自主運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖及相關(guān)基因表達(dá)的影響

陸 樂(lè)徐 波張憲亮

（1.上海師范大學(xué)體育學(xué)院, 上海 200234；2.華東師范大學(xué)體育與健康學(xué)院,上海 200241）

自主運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖及相關(guān)基因表達(dá)的影響

陸 樂(lè)117徐 波2張憲亮2

（1.上海師范大學(xué)體育學(xué)院, 上海 200234；2.華東師范大學(xué)體育與健康學(xué)院,上海 200241）

實(shí)驗(yàn)選用24只5周齡的C57BL/6雄性小鼠，隨機(jī)分為運(yùn)動(dòng)組12只（R組）和對(duì)照組12只（C組），其中R組進(jìn)行8周自主跑輪運(yùn)動(dòng)。第5周開(kāi)始，隨機(jī)從兩組小鼠中各抽取6只，共12只進(jìn)行連續(xù)1周的BrdU注射。8周運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，對(duì)12只未注射BrdU的小鼠進(jìn)行斷頸，取雙側(cè)海馬，放入-80℃超低溫冰箱保存，待檢測(cè)生化指標(biāo)。對(duì)注射BrdU的12只小鼠進(jìn)行免疫組化染色預(yù)處理，隨后進(jìn)行BrdU單標(biāo)免疫熒光染色，從形態(tài)學(xué)角度觀察神經(jīng)干細(xì)胞增殖情況并計(jì)數(shù)。對(duì)未注射小鼠進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)其NGF、Jagged-1、PS1、Hes1、Hes5、Hes6的 mRNA水平；結(jié)果：8周自主運(yùn)動(dòng)后小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量顯著增加（p＜0.01），Notch信號(hào)通路中配體Jagged-1、靶基因Hes1的mRNA表達(dá)水平顯著升高（p＜0.01）。神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF的mRNA表達(dá)量顯著升高（p＜0.01）。NGF與配體Jagged-1、靶基因Hes1呈高度相關(guān)性（p＜0.01）。結(jié)論：8周自主跑輪運(yùn)動(dòng)促進(jìn)小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖，可能和Notch信號(hào)通路的激活有關(guān)。此外，8周運(yùn)動(dòng)促使NGF的表達(dá)量升高，提示NGF與Notch信號(hào)通路可能存在交互作用，可以共同調(diào)節(jié)Notch信號(hào)通路下游靶基因的變化，從而影響神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化。

神經(jīng)干細(xì)胞增殖；Notch信號(hào)通路；自主跑輪運(yùn)動(dòng)；NGF

生物界和醫(yī)學(xué)界長(zhǎng)期以來(lái)認(rèn)為，包括大腦在內(nèi)的人類發(fā)育早期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)回路一旦形成，就不會(huì)再產(chǎn)生新的功能性神經(jīng)元。伴隨著年齡增長(zhǎng)，功能性的神經(jīng)元數(shù)量逐步減少、功能逐漸退化，伴隨產(chǎn)生的類似阿爾茲海默病、帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變都是不可逆現(xiàn)象。20世紀(jì)60年代，有研究者發(fā)現(xiàn)并正式確認(rèn)了成年鼠腦內(nèi)存在新生的功能性神經(jīng)元，并且在特定環(huán)境下能夠改變自身的結(jié)構(gòu)和功能，增殖、遷移整合到原本損傷或退化的功能區(qū)域，由此將此類現(xiàn)象命名為“神經(jīng)發(fā)生”[1]。運(yùn)動(dòng)作為一類有效的外部刺激手段，能夠調(diào)節(jié)不同的信號(hào)通路和相關(guān)因子的表達(dá)，影響神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化，對(duì)大腦進(jìn)行可塑性的調(diào)控，延緩中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元數(shù)量和質(zhì)量的雙重退化。研究顯示，Wnt[2]、Notch等信號(hào)通路以及BDNF、NGF等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子均在神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化過(guò)程中起到一定的調(diào)控作用。Notch信號(hào)通路是一條高度保守的信號(hào)通路，具體功能表現(xiàn)為對(duì)細(xì)胞命運(yùn)的決定并影響細(xì)胞譜系的發(fā)展，在胚胎發(fā)育早期和成年期，從細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)分子傳到的各個(gè)層面影響干細(xì)胞的增殖和分化[3]。具體來(lái)說(shuō)，Notch信號(hào)通路主要通過(guò)“旁側(cè)抑制”作用首先確保新生細(xì)胞的增殖數(shù)量，并保證增殖的同質(zhì)細(xì)胞順利分化為不同的功能化細(xì)胞。而神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化有重要的調(diào)控作用，并且最新的研究發(fā)現(xiàn)NGF可能與Notch信號(hào)通路產(chǎn)生交互作用[4]，共同調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生過(guò)程。因此本研究選用自主跑輪運(yùn)動(dòng)作為運(yùn)動(dòng)干預(yù)模式，探究8周自主運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖情況及Notch信號(hào)通路相關(guān)因子，并結(jié)合NGF的表達(dá)變化，探究自主跑輪運(yùn)動(dòng)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖情況的影響和相關(guān)機(jī)制。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與分組

5 周齡的C57BL/6雄性小鼠24只（由上海斯萊克公司提供），體重：(18.18±0.50)克。所有小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠1只，自由飲食飲水。飼養(yǎng)溫度：22±1℃；飼養(yǎng)濕度：40%-60%；自然晝夜節(jié)律變化光照。隨機(jī)分為運(yùn)動(dòng)組（R組）和對(duì)照組（C組），每組12只。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

R組小鼠置于裝有自主跑輪的籠中進(jìn)行8周自主跑輪運(yùn)動(dòng)，C組小鼠置于空籠中安靜飼養(yǎng)8周。每天記錄運(yùn)動(dòng)量數(shù)據(jù)。

1.3 BrdU注射

第5周開(kāi)始，隨機(jī)從兩組小鼠中各抽取6只，共計(jì)12只。進(jìn)行連續(xù)1周的BrdU腹腔注射，注射量：50mg/kg，注射時(shí)間：每日下午體重稱量完成后。

1.4 組織取材

8 周運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，對(duì)12只未注射BrdU的小鼠進(jìn)行斷頸，取出雙側(cè)海馬，放入-80℃超低溫冰箱保存，待檢測(cè)生化指標(biāo)。對(duì)注射BrdU的12只小鼠進(jìn)行免疫組化染色預(yù)處理，預(yù)處理步驟參照劉瑾彥[5]等的實(shí)驗(yàn)方法。

1.5 RT-PCR：檢測(cè)Jagged-1、PS-1、Hes-1、Hes5、Hes-6、NGF的mRNA表達(dá)水平

用Trizol法提取小鼠雙側(cè)海馬內(nèi)總的RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得到相對(duì)穩(wěn)定的cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠海馬Jagged-1、PS-1、Hes-1、Hes5、Hes-6、NGF的mRNA表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.6 免疫組織化學(xué)熒光染色法：檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞增殖

取出注射過(guò)BrdU小鼠雙側(cè)海馬組織，用OCT包埋。在恒溫冰凍切片機(jī)中進(jìn)行冰凍、切片。厚度：20μm，室溫靜置12h干燥后放置于-80℃冰箱保存。按照免疫熒光染色步驟進(jìn)行組織染色，最后用熒光顯微鏡觀察切片，避光拍片。

1.7 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS17.0、GraphPad Prism5圖像處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算與分析，所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。其中，P ＜0.05表示具有顯著性差異，P ＜0.01表示具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖情況的影響

如圖1，運(yùn)動(dòng)組小鼠海馬新生神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量（281.25±55.31）明顯多于對(duì)照組小鼠（67.25±12.39），具有極顯著性差異（p＜0.01）。

圖1 兩組小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖數(shù)量的比較

圖2 小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖情況

2.2 對(duì)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖相關(guān)基因Jagged-1、PS-1、Hes-1、Hes5、Hes-6、NGF的mRNA表達(dá)水平的影響

如表2所示，8周自主跑輪運(yùn)動(dòng)后，運(yùn)動(dòng)組小鼠的Jagged-1、Hes-1和NGF表達(dá)量明顯上升，與對(duì)照組比較具有極顯著性差異（p＜0.01）。此外，PS1和Hes5的表達(dá)也有上升趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異。

表2 神經(jīng)干細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)

2.3 NGF、Jagged-1、Hes1的相關(guān)性分析

如表3所示，NGF與Jagged-1的相關(guān)系數(shù)為0.75，具有極顯著性差異（p＜0.01），為高度相關(guān)。NGF與Hes1的相關(guān)系數(shù)為0.78，具有極顯著性差異（p＜0.01），為高度相關(guān)。

表3 NGF、Jagged-1、Hes1的相關(guān)性

3 討論

自1965年Altman等人發(fā)現(xiàn)在成年小鼠腦內(nèi)存在新生的神經(jīng)干細(xì)胞，并能夠通過(guò)增殖、分化、遷移并發(fā)揮功能性作用以來(lái)，不斷有研究分別從形態(tài)學(xué)、基因水平和蛋白水平等多角度證實(shí)了側(cè)腦室的室管膜下層(sub ventricular zone, SVZ)和海馬齒狀回的顆粒細(xì)胞下層(sub granular zone, SGZ)為“神經(jīng)發(fā)生”的典型區(qū)域[6]。許多研究通過(guò)設(shè)置穿梭隧道、迷宮、跑輪等設(shè)施創(chuàng)造豐富環(huán)境[7]，觀察到在豐富環(huán)境下，小鼠的神經(jīng)干細(xì)胞增殖明顯，成年神經(jīng)發(fā)生現(xiàn)象明顯增強(qiáng)，通Morris水迷宮測(cè)試發(fā)現(xiàn)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有所提高。“豐富環(huán)境”是一個(gè)較為復(fù)雜的概念，包括各類主被動(dòng)運(yùn)動(dòng)、動(dòng)物社交環(huán)境以及群體效應(yīng)等。為了區(qū)分不同施加因素對(duì)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的影響，出現(xiàn)了各類單獨(dú)干預(yù)因素的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，作為積極的刺激手段—運(yùn)動(dòng)尤其是自主運(yùn)動(dòng)，與豐富環(huán)境組比較，運(yùn)動(dòng)組小鼠的神經(jīng)干細(xì)胞增殖數(shù)量更多，樹(shù)突密度增加，神經(jīng)回路更加緊密，學(xué)習(xí)記憶能力提高顯著[8]。

為避免被動(dòng)運(yùn)動(dòng)帶來(lái)的干擾，本實(shí)驗(yàn)采用自主跑輪運(yùn)動(dòng)此類出于自愿的運(yùn)動(dòng)模式為外部干預(yù)手段。采用BrdU單標(biāo)記免疫組織化學(xué)法，從第5周開(kāi)始注射BrdU，觀察8周自主跑輪運(yùn)動(dòng)后小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖情況。8周運(yùn)動(dòng)結(jié)束后發(fā)現(xiàn)，自主運(yùn)動(dòng)組小鼠海馬區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組有極顯著性差異（p＜0.01），約為對(duì)照組的4倍。這與已有的研究結(jié)果保持一致，說(shuō)明海馬是一個(gè)極具可塑性的腦區(qū)，合理的運(yùn)動(dòng)能夠促進(jìn)該腦區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖，為學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能的改善創(chuàng)造條件。

自上世紀(jì)60年代，研究者發(fā)現(xiàn)成年的中樞神經(jīng)系統(tǒng)依然具備產(chǎn)生新的功能性神經(jīng)元后，關(guān)于其潛在的調(diào)控機(jī)制的研究不斷出現(xiàn)。其中，作為高度保守的信號(hào)通路，Notch信號(hào)通路在神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，具體功能表現(xiàn)為對(duì)細(xì)胞命運(yùn)的決定并影響細(xì)胞譜系的發(fā)展，在胚胎發(fā)育早期和成年期，從細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)分子傳到的各個(gè)層面影響干細(xì)胞的增殖和分化[3]。具體來(lái)說(shuō)，Notch信號(hào)通路主要通過(guò)“旁側(cè)抑制”作用首先確保新生細(xì)胞的增殖數(shù)量，并保證增殖的同質(zhì)細(xì)胞順利分化為不同的功能化細(xì)胞。Notch信號(hào)通路由三部分組成，包括（Notch1-4）受體、配體（Jagged家族的Jagged-1、Jagged-2和Delta-like家族的DLL1、DLL3和DLL4）、下游信號(hào)分子組成。Notch受體是一個(gè)約300kDa的單次跨膜受體蛋白， 配體為Ⅰ型單次跨膜糖蛋白，通常認(rèn)為Notch信號(hào)通路的激活是通過(guò)“三步酶切”實(shí)現(xiàn)的[9]。該信號(hào)通路的各個(gè)環(huán)節(jié)都是影響神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)節(jié)。PS是γ-分泌酶復(fù)合物的主要成分，有研究發(fā)現(xiàn)，抑制PS1的活性能夠影響胞內(nèi)信號(hào)分子Hes5的表達(dá)[10]。同時(shí)敲出PS1和PS2后，小鼠在發(fā)育早期就表現(xiàn)出更嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育缺陷[11]。Notch信號(hào)通路下游的主要調(diào)控因子為堿性螺旋環(huán)螺旋因子（bHLH）家族，可分為抑制性bHLH和促進(jìn)型bHLH兩類[12]，前者包括Hes1、Hes3、Hes5等，Hes1和Hes5是維持神經(jīng)干細(xì)胞保持增殖狀態(tài)的必須因子，用以保證放射狀膠質(zhì)細(xì)胞維持增殖狀態(tài)。后者包括Mash1、Math、Ngn等，主要功能為保證神經(jīng)細(xì)胞的有效分化和功能發(fā)揮。此外，近年來(lái)表達(dá)量并不高的Hes6也引起了人們的關(guān)注，Hes6在分化以及未分化的細(xì)胞中都表所達(dá)，并對(duì)Hes1有一定的抑制作用。在Notch信號(hào)通路的所有配體中，Jagged-1能與多個(gè)受體結(jié)合，而Notch信號(hào)通路激活的第一步就是受體與配體的結(jié)合，因此可以認(rèn)為Jagged-1的表達(dá)是影響該信號(hào)通路激活與否的重要因素。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，8周自主運(yùn)動(dòng)后小鼠海馬內(nèi)的Jagged-1mRNA的表達(dá)量顯著上升，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)能夠促使該信號(hào)通路更多的受體與配體結(jié)合。此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)后Notch信號(hào)通路下游最重要的靶基因Hes1的基因表達(dá)量也顯著提高，而Hes1是啟動(dòng)細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因子。但運(yùn)動(dòng)組與對(duì)照組小鼠比較，Hes5和Hes6的mRNA水平?jīng)]有顯著性差異，分析原因可能與該基因在海馬內(nèi)的表達(dá)量較低有關(guān)，也可推測(cè)運(yùn)動(dòng)對(duì)Hes1的作用更為明顯，表達(dá)量較低的Hes6所起到的抑制作用不能體現(xiàn)。

神經(jīng)生長(zhǎng)因子（neuron growth factor）NGF是一種分子質(zhì)量為140 kD的跨膜型糖蛋白，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育、分化存活以及功能的維持起著至關(guān)重要的作用，主要分布在海馬、嗅球、大腦皮層及紋狀體中間神經(jīng)元的膽堿能神經(jīng)元內(nèi)[13]。其中海馬內(nèi)NGF的蛋白表達(dá)水平最高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)能夠促使NGF的表達(dá)升高，與對(duì)照組比較具有極顯著性差異（p＜0.01）。NGF 可以與其高親和力受體TrkA結(jié)合后，激活PI3K/Akt信號(hào)通路，活化的Akt可以使得凋亡基因失活，維持神經(jīng)元存活，使得新生的神經(jīng)細(xì)胞能夠整合到現(xiàn)有的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)回路中，發(fā)揮功能性作用。Patricia 等[4]運(yùn)用海馬神經(jīng)元培養(yǎng)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)：Notch信號(hào)通路與NGF可能存在交互作用，NGF可以通過(guò)與其低親和力受體P75結(jié)合，通過(guò)NF-kB介導(dǎo)引起Notch信號(hào)通路下游靶基因Hes1/5表達(dá)水平的變化。

基于此，本研究對(duì)NGF與Notch信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子Jagged-1和Hes1作了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)NGF與Jagged-1的相關(guān)性系數(shù)為0.75，與Hes1的相關(guān)性系數(shù)為0.78，均表現(xiàn)為高度相關(guān)，并且運(yùn)動(dòng)組小鼠的NGF和Hes1的表達(dá)量均顯著升高。由此推測(cè)8周自主運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)調(diào)控NGF，并直接作用于Notch下游靶基因Hes1，啟動(dòng)神經(jīng)干細(xì)胞增殖。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，8周運(yùn)動(dòng)后PS1的mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著性變化，進(jìn)一步可以推測(cè)，8周自主運(yùn)動(dòng)后促使NGF 對(duì)Notch信號(hào)通路的激活作用更顯著，說(shuō)明NGF對(duì)自主運(yùn)動(dòng)的敏感性更強(qiáng)。但PS1在此過(guò)程中究竟發(fā)揮什么樣的功能還需要進(jìn)一步的探究。

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Effects of Voluntary Exercise on Neural Stem Cell Proliferation and Related Genes of Mice

LU Le，etal.
（PE School of Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China）

[Objective and Methods] 24 male mice borned 5 weeks (C57BL/6) are randomly divided into running group (n=12) and control group (n=12), while the running group do voluntary wheel running for 8 weeks. Since the 5th week, 12 mice( each 6 from the two groups) were datelabelled with BrdU for one week, at the. The 12 mice without BrdU datelabelled were killed on the last day after 8 weeks exercise, bilateral hippocampal of them were taken out to be kept in - 80 ℃ cryogenic refrigerator, the mRNA levels of NGF, Jagged-1 mRNA, PS1, Hes1, Hes-5, Hes6 of them were tesetd by RT-PCR method. The 12 mice with BrdU datelabelled were pretreated by immunohistochemical method, then were stained with the method of BrdU single standard immunofluorescence. From the perspective of morphological, neural stem cells proliferation of them were observed and counted. [Results] After 8 weeks of autonomous movement, number of hippocampal neural stem cells increased significantly (p ＜ 0.01) , the ligand Jagged-1 in Notch signaling pathway, mRNA expression level of Hes1 target gene were significantly increased (p ＜ 0.01). the amount of mRNA expression of nerve growth factor NGF significantly increased (p ＜ 0.01).There is highly correlation among model NGF, ligand Jaged-1 and target genes Hes1 (p ＜ 0.01).[Conclusion] 8 weeks voluntary exercise can obviously increase BrdU+labeled neural stem cells in hippocampal region; Voluntary exercise significantly increased Jagged-1 and Hes1gene expression, illustrating that voluntary exercise activate the Notch signaling pathway, which impact the hippocampal neural stem cell proliferation; NGF could directly regulate Notch downstream target genes expressions, which participate in the regulation of neural stem cell proliferation, and affect the ability of learning and memory.

neural stem cell proliferation; Notch signal pathway; voluntary wheel exercise; NGF

陸樂(lè)（1987-），上海人，助理實(shí)驗(yàn)師，研究方向：體育運(yùn)動(dòng)與身心健康。