齊口裂腹魚肌肉品質及其PPARγ、PGC-1α相對表達量分析

馮　姣，鄔應龍，夏曉杰，曾麗萍

（四川農業(yè)大學食品學院，四川雅安625014）

FENG Jiao，WU Ying-long*，XIA Xiao-jie，ZENG Li-ping

（College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

齊口裂腹魚肌肉品質及其PPARγ、PGC-1α相對表達量分析

馮姣，鄔應龍*，夏曉杰，曾麗萍

（四川農業(yè)大學食品學院，四川雅安625014）

通過對不同質量的齊口裂腹魚肌肉品質的相關指標進行分析，并采用實時熒光定量PCR技術對其組織中過氧化物酶體增殖物激活受體輔激活子1α（PGC-1α）及過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）的相對表達量開展研究。結果表明：不同質量的齊口裂腹魚肌肉中蛋白質、粗脂肪含量存在顯著性差異（p＜0.05），其水分、灰分含量差異不顯著（p＞0.05）；肌肉的pH沒有差異，大魚的失水率高于中魚與小魚，小魚與中魚肌肉中氨基酸總量、必需氨基酸和鮮味氨基酸的含量均高于大魚；中、小魚的肌肉品質高于大魚。在不同質量齊口裂腹魚的頭腎、肝臟、肌肉中，PPARγ的相對表達量均存在顯著性差異（p＜0.05）；PGC-1α在頭腎中相對表達量存在顯著性差異（p＜0.05），在肝臟、肌肉中差異不顯著（p＞0.05）；PPARγ、PGC-1α在組織中的相對表達量與肌肉中粗脂肪含量有一定關聯。

齊口裂腹魚，肌肉品質，PPARγ，PGC-1α，相對表達量

FENG Jiao，WU Ying-long*，XIA Xiao-jie，ZENG Li-ping

（College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

齊口裂腹魚（Schizothorax prenanti Tchang）屬于鯉科裂腹魚屬動物，又名“雅魚”，廣泛分布于長江上游、金沙江、青衣江、烏江下游等水域，魚肉色雪白、肉質細嫩、肉味鮮美，是全國名菜砂鍋魚頭的首選魚頭，屬于名貴的經濟魚類。由于齊口裂腹魚的稀有及其肉味鮮美，現已引起許多學者的研究興趣。溫安祥等[1]對天然齊口裂腹魚魚種、成魚及人工養(yǎng)殖的齊口裂腹魚的肌肉成分進行了分析研究；向梟等[2]研究了飼料中五種不同來源的脂肪對齊口裂腹魚的生長性能和血清中甘油三酯、總膽固醇含量、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶等生化指標的影響。

過氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisome proliferator-activated receptor，PPARs），在脂代謝過程中起著重要作用。PPARγ（Peroxisome proliferator-activated receptorγ）屬PPARs的異構體，調節(jié)包括脂質和葡萄糖穩(wěn)態(tài)在內的代謝過程[3]。過氧化物酶體增殖物激活受體輔激活子1α（peroxisome proliferatoractivated receptor-coactivator1α，PGC-1α）是PPARγ轉錄輔助激活因子，通過調控PPARγ介導的下游靶基因的轉錄等環(huán)節(jié)，參與調節(jié)多種脂質代謝通路[4]。具有調節(jié)適應性產熱[5-6]，促進線粒體的合成[7]，調控骨骼肌的纖維類型轉化及葡萄糖代謝過程[8-9]，調節(jié)心肌能量代謝[10-11]等作用。林亞秋等[12]克隆了齊口裂腹魚過氧化物酶體增殖激活受體γ（PPARγ）輔助活化因子1α（PGC-1α），并探討了該基因在肌肉組織中的表達量。目前有關不同質量齊口裂腹魚肌肉的品質及不同組織中PGC-1α、PPARγ相對表達量的研究較少。由于齊口裂腹魚生長緩慢，市場銷售的齊口裂腹魚普遍為500g左右，本研究選取的質量等級分別為150、300、500g，代表著稚魚、亞成魚、成魚三個不同生長階段的魚體，通過本研究探明不同質量齊口裂腹魚肌肉品質差異和PGC-1α、PPARγ在不同組織中相對表達量的差異，為該魚不同生長階段的肌肉品質及PGC-1α、PPARγ的研究提供參考資料。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

實驗用魚購自四川省雅安市天全縣雅魚場，按照三個重量級別，簡稱為大、中、小魚，每個重量級別隨機撈取20尾，經測量得齊口裂腹魚形體指數如表1所示；RNAiso Plus、RNA反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒TaKaRa公司；瓊脂糖北京方寶生物科技有限公司；不同規(guī)格的槍頭、0.2μL PCR管GCS公司；熒光定量八聯板美國Bio-Rad公司。

表1　大、中、小魚的形體指數Table.1　The body index of large，medium and small-sized fish

HITACHI L-8900氨基酸自動分析儀日本日立公司；PCR儀器、熒光定量PCR儀、凝膠成像系統、水平電泳槽及電泳儀美國Bio-Rad公司；微量移液槍、Centrifuge 5810R高速低溫離心機德國Eppendorf公司等。

1.2實驗方法

1.2.1肌肉品質相關指標測定將魚解剖，取完各臟器樣品后，使用流水快速沖洗，去除血污等雜物，背鰭處吸干水，剝皮后，割離肉（要求無骨無刺）粉碎，密封袋儲存，用于魚肉常規(guī)指標測定。采用常規(guī)烘干失重法測定魚肉中的水分含量，凱氏定氮法測定粗蛋白含量，索氏抽提法測定粗脂肪含量，干灰化法來測定灰分；參考GB/T 5009.124-2003，測定肌肉中的氨基酸組成。

取粉碎的魚肉5g（重量即為m0），加入少量蒸餾水，用研缽碾碎勻漿，轉移到小燒杯內，加入等量蒸餾水混和均勻，靜置10min后，提取上清液，用酸度計測定pH，做3次平行，取平均值。

取魚體背部肌肉（相同位置）5g（重量即為m0），于沸騰水中煮5min，撈出冷卻，吸去魚肉表面水分，稱重為m，做3次平行，取平均值。失水率計算公式為：

1.2.2PPARγ、PGC-1α相對定量

1.2.2.1組織取樣PGC-1α主要在能量代謝旺盛的肝臟、肌肉、腎臟中表達，具有明顯的組織特異性[13-14]。將魚禁食12h后撈出，解剖，取其頭腎、肌肉、肝臟迅速標記通過液氮轉入-80℃冰箱中保存。

1.2.2.2磨樣將從三尾魚取出的相同組織放入研缽中通過液氮研磨混樣，每種體型魚的每個組織做三個平行，研磨好后迅速裝入提前冷凍好的EP管中，并迅速通過液氮轉入-80℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3總RNA提取及反轉錄為cDNA嚴格按照寶生物工程有限公司RNAiso Plus試劑說明書提取齊口裂腹魚各組織的總RNA，用紫外分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量。為防止RNA的降解，用1μL的總RNA按照TaKaRa公司生產的反轉錄試劑盒處理得到第一股cDNA。

1.2.2.4熒光定量引物設計與合成：以齊口裂腹魚β-actin基因序列（JQ013000）為依據設計內參基因的引物；采用Primer Premier 5.0軟件，參考GenBank中草魚PPARγ基因序列（Eu847421.1）和PGC-1α基因序列（JN195739）的保守區(qū)域，設計用于齊口裂腹魚PPARγ、PGC-1α基因擴增的正反引物，序列如表2所示。

表2　引物序列及退火溫度Table.2　Primer sequences and anneal temperature

實時熒光定量PCR基因檢測：使用1.2.2.3步驟中制備的cDNA，按照TaKaRa公司生產的熒光定量試劑盒說明書，配制10μL反應體系于0.2mL八聯管中，含5μL SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）、上下游引物各0.25、1μL cDNA、3.5μL DEPC水。熒光定量PCR程序為95℃3min；95℃10s，退火溫度（待測基因）30s，39個循環(huán)；95℃10s；擴增完畢后，迅速降溫到65℃進行溶解曲線分析，然后以0.5℃/s的速率從65℃遞增到95℃，連續(xù)測定樣品熒光強度以獲取溶解曲線。

相對表達量分析：以β-actin為內參基因，根據擴增曲線得到的Ct值（熒光信號達到設定的閾值所經歷的循環(huán)數），利用推導公式相對表達量=2-△Ct[15]計算出目標基因（PPARγ、PGC-1α）的相對表達量，從而制作相對表達量圖表，式中△Ct=Ct待測基因－Ctβ-actin。

1.3數據統計分析

部分數據以均數±標準差來表示，采用SPSS 20.0軟件單因素方差分析組間數據，通過Duncan’s多重比較法分析結果的差異顯著性，p＜0.05為顯著性差異，p＞0.05為無顯著性差異，部分數據以平均值表示。

2　結果與分析

2.1不同質量齊口裂腹魚肌肉品質相關指標分析

2.1.1不同質量齊口裂腹魚肌肉基本成分分析水分、脂肪、蛋白質、灰分是肌肉中的主要組成成分。不同質量齊口裂腹魚肌肉的基本成分見表3。由表3可知不同質量齊口裂腹魚肌肉中粗脂肪含量有著顯著性差異（p＜0.05），大魚中的脂肪含量最低；小魚與中魚肌肉中蛋白質含量差異不顯著（p＞0.05），但顯著高于大魚中的蛋白質含量；大、中、小魚肌肉中水分、灰分含量無顯著性差異（p＞0.05）。

表3　齊口裂腹魚的基本成分Table.3　The general nutritional composition of Schizothorax prenanti Tchang

一般認為，魚肉中的水分含量高，則蛋白質、脂肪含量將會減少，魚肉品質就差；相反，魚肉水分含量低，則蛋白質、脂肪含量就高，魚就肥嫩好吃[16]。由表3可知，大魚中水分含量高，但蛋白質、脂肪含量低，而小魚、中魚水分含量低，脂肪、蛋白質含量則高。溫安祥等[1]研究表明天然情況下，隨著魚體重的增長，其水分、粗蛋白與灰分含量略有降低，但粗脂肪含量明顯增加，水分與粗脂含量與該結論相悖，這可能是受采樣的季節(jié)和樣品性別的影響。

2.1.2不同質量齊口裂腹魚肌肉pH及失水率的分析

魚被宰殺以后，肌肉在其內部各種酶及外界微生物的作用會產生一系列的變化。正常肌肉在宰殺之前呈中性或者弱堿性，宰殺之后，糖原在缺氧的條件下酵解產生乳酸，pH則會降低。隨后，體內的蛋白質不斷分解，形成氨基酸、肽、蛋白胨等，又會引起pH回升，當pH升至6.9以上時，肉會腐爛。如表4所示，魚被宰殺后，放置一段時間，測定pH，不同質量齊口裂腹魚的pH無差異。表明魚的重量增長對肌肉的pH沒有影響。

表4　齊口裂腹魚肌肉pH及失水率Table.4　The pH value and dehydration rate in muscle of Schizothorax prenanti Tchang

肌肉組織的持水力直接影響著肉的色、香、味、多汁性、嫩度等。失水率是反應肌肉組織保持水分能力的一個重要指標，失水率高，則大量液體外流，可溶性營養(yǎng)成分和風味物質就會損失，肌肉也會變得干硬無味，從而導致肉品質降低。由表4可知小魚肌肉的失水率最低，而大魚的失水率最高。

2.1.3不同質量齊口裂腹魚肌肉氨基酸組成分析氨基酸是蛋白質的組成單元。如表5所示，除了在水解過程中色氨酸被破壞外，不同重量的齊口裂腹魚均檢測出了17種氨基酸，小魚肌肉干質中總氨基酸含量、必需氨基酸含量以及鮮味氨基酸含量均高于中魚和大魚，且大魚中的氨基酸含量最低，各種氨基酸在三種不同體型魚中的分布相似，谷氨酸的含量最高，其次是天冬氨酸、賴氨酸，胱氨酸的含量最低。

表5　齊口裂腹魚肌肉氨基酸分析Table.5　The analysis of amino acid in muscle of Schizothorax prenanti Tchang

由于大魚肌肉的失水率高于中魚與小魚，而失水率高會造成可溶性營養(yǎng)成分和風味物質的嚴重損失，因此大魚肌肉中的總氨基酸含量、鮮味氨基酸含量、必需氨基酸含量低于中魚，中魚低于小魚。肌肉中氨基酸的種類及分布與方靜等[17]對齊口裂腹魚肌肉營養(yǎng)成分分析結果一致，但氨基酸含量稍低于其研究結果，這可能是由于氨基酸分析所用魚肉經過解凍后處理所致。

2.2PPARγ在不同質量齊口裂腹魚的不同組織中的相對表達量分析

PPARγ在不同質量齊口裂腹魚的不同組織中的相對表達量結果如圖1、圖2所示。

圖1　頭腎中PPARγ mRNA相對表達量Fig.1　PPARγ gene expression level in head kidney

圖2　肌肉、肝臟中PPARγ mRNA相對表達量Fig.2　PPARγ gene expression level in muscle and liver

由圖1可知PPARγ在中魚頭腎中的表達量顯著（p＜0.05）高于在大魚、小魚中的表達量，在小魚中的表達量又顯著（p＜0.05）高于大魚中的表達量；由圖2可知PPARγ在肝臟與肌肉中的相對表達量，在大、中、小魚中有著顯著性差異（p＜0.05），在小魚肝臟與肌肉中PPARγ相對表達量顯著（p＜0.05）高于大、中魚，在中魚肝臟與肌肉中相對表達又顯著（p＜0.05）高于大魚中的相對表達量。

影響魚肌肉粗脂肪含量的因素很多，龔蘭[18]與Anna等[19]的研究表明，PPARγ的表達與體脂和肌內脂肪含量呈一定的相關性。PPARγ能夠誘導小脂肪細胞的形成，調控脂蛋白酯酶、脂肪型脂肪酸結合蛋白、乙酰輔酶A、脂肪酸合成酶與脂肪酸轉運蛋白等的表達，抑制瘦素的表達。通過本實驗研究發(fā)現，PPARγ在大、中、小魚頭腎中相對表達量的差異與魚肉中粗脂肪含量差異相同。頭腎是魚體重要的免疫器官，PPARγ可通過調節(jié)免疫相關的代謝通路來調節(jié)脂質代謝，但調節(jié)機理目前尚不明確。PPARγ在中魚與小魚肝臟與肌肉中的相對表達量顯著（p＜0.05）高于在大魚中的相對表達量，這與中、小魚肉中的粗脂肪含量顯著（p＜0.05）高于大魚肉中的粗脂肪含量結果一致，表明PPARγ在組織中的相對表達量與肉質中脂肪沉積可能存在正相關的關系，這與Meadus[20]、Tamori等[21]學者關于PPARγ與脂質代謝的研究結果相似。

2.3PGC-1α在不同質量齊口裂腹魚不同組織中的相對表達量分析

圖3　頭腎中PGC-1α mRNA相對表達量Fig.3　PGC-1α gene expression level in head kidney

圖4　肌肉、肝臟中PGC-1α表達量Fig.4　PGC-1α gene expression level in muscle and liver

由圖3可知，PGC-1α在大、中、小魚頭腎中的相對表達量有著顯著性差異（p＜0.05），在大魚中的相對表達量顯著（p＜0.05）高于中魚和小魚中的相對表達量，在小魚中的相對表達量又顯著（p＜0.05）高于中魚的相對表達量；而圖4則反映了PGC-1α在大、中、小魚肌肉與肝臟組織中的相對表達量無顯著性差異（p＞0.05）。

PGC-1α在大、中、小魚頭腎中的相對表達量存在顯著性差異，而在肌肉與肝臟中的相對表達量沒有顯著性差異，但可以看出PGC-1α在三個組織中的相對表達量與魚肉中粗脂肪含量可能存在負相關系。PGC-1α可以促進長鏈脂肪酸進入線粒體進行氧化[22]，PGC-1α缺陷或表達量降低，長鏈脂肪酸的氧化速率就會降低，線粒體的呼吸率就會下降，就會影響肥胖的發(fā)生。Koo等[23]將小鼠的PGC-1α敲出會表現出脂肪酸氧化能力下調，導致脂肪沉積，這與本研究的結論相似。

3　結論

通過對不同質量的齊口裂腹魚肌肉品質進行分析，發(fā)現中、小魚肌肉中的蛋白質、脂肪、鮮味氨基酸、必需氨基酸的含量高于大魚肌肉中的含量，而失水率低于大魚肌肉的失水率，因此齊口裂腹魚魚肉的品質及營養(yǎng)價值與魚體生長存在一定的關系，中、小體型齊口裂腹魚肌肉的品質及營養(yǎng)價值高于大魚；通過熒光定量PCR技術對齊口裂腹魚不同組織中的PPARγ、PGC-1α基因相對表達量進行分析，發(fā)現齊口裂腹魚組織中PPARγ、PGC-1α的相對表達量與肌肉中的粗脂肪含量存在著密切的聯系，PPARγ的相對表達量與肌肉粗脂肪含量可能存在正相關性，而PGC-1α的相對表達量與肌肉脂肪沉積可能存在負相關性，三者之間的關系及調節(jié)機理尚不完全明確，有待于進一步驗證及深入研究。

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Analysis of muscle quality and the relative expression of PPARγ and PGC-1α in Schizothorax Prenanti Tchang

In this paper，the quality of muscle in Schizothorax prenanti Tchang of different weight was analyzed and the Real-time PCR was applied to explore the relative expression of PGC-1α and PPARγ of the fish in different tissue.The results showed that the content of protein and crude fat in Schizothorax prenanti Tchang of different weight were significant difference（p＜0.05）.The content of moisture and ash were revealed to be no significant difference（p＞0.05）.The pH value in muscle was no difference.The dehydration rate in big fish was higher than the medium and small fish.The contents of total amino acids，essential amino acids and the umami amino acids in small and medium fish were higher than the big one.The quality of muscle in small and medium fish was better than big one.The relative expression of PPARγ in the head kidney，liver and muscle of Schizothorax prenanti fish of different qualities was existed significant difference（p＜0.05）.The relative expression of PGC-1α in the head kidney existed significant difference（p＜0.05），and revealed no significant difference（p＞0.05）in liver and muscle.The expression of PPARγ and PGC-1α had a certain correlation with the crude fat in muscle.

Schizothorax prenanti Tchang；the quality of muscle；PPARγ；PGC-1α；relative expression

TS254.2

A

1002-0306（2015）04-0175-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.030

2014－05－09

馮姣（1989-），女，碩士研究生，研究方向：功能性食品。

鄔應龍（1963-），男，博士，教授，研究方向：功能性食品。

四川省科技支撐計劃項目（2009NZ007-007）；四川農業(yè)大學“211”工程雙支計劃（2013）。