秋葵多糖與α-淀粉酶的相互作用及光譜學分析

張首玉，周婧琦，李少華，孫　艷，高愿軍

（1.河南職業(yè)技術學院烹飪食品系，河南鄭州450046；2.漯河食品職業(yè)學院，河南漯河463200；3.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南鄭州450001）

秋葵多糖與α-淀粉酶的相互作用及光譜學分析

張首玉1，周婧琦2，李少華1，孫艷2，高愿軍3，*

（1.河南職業(yè)技術學院烹飪食品系，河南鄭州450046；2.漯河食品職業(yè)學院，河南漯河463200；3.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南鄭州450001）

研究秋葵多糖對α-淀粉酶的抑制作用，并運用紫外光譜對其相互作用的光譜進行探討，結(jié)果表明，秋葵多糖對α-淀粉酶具有較強的抑制性，且隨其濃度的增加而增強，其抑制類型屬于競爭可逆型。經(jīng)過紫外光譜分析表明，隨著秋葵多糖濃度的不斷增加其吸收峰逐漸增強且發(fā)生藍移，證明秋葵多糖與α-淀粉酶混合時彼此之間發(fā)生了作用。

秋葵多糖，淀粉酶，抑制作用，光譜

秋葵富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素、多糖、黃酮類等化合物，屬于低脂肪、低熱量、無膽固醇的食藥兩用營養(yǎng)保健新型蔬菜，具有極高的藥用保健功能，如降血糖、抗疲勞、利尿、健胃、抗菌、抗氧化、抗誘變止血等[1]。作為一種天然的藥物資源，秋葵在食品以及保健品行業(yè)具有著廣闊的開發(fā)前景。

多糖作為秋葵的功能成分之一與其具有的部分生物活性有著密切的聯(lián)系，已有研究證實，經(jīng)高脂飲食誘導的肥胖C57BL/6小鼠，秋葵可以降低其血糖和血脂。α-淀粉酶是一種與糖脂代謝密切相關的酶類，對α-淀粉酶抑制作用的研究是探討降糖降脂作用機理的有效手段之一[2]。經(jīng)研究顯示，α-淀粉酶抑制劑屬于糖苷水解酶抑制劑中的一種，它能有效抑制唾液淀粉酶和胰淀粉酶的活性，阻礙食物中碳水化合物的消化吸收，從而起到降低血糖和血脂的作用[2]，但關于秋葵多糖對α-淀粉酶的抑制效應還未見報道。本實驗研究秋葵多糖對α-淀粉酶的抑制機理，為進一步研究秋葵多糖的降糖降脂效應提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

秋葵市售；α-淀粉酶、阿卡波糖生化試劑；無水乙醇、鹽酸、碘、碘化鉀、可溶性淀粉、丙酮、氯化鈉分析純。

AL240電子天平梅特勒-托里儀器有限公司（上海）；UV-200紫外分光光度計龍尼柯儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；SHZ-6循環(huán)水式多用真空泵河南省英峪中華儀器廠；PHS-3C酸度計上海理達儀器廠；Scientz-10N冷凍干燥機寧波新芝生物科技股份有限公司；HC-3618R高速冷凍離心機安徽中科科學儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1秋葵多糖的制備[3]用蒸餾水清洗新鮮秋葵嫩莢，將其放于冷凍干燥機-80℃干燥后磨成粉狀。采用纖維素酶的方法浸提，用80%的無水乙醇4℃冷藏醇沉過夜，離心收集沉淀，運用Sevage法脫除蛋白，經(jīng)大孔樹脂AB-8進一步純化，冷凍干燥得秋葵多糖（RPS1）備用。

1.2.2酶活力的測定方法參考國標GB 8275-2009對樣液進行配制[4]，采用碘-淀粉呈色法測定。

取α-淀粉酶和秋葵多糖溶液各0.5mL將其混勻，在37℃恒溫水浴鍋中反應30min，加入可溶性淀粉溶液1mL，再在水浴鍋中預熱15min后用濃度為2mol/L的鹽酸溶液0.3mL中止反應，用4mL蒸餾水稀釋搖勻，立即將反應液加入到預先盛有0.2mL稀碘液的試管中，搖勻，以不加多糖溶液作為空白對照，在660nm波長下測定其OD值。根據(jù)式（1）計算樣品的酶活力。

式中：X—樣品酶活力，U/mg；c—測試的樣液濃度，mg/mL；n—加入抑制劑體積，mL。

1.2.3淀粉標準曲線的制作分別配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mg/mL質(zhì)量濃度的可溶性淀粉標準溶液，在試管內(nèi)分別加入上述標液1mL置于37℃恒溫水浴鍋中反應30min，再在水浴鍋中預熱15min后用濃度為2mol/L的鹽酸溶液0.3mL中止反應，用4mL蒸餾水稀釋搖勻，立即將反應液加入到預先盛有0.2mL稀碘液的試管中，搖勻，以蒸餾水作為空白對照，在660nm波長下測定其吸光值，以可溶性淀粉質(zhì)量濃度作為橫坐標，吸光值作為縱坐標，繪制可溶性淀粉溶液的標準曲線。

1.2.4秋葵多糖濃度對α-淀粉酶抑制效應的影響

以阿卡波糖對α-淀粉酶活性的抑制作為對照實驗。分別稱取不同質(zhì)量純化后的秋葵多糖和阿卡波糖配制成不同濃度的溶液，運用1.2.2酶活力的測定方法測量其對α-淀粉酶活性的抑制影響，抑制率的計算如式（2）所示。

式中，I—抑制率，%；T1—抑制劑活力，U/mg；T2—酶活力，U/mg。

1.2.5秋葵多糖與α-淀粉酶作用時間對酶抑制效應的影響分別在秋葵多糖濃度0.5mg/mL和阿卡波糖濃度0.35mg/mL下，與α-淀粉酶作用不同的時間，根據(jù)1.2.2酶活力的測定方法，在pH為7室溫條件下測定其OD值，計算抑制率，研究秋葵多糖對酶抑制活性的影響。

1.2.6不同pH條件下秋葵多糖對酶活性的抑制影響

秋葵多糖濃度0.5mg/mL，以阿卡波糖（0.35mg/mL）作為對比實驗，室溫下靜置5min，根據(jù)1.2.2酶活力的測定方法，研究不同pH對酶活性的抑制影響。

1.2.7秋葵多糖對α-淀粉酶抑制效應的研究固定底物的濃度為0.5mg/mL的α-淀粉酶，分別加入其質(zhì)量為0、10、20、30、40、50μL，根據(jù)1.2.2酶活力的測定方法，研究不同濃度下的秋葵多糖抑制α-淀粉酶酶活力隨底物濃度的變化情況，以α-淀粉酶的加入量為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制抑制效應曲線。

1.2.8秋葵多糖對α-淀粉酶抑制類型的研究根據(jù)1.2.2酶活力的測定方法，加入定量50μL的α-淀粉酶，改變其質(zhì)量濃度，研究不同濃度下秋葵多糖的酶活力隨底物濃度的變化規(guī)律，以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，繪制秋葵多糖對α-淀粉酶抑制作用的動力學曲線，判斷其抑制類型。

1.2.9秋葵多糖與α-淀粉酶相互作用的紫外光譜分析根據(jù)抑制作用強、中、弱分別取秋葵多糖溶液濃度0.1、0.45、0.6mg/mL與α-淀粉酶混勻置于37℃恒溫水浴鍋中15min，在波長為180～600nm范圍內(nèi)進行紫外光譜掃描。

1.3數(shù)據(jù)處理

實驗中的圖表均采用Excel、SPSS軟件進行了處理與分析，每處理重復3次。

2　結(jié)果與討論

2.1淀粉標準曲線的繪制

可溶性淀粉溶液的標準曲線如圖1所示。

從圖1可以看出，回歸方程為y=1.2556x+0.0214（R2=0.9966），說明淀粉質(zhì)量濃度在0.1～0.7mg/mL區(qū)間線性關系良好。根據(jù)淀粉標準曲線方程得酶活力的計算公式如式（3）所示。

式中：OD1—加入抑制劑后的吸光值；OD2—只加α-淀粉酶時的吸光值；n—所加抑制劑體積，mL。

2.2秋葵多糖濃度對α-淀粉酶抑制效應的影響

不同濃度的秋葵多糖對α-淀粉酶的抑制率見圖2。

從圖2可以看出，作為陽性對照實驗的阿卡波糖對α-淀粉酶具有較強的抑制作用，秋葵多糖對α-淀粉酶也具有一定的抑制作用，但抑制率低于阿卡波糖，在0.1～0.5mg/mL濃度范圍內(nèi)，秋葵多糖對α-淀粉酶的抑制作用呈現(xiàn)出一定的量效關系，隨其濃度的增加抑制作用增強，當多糖溶液的濃度達到0.5mg/mL時，抑制率達到約80%且趨于恒定。

圖2　秋葵多糖濃度對酶抑制效應的影響Fig.2　Effect of okra polysaccharide with different concentration on the inhibiting activity of enzyme

2.3秋葵多糖與α-淀粉酶作用時間對酶抑制效應的影響

根據(jù)圖3實驗結(jié)果，分別配制其最大抑制率濃度依次為阿卡波糖溶液濃度0.35mg/mL和秋葵多糖溶液濃度0.5mg/mL，研究它們各自與α-淀粉酶反應時間的長短對其抑制率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3　秋葵多糖與酶作用時間對酶抑制效應的影響Fig.3　Effect of different reaction time on the inhibiting activity of enzyme

由圖3可知，作為陽性對照實驗的阿卡波糖在5min內(nèi)，抑制率就達到了82%，說明其在短時間內(nèi)能與α-淀粉酶迅速有效地結(jié)合，表現(xiàn)出較強的抑制性。而秋葵多糖與α-淀粉酶的結(jié)合能力明顯低于阿卡波糖，當抑制率達到78%時，隨著反應時間的延長其抑制率基本處于穩(wěn)定，所需時間約15min。由此可知，秋葵多糖對α-淀粉酶具有一定的抑制作用，但其作用時間較長，抑制能力低于阿卡波糖。

2.4不同pH條件下秋葵多糖對酶活性的抑制影響

分別配制阿卡波糖溶液濃度0.35mg/mL和秋葵多糖溶液濃度0.5mg/mL，研究它們在不同pH條件下對α-淀粉酶活性的抑制影響，結(jié)果見圖4。

從圖4可以看出，對照實驗阿卡波糖在不同pH條件下對α-淀粉酶的量效曲線基本接近直線，因此在酸堿環(huán)境下呈現(xiàn)良好的劑量依賴性。秋葵多糖在pH1～6范圍內(nèi)，對α-淀粉酶的抑制作用相對穩(wěn)定，抑制率一直保持在一恒定的范圍；當pH7～12時，秋葵多糖對α-淀粉酶的抑制作用逐漸減弱，抑制率不斷降低?？梢?，秋葵多糖在酸性環(huán)境下對α-淀粉酶表現(xiàn)出了較強的抑制活性，但在堿性環(huán)境中，抑制作用有所下降。

圖4　不同pH條件秋葵多糖對酶抑制效應的影響Fig.4　Effect of pH on the inhibiting activity of enzyme

2.5秋葵多糖對α-淀粉酶抑制效應的影響

判定對酶的抑制作用類型可逆與否，除了用透析、超濾或凝膠過濾等物理方法看能否除去抑制劑來區(qū)別外，還可以采用酶抑制動力學方法判斷[5]。以加酶量分別為0、10、20、30、40、50μL的條件下，根據(jù)1.2.2酶活力的測定方法，研究不同抑制作用強度的秋葵多糖（0、0.45、1mg/mL）時對α-淀粉酶的抑制率，判斷其抑制效應，結(jié)果見圖5。

圖5　秋葵多糖對α-淀粉酶的抑制效應Fig.5　The depression effect of α-amylase by okra polysaccharide

從圖5可以看出，α-淀粉酶加酶量與其攝入后OD值作圖得到一系列通過原點的直線，隨著秋葵多糖濃度的增加，其直線斜率逐漸降低，秋葵多糖對α-淀粉酶活力的抑制作用不斷加強，符合可逆抑制作用的特點[6]。所以，秋葵多糖對α-淀粉酶的抑制類型屬于可逆抑制。

2.6秋葵多糖對α-淀粉酶抑制類型的動力學測定

將濃度分別為0、0.25、1mg/mL的秋葵多糖溶液作為α-淀粉酶的抑制劑[S]，測定不同底物濃度的α-淀粉酶酶促反應的抑制速率[V]即OD值。以1/[S]作為橫坐標，1/[V]作為縱坐標，繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)動力學曲線，如圖6所示。

從圖6可以看出，3條不同質(zhì)量濃度的秋葵多糖溶液對α-淀粉酶抑制作用的動力學曲線均為不通過原點的直線，當加入秋葵多糖抑制劑后，抑制速率V并未發(fā)生很大的變化，但隨著所需底物濃度明顯地增加，其抑制速率逐漸增大，即米氏常數(shù)Km增大，其抑制機理呈現(xiàn)出典型的競爭性抑制類型，說明秋葵多糖對α-淀粉酶的抑制作用屬于競爭性抑制。由于秋葵多糖屬于競爭性抑制劑，又與酶的結(jié)合是可逆的，因而可通過增加底物濃度，提高底物競爭力的辦法，消除競爭性抑制劑的抑制作用，從而使酶促反應速率接近或達到最大值。

圖6　秋葵多糖對α-淀粉酶抑制類型的動力學分析Fig.6　The kinetic analysis of inhibition type on α-amylase by okra polysaccharide

2.7秋葵多糖與α-淀粉酶相互作用的紫外光譜分析

將不同濃度的秋葵多糖與α-淀粉酶混勻置于37℃恒溫水浴鍋中反應15min，在波長為180～600nm范圍內(nèi)進行紫外光譜掃描，結(jié)果見圖7。

圖7　秋葵多糖與α-淀粉酶的紫外光譜分析Fig.7　The UV spectra of okra polysaccharide and α-amylase

由圖7可知，α-淀粉酶在290nm附近有紫外吸收峰，這主要是由于色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）光吸收以及與酶構象和螺旋有關的相互作用所引起[7-8]。隨著秋葵多糖濃度的不斷增加，其吸收峰逐漸增強且發(fā)生藍移。這說明秋葵多糖與α-淀粉酶混合時相互之間發(fā)生了作用，改變了酶分子中Trp和Tyr所處空間結(jié)構的微環(huán)境，從而引起了α-淀粉酶最大紫外吸收波長和強度的改變[9]，使其構象發(fā)生了改變。

3　結(jié)論

秋葵多糖對α-淀粉酶的抑制作用弱于阿卡波糖，但仍表現(xiàn)出較強的抑制作用，且隨其濃度的增加抑制作用增強，當溶液濃度達到0.5mg/mL時，抑制率達到80%。此外，秋葵多糖對α-淀粉酶的作用時間較長，抑制能力略低于阿卡波糖。秋葵多糖在酸堿環(huán)境下均表現(xiàn)出了較好的劑量依賴性，在酸性環(huán)境下其對α-淀粉酶具有較強的抑制作用，但在堿性環(huán)境中，其抑制作用有所下降。秋葵多糖對α-淀粉酶的抑制類型屬于競爭可逆型。通過紫外光譜分析，隨著秋葵多糖濃度的增加，其吸收峰逐漸增強且發(fā)生藍移，說明秋葵多糖與α-淀粉酶之間發(fā)生了作用。

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Effect of okra polysaccharide on α-amylase inhibition and its spectral analysis

ZHANG Shou-yu1，ZHOU Jing-qi2，LI Shao-hua1，SUN Yan2，GAO Yuan-jun3，*
（1.Department of Tourism＆Cooking，Henan Polytechnic，Zhengzhou 450046，China；2.Luohe Food Vocational College，Luohe 463200，China；3.College of Food and Biology Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450001，China）

The effects of okra polysaccharide on α-amylase and its UV spectra were studied in the test.The results showed that okra polysaccharide had strong inhibition ability on α-amylase，the increase of its concentration，and could lead to reversible competitive inhibition.Moreover，UV spectra showed that okra polysaccharide induced a blue shift of α-amylase warelength，and increased with the increase of its concentration.These results provided that interaction occured when mixed between the okra polysaccharide and α-amylase.

okra polysaccharide；α-amylase；inhibition；UV spectra

TS201.1

A

1002-0306（2015）04-0101-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.013

2014－05－26

張首玉（1972-），女，本科，副教授，研究方向：食品營養(yǎng)及食品安全。

高愿軍（1957-），男，博士，教授，研究方向：果蔬加工與貯藏。

漯河市科技計劃項目（2014071）。