TBX2和 PAX9在膀胱尿路上皮癌中高表達(dá)

陜 光 錢輝軍 夏 樾

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿Ⅱ科，武漢 430060）

TBX2和 PAX9在膀胱尿路上皮癌中高表達(dá)

陜 光 錢輝軍 夏 樾

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿Ⅱ科，武漢 430060）

目的 研究 TBX2和 PAX9在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)及臨床意義。方法 收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科2006-2009年有完整臨床和病理資料的膀胱尿路上皮癌存檔蠟塊50例和5例癌旁組織，采用免疫組織化學(xué) S-P法檢測(cè)50例膀胱尿路上皮癌和5例癌旁組織中 TBX2和 PAX9的表達(dá)水平；采用 HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)，對(duì)TBX2和 PAX9的表達(dá)進(jìn)行定量分析，并用 SPSS13.0軟件對(duì)各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和SNK（q）檢驗(yàn)。結(jié)果 TBX2和PAX9在膀胱尿路上皮癌中均高表達(dá)，與癌旁組織相比，差異有顯著性；經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，TBX2和 PAX9表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)論 TBX2和 PAX9對(duì)膀胱尿路上皮癌診斷提供參考價(jià)值。

膀胱尿路上皮癌；TBX2；PAX9；免疫組織化學(xué)

膀胱尿路上皮癌是指發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤，是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是全身十大常見腫瘤之一。膀胱尿路上皮癌占我國(guó)泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率的第一位，而在西方其發(fā)病率僅次于前列腺癌，居第二位［1］。膀胱尿路上皮癌可發(fā)生于任何年齡，甚至兒童。其發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而增加，高發(fā)年齡50～70歲。男性膀胱尿路上皮癌發(fā)病率為女性的3～4倍［2］。膀胱尿路上皮癌的病因復(fù)雜，既有內(nèi)在的遺傳因素，又有外在的環(huán)境因素，其發(fā)病原因還不清楚。因此，研究與膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)理，尋找早期預(yù)測(cè)膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)標(biāo)記物，為膀胱癌的發(fā)生和復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)提供一定的參考依據(jù)具有重要的臨床意義。

TBX2是T-BOX基因家族成員之一，屬于發(fā)育調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因［3］；PAX9為 PAX家族的新成員，是胚胎發(fā)育過程中不可或缺的調(diào)控基因。有研究發(fā)現(xiàn) TBX2、PAX9在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，可視為新的腫瘤標(biāo)志物［4-5］。

采用免疫組化和圖像分析方法檢測(cè)和分析膀胱尿路上皮癌組織 TBX2和 PAX9的表達(dá)，以期能進(jìn)一步探討膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)理，為膀胱尿路上皮癌的診治提供理論依據(jù)。

材料和方法

1.材料

收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科2006-2009年膀胱尿路上皮癌存檔蠟塊50例（均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為膀胱尿路上皮癌），其中男性38例，女性12例，平均年齡50.3歲，另 5例癌旁組織距瘤緣 3～5cm。標(biāo)本均經(jīng) HE染色，光鏡觀察診斷，按WHO尿路腫瘤組織學(xué)分類（2004），浸潤(rùn)性尿路上皮癌30例，非浸潤(rùn)性乳頭狀尿路上皮癌；高級(jí)別15例，低級(jí)別5例；按UICC臨床分期，T1 31例，T2 11例，T3～4 8例。其中未經(jīng)化療的初發(fā)腫瘤 28例，化療后復(fù)發(fā)腫瘤22例。

2.主要試劑

即用型兔抗人TBX2和 PAX9多克隆抗體 （北京中杉生物技術(shù)有限公司）；超敏即用型 SP通用型免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中杉生物技術(shù)有限公司）；DAB顯色試盒及多聚賴氨酸（北京中杉生物技術(shù)有限公司）。

3.方法

3.1 HE染色

常規(guī)取材、固定、脫水、透明、包埋、切片、HE染色及封片

3.2 免疫組織化學(xué)染色

組織切片常規(guī)脫蠟至水后，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗 3×3 min；抗原修復(fù)，室溫自然冷卻后，PBS漂洗5×3 min；滴加3%過氧化氫，37℃濕盒孵育10min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS漂洗3×3 min；正常羊血清37℃濕盒孵育10min以減少非特異性背景；甩去多余血清，分別滴加一抗，4℃孵育過夜，PBS漂洗3×5 min；滴加生物素標(biāo)記的二抗37℃濕盒孵育10min，PBS漂洗 3×3 min；滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物復(fù)合物 37℃濕盒孵育10min，PBS漂洗3×3 min；滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色，光鏡下控制反應(yīng)時(shí)間（約3～5 min），自來水沖洗終止反應(yīng)；蘇木素復(fù)染，流水沖洗，1%鹽酸酒精分色數(shù)秒，流水沖洗，0.1%氨水返藍(lán)；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢；用 PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組，購買的陽性片作為 TBX2和PAX9的陽性對(duì)照組。

3.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

TBX2和 PAX9以細(xì)胞膜或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，陰性對(duì)照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，應(yīng)無棕黃色反應(yīng)物。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)（同濟(jì)千屏影像公司）對(duì) TBX2和 PAX9的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的高倍鏡視野（400×），測(cè)定每個(gè)視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計(jì)算陽性面積率。以每例5個(gè)視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測(cè)量值。（陽性面積率 ＝單位面積中陽性反應(yīng)的總面積／單位面積中細(xì)胞的總面積×100%）

對(duì)各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率作單因素方差分析和q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α為0.05。相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.TBX2的表達(dá)

膀胱尿路上皮癌細(xì)胞內(nèi)可見密集分布的棕黃色顆粒，TBX2表達(dá)呈陽性（圖1A）；癌旁組織細(xì)胞內(nèi)可見極少量的或無棕黃色顆粒，TBX2表達(dá)呈陰性（圖1B）。圖像分析結(jié)果見表1。經(jīng)q檢驗(yàn)，膀胱尿路上皮癌與癌旁組織之間，TBX2的平均光密度及陽性面積率有顯著性差異（P＜0.05）（表1）。

2.PAX9的表達(dá)

膀胱尿路上皮癌細(xì)胞內(nèi)可見密集分布的棕黃色顆粒，PAX9表達(dá)呈陽性（圖1C）；癌旁組織細(xì)胞內(nèi)可見極少量的或無棕黃色顆粒，PAX9表達(dá)呈陰性（圖1D）。圖像分析結(jié)果見表2。經(jīng) q檢驗(yàn)，膀胱尿路上皮癌與癌旁組織之間，PAX9的平均光密度及陽性面積率有顯著性差異（P＜0.05）（表2）。

表1 膀胱尿路上皮癌和癌旁組織TBX2表達(dá)的平均光密度和陽性面積率（（±s））Table 1 The average optical density and the rate of positive area of TBX2 in bladder urothelial cancer and cancer side tissue（±s）

*膀胱尿路上皮癌與癌旁組織比較P＜0.05*Comparison between bladder urothelial cancer and cancer side tissue，P＜0.05

組別 例數(shù) 平均光密度 陽性面積率Group n average optical density rate of positive area膀胱尿路上皮癌 50 0.3024±0.0085*0.2951±0.0069*Bladder Urothelial Cancer癌旁組織 5 0.0894±0.0031 0.0778±0.0030 cancer side tissue

圖1 A：膀胱尿路上皮癌組TBX2的表達(dá)。細(xì)胞胞漿內(nèi)可見密集分布的棕黃色顆粒，TBX2陽性表達(dá)（→）Fig.1 A The expression of TBX2 in bladder urothelial cancer group.There were plenty of brown particles in the cytoplasm，which showed TBX2 expression

表2 膀胱尿路上皮癌和癌旁組織 PAX9表達(dá)的平均光密度和陽性面積率（（±s））Table 2 The average optical density and the rate of positive area of PAX9 in bladder urothelial cancer and cancer side tissue（（±s））

表2 膀胱尿路上皮癌和癌旁組織 PAX9表達(dá)的平均光密度和陽性面積率（（±s））Table 2 The average optical density and the rate of positive area of PAX9 in bladder urothelial cancer and cancer side tissue（（±s））

*膀胱尿路上皮癌與癌旁組織比較 *P＜0.05*P＜0.05 Comparison between Bladder Urothelial Cancer and cancer side tissue

組別 例數(shù) 平均光密度 陽性面積率Group n average optical density rate of positive area膀胱尿路上皮癌 50 0.2895±0.0073*0.2652±0.0058*Bladder Urothelial Cancer癌旁組織 5 0.0795±0.0029 0.0760±0.0027 cancer side tissue

3 TBX2和PAX9在膀胱尿路上皮癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，TBX2和PAX9表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.462，P＜0.05）。

討 論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，目前發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，且復(fù)發(fā)率高，易產(chǎn)生獲得性耐藥。膀胱癌的病因復(fù)雜，既有內(nèi)在的遺傳因素，又有外在的環(huán)境因素。較為明確的兩大致病危險(xiǎn)因素是吸煙和職業(yè)接觸芳香胺類化學(xué)物質(zhì)［6］。膀胱癌初發(fā)時(shí)80%為淺表性，其中 70%術(shù)后復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)者 30%向高級(jí)高期發(fā)展，15%～30%的患者初發(fā)時(shí)即具有侵襲性，即使經(jīng)過治療，也較早轉(zhuǎn)移［7］。因此，研究與膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)理，尋找早期預(yù)測(cè)膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)標(biāo)記物，為膀胱癌的發(fā)生和復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)提供一定的參考依據(jù)具有重要的臨床意義。

TBX2基因是發(fā)育調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因，屬于轉(zhuǎn)錄因子T-box家族成員之一，其通過特有的T-box區(qū)域參與多種生物的發(fā)育調(diào)控，是T-box基因家族成員中僅有的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制基因之一。TBX2在各種組織和器官的胚胎發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TBX2在多種腫瘤中高表達(dá)，并且與細(xì)胞的凋亡、惡性轉(zhuǎn)化及細(xì)胞增殖有著密切關(guān)系并參與多種生物的發(fā)育調(diào)控，屬于發(fā)育調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因［8-12］。PAX9基因是PAX基因家族的新成員，PAX9基因廣泛參與了腦、胸腺、甲狀旁腺等器官的胚胎發(fā)育，是胚胎發(fā)育中不可或缺的調(diào)控基因。目前有關(guān) PAX9基因的研究主要集中在其與牙齒發(fā)生、分化的關(guān)系方面［13-15］，僅有少量有關(guān)PAX9基因在肺癌、食管癌及口腔鱗狀細(xì)胞癌等方面的研究［16-17］，近年來研究發(fā)現(xiàn)，TBX2和 PAX9在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［18-20］。

我們采用免疫組織化學(xué)的方法，對(duì)膀胱尿路上皮癌組織中 TBX2和 PAX9的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，旨在探討他們與膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。結(jié)果顯示：TBX2和PAX9在膀胱尿路上皮癌中呈高表達(dá)，癌旁組織中呈低表達(dá)。提示 TBX2和 PAX9與細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞增殖有著密切關(guān)系。并且 TBX2和PAX9可作為膀胱尿路上皮癌早期診斷指標(biāo)。本研究還發(fā)現(xiàn)TBX2和 PAX9蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.462，P＜0.05），說明TBX2和PAX9在膀胱尿路上皮癌的發(fā)生及進(jìn)展中可能起著協(xié)同作用，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中的表達(dá)影響和作用共同促進(jìn)腫瘤的生物學(xué)行為。

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Expression and clinical significance of TBX2 and PAX9 in bladder urothelial cancer

Shan Guang，Qian Huijun，Xia Yue
（Department of Urology，Renmin hospital of Wuhan university，Wuhan 430060，China）

Objective To investigate the expression and clinical significance of TBX2 and PAX9 in bladder urothelial cancer tissues.Methods Specimens from 50 cases of bladder urothelial cancer and 5 cases of paracancerous tissue were collectedf rom the Department of Pathology in Renmin Hospital of Wuhan University from 2006 to 2009.We examined the expressions of TBX2 and PAX9 in bladder urothelial cancer and paracancerous tissue by using immunohistochemistry.Average optical density and positive area rates of expression of TBX2 and PAX9 were measured by image analysis（HPIAS-1000）.The single factor analysis of variance and SNK test（q）of average optical density and positive area rates were conducted by SPSS13.0 software.Results 1.The expressions of TBX2 and PAX9 were higher in bladder urothelial cancer than in paracancerous tissue，with a significant difference.The Spearman rank correlation analysis showed that there was a positive correlation between expressions of TBX2 and PAX9 in bladder urothelial cancer tissue.Conclusion This result suggests that TBX2 and PAX9 provide a reference value in the diagnosis of bladder urothelial carcinoma.

Bladder Urothelial Cancer；TBX2；PAX9；Immunohistochemistry

R737.14

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2015.05.007

2015-06-06

2015-09-10

〔項(xiàng)目來源〕湖北省自然科學(xué)基金（青年基金）（2014CFB375）

陜光，男（1980年），漢族，主治醫(yī)師