創(chuàng)傷后應激障礙大鼠杏仁核 PDE-4和 CREB的表達

丁金蘭 韓 芳 石玉秀

（中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，創(chuàng)傷后應激障礙研究室，沈陽 110001）

創(chuàng)傷后應激障礙大鼠杏仁核 PDE-4和 CREB的表達

丁金蘭 韓 芳 石玉秀*

（中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，創(chuàng)傷后應激障礙研究室，沈陽 110001）

目的 探討 PDE-4與 CREB在創(chuàng)傷后應激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）大鼠杏仁核內(nèi)的表達變化，為進一步闡明PTSD增強恐懼記憶機制研究提供基礎。方法 成年雄性大鼠40只，隨機分為PTSD模型1d、7d、14d組及正常對照組，采用單一連續(xù)刺激（single-prolonged stress，SPS）方法建立 PTSD模型，應用免疫組化及Real-time PCR方法檢測大鼠杏仁核 PDE-4及 CREB蛋白表達及 mRNA表達變化。結果 PTSD造模后1d PDE-4蛋白表達顯著降低，于 PTSD 7d時降至最低，第14d時回升，但仍顯著低于正常，PDE-4mRNA表達與蛋白表達同步變化；CREB蛋白在 PTSD造模后1d表達顯著增加，在 PTSD 7d時升至最高，第14d時下降，但仍顯著高于正常，其 mPNA表達與蛋白表達同步變化。結論 創(chuàng)傷應激刺激能誘發(fā)大鼠杏仁核 PDE-4和 CREB的表達變化，且 PDE-4和 CREB表達呈反向變化。

PTSD；杏仁核；恐懼記憶；PDE-4；CREB

創(chuàng)傷后應激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）是指受到突發(fā)性巨大災難或異乎尋常威脅所致的精神、心理創(chuàng)傷導致的長期持續(xù)性精神障礙。其核心癥狀可以簡述為闖入性再體驗、恐懼性增高及對未來失去信心等，為一種精神及心理失衡狀態(tài)［1］。PTSD的典型癥狀之一是恐懼記憶增強，與恐懼關系最為密切的中樞核團是杏仁核，杏仁核屬邊緣系統(tǒng)，是與學習、恐懼記憶和情緒、行為功能密切相關的重要部位，是恐懼學習記憶的重要腦區(qū)［2］。磷酸二酯酶4（phosphodiesterase，PDE-4）是細胞內(nèi)特異性的環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水解酶，可以通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)cAMP水平，使 cAMP水平下降，進而可以調(diào)節(jié)cAMP-PKA-CREB信號轉(zhuǎn)導通路，影響細胞內(nèi)CREB調(diào)節(jié)的基因的表達，使得參與學習記憶的一些蛋白質(zhì)不能夠被合成，從而干擾長期記憶的形成［3］。因此 PDE-4對 cAMP信號轉(zhuǎn)導通路相關的記憶調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要作用。那么，在 PTSD后杏仁核導致的恐懼記憶增強時PDE-4和CREB是如何變化的？其發(fā)病機制目前尚不完全清楚。因此本研究通過國際上公認的單一連續(xù)刺激（single-prolonged stress，SPS）模型，采用免疫組化、Real-time PCR對大鼠杏仁核內(nèi)的PDE-4、CREB進行檢測，旨在為研究 PTSD杏仁核導致恐懼記憶增強的發(fā)生機制提供基礎。

材料和方法

1.材料

1.1 實驗動物及分組

成年健康雄性 Wistar大鼠 40只，體重 150—180g，中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供，隨機分為4組，即 PTSD造模后的 1d、7d、14d組及正常對照組，每組10只。

2.方法

2.1 動物模型的建立和取材

采用日本文部省召開的“基礎和臨床的研究進展”會議確定的關于 PTSD模型— SPS刺激。SPS刺激是指將大鼠連續(xù)進行下述步驟處理：大鼠禁錮2小時后，立即強迫游泳 20min（水深 40cm，水溫25℃）。經(jīng)過15min的恢復，乙醚麻醉至意識喪失，在籠子中不再經(jīng)任何刺激正常飼養(yǎng)至取材。

分別取 PTSD 1d、7d、l4d及正常對照組大鼠進行灌流固定。大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，用0.01M PBS緩沖配置的 4%多聚甲醛心臟灌流，取出腦組織，并浸入同種固定液中后固定3h，然后浸于Holt’S液（30%蔗糖，0.1M PBS配制）中沉至瓶底。于恒冷冰凍切片機中冠狀切片，片厚10μm。

2.2 免疫組織化學染色

切片經(jīng)PBS洗3次，5min／次，BSA封閉，滴加多克隆兔PDE-4抗體、單克隆鼠 CREB抗體（購于Santa Cruz Biotechnology公司，工作濃度為 1：200），4℃過夜，滴加羊抗兔IgG二抗、羊抗鼠IgG二抗（武漢，博士德）37℃ 30 min，SABC 37℃ 20min，PBS洗3次，5min／次，DAB顯色，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡（OLYMPUS，BX60，Japan）下觀察，攝片。

應用MetaMorph／DPIO／BX41形態(tài)學圖象分析系統(tǒng)軟件，對上述免疫組織化學染色切片進行了半定量分析。在高倍（10×40倍）視野下，每張免疫組化染色切片取 5個視野，記錄每個視野內(nèi)陽性細胞光密度值，取平均光密度。每組5只大鼠，每只大鼠共選取 3張切片，具體半定量分析結果。

2.3 Real-time PCR

將各組大鼠麻醉后斷頭取腦，分離杏仁核的基底外側核（basal lateral amgydala，BLA），利用 Trizol試劑提取總RNA，取1μg RNA，按照試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄和 PCR擴增。引物由上海生工生物工程技術公司合成，各引物序列見表 1。以目的mRNA與內(nèi)參 β-actin的比值表示相對表達水平，進行定量分析。

表1 PDE-4、CREB與β-actin引物序列Table 1 Primers for PDE-4，CREB and β-actin

2.4 統(tǒng)計學分析

所得數(shù)據(jù)使用 SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料用平均數(shù) ±標準差（（±s））表示。應用單因素方差分析（ANOVA）檢驗，P＜0.05判為具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.PTSD對杏仁核 BLA內(nèi) PDE-4和 CREB的免疫反應性影響

免疫組化染色陽性信號為棕黃色，陽性表達的PDE-4染色位于細胞核和細胞質(zhì)（圖1）。PDE-4免疫組織化學染色顯示，在正常對照組大鼠杏仁核中大量分布PDE-4陽性信號，而在 PTSD 1d，杏仁核中PDE-4表達明顯降低；在 PTSD 7d時降至最低，較正常對照組有顯著差異（圖1C，圖3，P＜0.05）。PTSD 14d時 PDE-4表達增多，但仍顯著低于正常對照組。CREB的陽性表達主要位于細胞核（圖2），結果顯示，在PTSD后CREB表達明顯增多，在PTSD 7d達到高峰，較正常對照組顯著差異（圖2C，圖 3，P＜0.05）。PTSD 14d時CREB表達下降，但仍顯著高于正常對照組。

圖2 CREB免疫組化結果。A.正常對照組免疫反應陽性細胞；B.PTSD 1d組免疫反應陽性細胞；C.PTSD 7d組免疫反應陽性細胞；D.PTSD 14d組免疫反應陽性細胞Fig.2 The immunoreaction results of CREB；A.Immunoreaction in rats’amygdala of normal control group；B.Immunoreaction in rats’amygdala of SPS 1d group；C.Immunoreaction in rats’amygdala of SPS 7d group；D.Immunoreaction in rats’amygdala of SPS 14d group

2.PTSD改變杏仁核內(nèi) PDE-4和 CREB的 mRNA表達

定量PCR檢測顯示，杏仁核BLA內(nèi)PDE-4 mRNA表達在 PTSD后降低，于PTSD 7d降至最低（表2），在PTSD14d時有所回升，但仍顯著低于正常對照組，與免疫組織化學檢測結果一致；CREB mRNA在正常組大鼠杏仁核 BLA中有少量表達，SPS刺激后，在PTSD 1d組mRNA的表達開始增多，PTSD 7d組達到最多，在 PTSD 14d組下降，但仍顯著高于正常對照組（表2）。

圖3 不同時間點大鼠杏仁核神經(jīng)元PDE-4及CREB的表達情況（OD）（（±s））Fig.3 The expression of CREB and PDE-4 in different time of amygdala neurons.*P＜0.05 vs normal control group

表2 PDE-4、CREB的mRNA表達結果Table 2 The results of mRNA expression of PDE-4 and CREB.

討 論

近年來，隨著戰(zhàn)爭、社會暴力、重大交通事故和自然災害等意外事件的逐漸增多，以及工作學習競爭壓力加大，PTSD發(fā)生率也逐年增高。因嚴重影響人們身心健康而備受國內(nèi)外學者關注。PTSD的典型癥狀之一是恐懼記憶增強，杏仁核，特別是 BLA，在條件化恐懼記憶中起關鍵作用，是恐懼記憶形成和儲存的主要位點［4］。因此我們選擇 BLA作為研究 PTSD恐懼記憶增強的切入點，這是闡明 PTSD發(fā)病機制的關鍵所在。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，cAMP-PKA-CREB信號轉(zhuǎn)導通路和長期記憶的形成密切相關，在學習和記憶形成的過程中有重要的作用［5］。神經(jīng)細胞內(nèi) cAMP的濃度是由腺苷酸環(huán)化酶（adenylyl cyclase，AC）和PDE-4的功能狀態(tài)決定的［6］，但是PDE-4是細胞內(nèi)特異性的cAMP水解酶，在調(diào)解細胞內(nèi)cAMP積累過程中起著更為重要的作用。從而影響其介導的cAMP-PKACREB等信號通路。在神經(jīng)系統(tǒng)中，CREB作為一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在基因轉(zhuǎn)錄水平對學習記憶的調(diào)控起著“開關”的作用。其下游效應包括影響神經(jīng)元的存活與生長、突觸可塑性和長期記憶的形成［7］。CREB在介導 LTP及記憶過程中起到了關鍵性的作用，并推測 CREB活化的重要結果之一可能就是突觸結構的可塑性增強［8］。

通過實驗可知，在 SPS刺激后，PDE-4的濃度明顯降低，在 PTSD 7d時降至最低，以后又逐漸恢復，CREB在 PTSD后明顯增多，至PTSD 7d時增至最高，由此可推知細胞內(nèi) cAMP的濃度在 PTSD 7d達到最高從而使 CREB調(diào)節(jié)的恐懼記憶達到最高。因此，我們推測PTSD后恐懼記憶與 PDE-4下調(diào)，降解cAMP減少，促進 cAMP-PKA-CREB信號轉(zhuǎn)導通路激活有關，這和我們前期研究的在 PTSD 7d時，杏仁核內(nèi) LTP的群體峰電位（population spike，PS）PS幅值達到最高，說明在 PTSD 7d時恐懼記憶最強的結果相符［9］。上述可說明PTSD后杏仁核導致的恐懼記憶增強，其作用機制與cAMP-PKA-CREB信號轉(zhuǎn)導通路相關，并且杏仁核導致的恐懼記憶是在 PDE-4的調(diào)節(jié)下發(fā)生，并與 PDE-4的濃度呈反相的變化，與CREB濃度呈正相的變化。

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Expression of PDE-4 and CREB in amygdala of rats with post-traumatic stress disorder

Ding Jinlan，Han Fang，Shi Yuxiu*
（PTSD Lab，Department of Histology and Embryology，Basic Medical College，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To investigate PDE-4 and CREB expressions in the amygdala of rats with post-traumatic stress disorder（PTSD），in order to clarify the pathogenesis of fear memory enhancement in PTSD.Methods 40 male wistar rats were randomly divided into 1d，7d，14d groups of PTSD and the normal control group.The SPS（single-prolonged stress，SPS）method was used to set up the rat PTSD models.we used immunohistochemistry and Real-time PCR to detect the protein and mRNA expressions of PDE-4 and CREB.Results After PTSD stimulation，the protein expression of PDE-4 decreased significantly in comparison with that of the normal control group，plummeted on PTSD 7d，and then increased on PTSD 14d，but was still significantly lower than normal.PDE-4 mRNA expression synchronously changed with protein expression.In the PTSD groups，the protein level of CREB increased on day 1 of PTSD，peaked on PTSD 7d，and then decreased on PTSD 14d，but was still significantly higher than normal.The mRNA expression synchronously changed with protein expression.Conclusion Traumatic stress stimulation can induce PDE-4 and CREB expression changes in the amygdala of rats.Moreover，the expressions of PDE-4 and CREB are negatively correlated.

PTSD；Amygdala；Fear memory；PDE-4；CREB

R322.81

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2015.05.012

2015-04-30

2015-07-01

國家自然科學基金資助項目（31140060）

丁金蘭，女（1981年），漢族，碩士

*通訊作者（to whom correspondence should be addressed）：shiyuxiu＠163.com