色| 久久久久久大精品| 99精品久久久久人妻精品| 免费在线观看日本一区| 国产一区二区三区视频了| 香蕉av资源在线| 男女视频在线观看网站免费 | 亚洲精品在线观看二区| 国产精品日韩av在线免费观看| tocl精华| 九色国产91popny在线| 精品不卡国产一区二区三区| 国产一区在线观看成人免费| 男女之事视频高清在线观看| 国产97色在线日韩免费| 久久久久久久久中文| 日本黄色视频三级网站网址| 精品国产美女av久久久久小说| 18美女黄网站色大片免费观看| 正在播放国产对白刺激| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 色综合亚洲欧美另类图片| 日韩av在线大香蕉| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产乱人伦免费视频| 在线免费观看的www视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 人人妻人人看人人澡| av天堂在线播放| 黄色视频,在线免费观看| 级片在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 成熟少妇高潮喷水视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 黑人欧美特级aaaaaa片| 成人特级黄色片久久久久久久| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 在线看三级毛片| 日韩国内少妇激情av| av在线播放免费不卡| 亚洲黑人精品在线| 日本三级黄在线观看| 欧美日本视频| 日韩成人在线观看一区二区三区| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| aaaaa片日本免费| 国产免费男女视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 色播亚洲综合网| 99热这里只有精品一区 | 香蕉国产在线看| xxxwww97欧美| 一级毛片高清免费大全| 999久久久国产精品视频| 久久久久久国产a免费观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产精品久久久av美女十八| 极品教师在线免费播放| 午夜老司机福利片| 日日夜夜操网爽| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 国产一区二区在线av高清观看| 免费在线观看黄色视频的| 中文字幕av在线有码专区| av天堂在线播放| 一个人免费在线观看电影 | 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲色图av天堂| 欧美黑人精品巨大| 香蕉国产在线看| 欧美日韩国产亚洲二区| 精品国产美女av久久久久小说| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 麻豆一二三区av精品| 男女午夜视频在线观看| 亚洲自拍偷在线| 色精品久久人妻99蜜桃| www.自偷自拍.com| 99久久精品热视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 久久九九热精品免费| 欧美一级a爱片免费观看看 | 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 久久久精品大字幕| 免费看a级黄色片| 中亚洲国语对白在线视频| 怎么达到女性高潮| 精品久久久久久,| 午夜福利视频1000在线观看| 在线国产一区二区在线| avwww免费| 午夜免费激情av| 午夜日韩欧美国产| 欧美黑人精品巨大| 操出白浆在线播放| 激情在线观看视频在线高清| 一二三四社区在线视频社区8| www国产在线视频色| 中文亚洲av片在线观看爽| 成在线人永久免费视频| 一本精品99久久精品77| 人人妻人人澡欧美一区二区| 高清毛片免费观看视频网站| 免费在线观看日本一区| 午夜免费成人在线视频| a级毛片在线看网站| 成人欧美大片| 白带黄色成豆腐渣| 波多野结衣高清作品| 亚洲一区高清亚洲精品| 久久国产精品影院| 国产精品av视频在线免费观看| 一本久久中文字幕| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | xxxwww97欧美| 小说图片视频综合网站| 久久久久久大精品| 精品久久久久久成人av| 亚洲精品中文字幕在线视频| 99国产综合亚洲精品| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 欧美一区二区精品小视频在线| 久久久久久久精品吃奶| 久久 成人 亚洲| 日韩精品免费视频一区二区三区| 香蕉国产在线看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 丰满的人妻完整版| 99热6这里只有精品| 国产乱人伦免费视频| 久久久国产精品麻豆| 欧美极品一区二区三区四区| 欧美不卡视频在线免费观看 | 制服人妻中文乱码| 久久久久久九九精品二区国产 | 黑人操中国人逼视频| 两个人免费观看高清视频| 成人av在线播放网站| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲成人国产一区在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产熟女xx| 国产精品久久久人人做人人爽| 在线看三级毛片| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 制服丝袜大香蕉在线| 国产精品一区二区免费欧美| 91字幕亚洲| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 男人舔女人下体高潮全视频| aaaaa片日本免费| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 亚洲九九香蕉| 首页视频小说图片口味搜索| 日韩中文字幕欧美一区二区| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 国产激情欧美一区二区| 国产成人系列免费观看| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 天天添夜夜摸| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 美女午夜性视频免费| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲九九香蕉| 啦啦啦韩国在线观看视频| 欧美黑人精品巨大| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 久久久久久大精品| 欧美久久黑人一区二区| www日本黄色视频网| 亚洲人成电影免费在线| 岛国在线观看网站| 88av欧美| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 成人国产综合亚洲| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲九九香蕉| 精品一区二区三区av网在线观看| 搡老岳熟女国产| 最近在线观看免费完整版| 免费无遮挡裸体视频| 免费高清视频大片| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 村上凉子中文字幕在线| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲国产高清在线一区二区三| 色播亚洲综合网| 色综合婷婷激情| 床上黄色一级片| 在线播放国产精品三级| 国产成人系列免费观看| 精品无人区乱码1区二区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 免费看十八禁软件| 欧美高清成人免费视频www| 成人特级黄色片久久久久久久| 性色av乱码一区二区三区2| 99国产精品99久久久久| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产精品永久免费网站| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲av成人一区二区三| 九色成人免费人妻av| 久久人妻av系列| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲欧美精品综合久久99| 最好的美女福利视频网| 一进一出抽搐动态| 一级黄色大片毛片| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 免费一级毛片在线播放高清视频| 成人三级做爰电影| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 91国产中文字幕| 特级一级黄色大片| 90打野战视频偷拍视频| 天堂影院成人在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 精品久久久久久成人av| 黄色a级毛片大全视频| 午夜福利18| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲国产精品999在线| 不卡av一区二区三区| 天堂√8在线中文| 日本三级黄在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 久久香蕉激情| 国产视频一区二区在线看| 日本a在线网址| 国产精品野战在线观看| 精品国产美女av久久久久小说| 少妇的丰满在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 麻豆av在线久日| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 一个人免费在线观看的高清视频| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产探花在线观看一区二区| 日日爽夜夜爽网站| 91麻豆精品激情在线观看国产| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 美女大奶头视频| www国产在线视频色| 日韩欧美精品v在线| 国产69精品久久久久777片 | 男人舔奶头视频| 99热6这里只有精品| 日韩欧美国产一区二区入口| 一进一出抽搐动态| 好男人电影高清在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 男人舔女人的私密视频| 一进一出抽搐动态| 又粗又爽又猛毛片免费看| 无人区码免费观看不卡| 久久久久久人人人人人| 亚洲人成电影免费在线| 精品电影一区二区在线| 女警被强在线播放| 男人舔奶头视频| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产男靠女视频免费网站| 国产69精品久久久久777片 | 亚洲男人天堂网一区| 日本一本二区三区精品| 99热只有精品国产| 久久国产精品人妻蜜桃| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 99热这里只有是精品50| 深夜精品福利| 脱女人内裤的视频| 哪里可以看免费的av片| 国产1区2区3区精品| 亚洲中文av在线| 亚洲av成人一区二区三| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 欧美日韩国产亚洲二区| 一夜夜www| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美成人午夜精品| 毛片女人毛片| 一进一出抽搐gif免费好疼| 99久久国产精品久久久| 成人国产一区最新在线观看| aaaaa片日本免费| 欧美av亚洲av综合av国产av| 精品一区二区三区四区五区乱码| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲成a人片在线一区二区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产v大片淫在线免费观看| 99re在线观看精品视频| 国产精品久久电影中文字幕| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 一本精品99久久精品77| 99热只有精品国产| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 波多野结衣高清作品| 日日夜夜操网爽| 91成年电影在线观看| 看黄色毛片网站| 国产精品av久久久久免费| 久久久久免费精品人妻一区二区| 午夜亚洲福利在线播放| 曰老女人黄片| 日韩高清综合在线| 不卡一级毛片| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲 国产 在线| 欧美黄色淫秽网站| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产高清激情床上av| 亚洲男人的天堂狠狠| 午夜福利欧美成人| 欧美成人免费av一区二区三区| 在线视频色国产色| 久久久久国产一级毛片高清牌| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲一区高清亚洲精品| 久久国产乱子伦精品免费另类| www国产在线视频色| 国产成人系列免费观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲国产精品999在线| 欧美一级毛片孕妇| 欧美在线黄色| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 丁香欧美五月| 美女扒开内裤让男人捅视频| 午夜免费观看网址| 91老司机精品| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 欧美日本视频| 日本a在线网址| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲五月婷婷丁香| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产视频内射| 国内揄拍国产精品人妻在线| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产不卡一卡二| 伦理电影免费视频| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 日本免费一区二区三区高清不卡| 久久久久性生活片| avwww免费| 欧美一级a爱片免费观看看 | 欧美日韩国产亚洲二区| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 日本熟妇午夜| www.www免费av| 男人舔女人的私密视频| 免费看日本二区| 18禁国产床啪视频网站| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 色尼玛亚洲综合影院| 他把我摸到了高潮在线观看| 黄色毛片三级朝国网站| 欧美成人性av电影在线观看| 在线a可以看的网站| 日本一区二区免费在线视频| 五月伊人婷婷丁香| 男女那种视频在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 久久伊人香网站| 黄色视频不卡| 亚洲一区二区三区不卡视频| 精品免费久久久久久久清纯| 久久香蕉精品热| 亚洲欧美激情综合另类| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 啦啦啦韩国在线观看视频| 欧美日韩乱码在线| 中文亚洲av片在线观看爽| 美女 人体艺术 gogo| av国产免费在线观看| 久久久久久久久免费视频了| av在线天堂中文字幕| 精品不卡国产一区二区三区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受|