產(chǎn)CLA乳酸菌體內(nèi)、體外抑菌活性的研究

陳　佳，許　暉

（蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽蚌埠233030）

產(chǎn)CLA乳酸菌體內(nèi)、體外抑菌活性的研究

陳佳，許暉

（蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽蚌埠233030）

采用體內(nèi)和體外抑菌法研究產(chǎn)CLA乳酸菌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌作用。體外抑菌實驗表明，乳酸菌發(fā)酵上清液對大腸桿菌的抑制作用最強，對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用相對較弱。體外研究還發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵液在pH＜5.0時，抑菌效果較好，并且具一定的熱穩(wěn)定性，對過氧化氫酶和蛋白酶的抗性較高。體內(nèi)抑菌實驗表明，該乳酸菌能夠有效降低以上三種致病菌引起的小鼠死亡率，且體內(nèi)抑菌效果隨劑量的增加而增強。結(jié)論：產(chǎn)CLA乳酸菌在體內(nèi)和體外均有較好的抑菌效果。

CLA，乳酸菌，抑菌作用，體內(nèi)，體外

乳酸菌是被FDA認(rèn)定的食品級安全微生物[1]，并且是我國允許添加到食品中的益生菌之一（如乳酸菌飲料、發(fā)酵肉制品等）。乳酸菌具多種活性功能，在醫(yī)學(xué)臨床上，通常使用乳酸菌制劑來調(diào)節(jié)腸道功能紊亂（如大腸炎癥等）以及改善機體營養(yǎng)狀況等[2]。許多研究報道表明，乳酸菌在發(fā)酵的過程中，除了能產(chǎn)生乳酸等活性物質(zhì)以外，還能夠產(chǎn)生亞油酸異構(gòu)酶，此酶能夠?qū)営退岙悩?gòu)化為共軛亞油酸[3]，如費氏丙酸桿菌嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）、乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）及植物乳桿菌等[4-7]。共軛亞油酸（Conjugated linoleic acid，CLA）是一種具有抗癌、調(diào)節(jié)免疫、脂質(zhì)代謝和抑菌等多種生理活性的天然脂肪酸功能因子[8-9]。天然CLA食用安全、無毒[10]，主要來源為動物性食品（如肉、乳制品等），植物性食品中含量較低[11-13]。但目前人們通過食用天然食品所獲得CLA的量遠低于營養(yǎng)推薦量（15～10mg/kg體重），所以在日常飲食中適當(dāng)補充CLA是必需的。由于乳酸菌兼性厭氧，能夠大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)，并且發(fā)酵條件可控制，因此可以作為CLA功能性食品開發(fā)的一種原菌種，應(yīng)用于食品工業(yè)。本實驗室從玉米青貯中分離篩選出一株高產(chǎn)CLA乳酸菌—植物乳桿菌ANCLA01，通過研究此菌在體內(nèi)、體外抑菌效果，明確其抑菌特性，為產(chǎn)CLA乳酸菌將來在功能性食品工業(yè)中的開發(fā)應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

植物乳桿菌ANCLA01來自于玉米青貯，由本實驗室分離篩選（中國國家微生物保藏中心保藏，保藏號：CGMCC No.1906）；大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌中國獸藥監(jiān)察所；過氧化氫酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶，乳酸蘇州奧維科生物科技有限公司；共軛亞油酸純品Sigma公司；乳酸桿菌培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、指示菌種所用培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂北京市微生物制品廠；改良MRS液體培養(yǎng)基（pH6.5）。

電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴鍋上海一恒科技有限公司；手提式高壓蒸汽滅菌鍋上海云泰儀器儀表有限公司；Centrifuge 5417高速冷凍離心機美國BECKMAN COULTER。

1.2實驗方法

1.2.1體外抑菌實驗

1.2.1.1菌液、菌體的制備

乳酸菌菌液的制備：將植物乳桿菌ANCLA01接到MRS液體培養(yǎng)基中，活化后傳代，再接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)48h；取發(fā)酵液于4℃，1000r/min，離心20min，取上清液備用。

指示菌菌液的制備：將大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌接種于普通營養(yǎng)瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)24h，加無菌水5mL，刮下菌苔制成細菌懸液，計數(shù)后，依次稀釋濃度為10-2～10-9的懸菌液待用。

乳酸菌菌體的制備：將上步離心后的沉淀用生理鹽水洗滌3次后，再稀釋至原菌液濃度。

指示菌的培養(yǎng)：將指示菌分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12h。

1.2.1.2排除乳酸對乳酸菌的抑菌作用的影響用乳酸調(diào)節(jié)與上清液相同pH的MRS液體培養(yǎng)基作為對照，乳酸菌上清液及菌體用相同體積的無菌水稀釋，用于抑菌實驗。

1.2.1.3熱處理對抑菌作用的影響將乳酸菌發(fā)酵上清液在50、60、80、90℃水浴60min后，用于抑菌實驗。

1.2.1.4pH對抑菌作用的影響將乳酸菌發(fā)酵上清液用高濃度的NaOH、HCI分別調(diào)pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0用于抑菌實驗。

1.2.1.5乳酸菌發(fā)酵上清液酶處理后的抑菌效果乳酸菌發(fā)酵上清液分別用過氧化氫酶（0.5mg/mL）、蛋白酶K（1.0mg/mL）、胃蛋白酶（1.0mg/mL）、胰蛋白酶（1mg/mL）在37℃孵育1h后，進行抑菌實驗。

1.2.2體內(nèi)抗菌實驗預(yù)實驗將不同濃度的大腸桿菌，沙門氏菌，金黃色葡萄球菌懸菌液按0.5mL/10g體重的劑量，分別注射于小鼠腹腔，每濃度組為8～10只，體重為18～22g，觀察小鼠4d內(nèi)死亡情況。選定致死率為50%的菌液濃度為實驗濃度。

1.2.3體內(nèi)抗菌實驗將生長良好的CLA乳酸菌制成細胞濃度為1.5×1011、2.0×1011、3.0×1011cfu/mL三個濃度的懸菌液備用。按體重相似原則，將小鼠隨機分為12組，每組20只，分別為空白對照組、低、中、高濃度各三組，每天用上述劑量的乳酸菌懸菌液對小鼠進行灌胃，灌胃量為0.5mL/10g體重，對照組灌胃相同體積生理鹽水。灌胃7d后，以預(yù)實驗所得的50%致死率濃度的大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌懸菌液給各組小鼠腹腔注射造成感染，注射后1、12h和24h時，對實驗組小鼠再灌胃乳酸菌懸菌液，空白對照組灌胃相同體積生理鹽水，觀察小鼠精神狀況及統(tǒng)計4d內(nèi)各組動物死亡率。

1.2.4CLA的檢測

1.2.4.1CLA標(biāo)準(zhǔn)曲線采用紫外吸光度檢測法，以正己烷作為參比，將純品CLA配制成不同濃度梯度，在234nm處測定吸收值，確定CLA含量并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2小鼠腸道食糜CLA的檢測統(tǒng)計小鼠存活率后，將存活的小鼠全部致死，無菌操作臺取腸道食糜1g，加無菌水和正己烷各5mL，振蕩萃取后，4℃，12000r/min，離心5min，破除乳化層，取正己烷相，用氮氣吹干，得到脂肪酸酸提取物，再溶于5mL正己烷后，進行CLA的測定。

1.3統(tǒng)計分析

采用SAS 6.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行ANOVA方差分析，并進行LSD多重比較。

2　結(jié)果與討論

2.1產(chǎn)CLA乳酸菌的體外抑菌作用的研究

2.1.1排除乳酸對乳酸菌的抑菌作用的影響對乳酸菌菌體、乳酸發(fā)酵上清液及對照液分別做了抑菌圈實驗，結(jié)果見表1，與相同pH的對照培養(yǎng)液相比，乳酸菌上清液的抑菌圈直徑比對照培養(yǎng)液大42.6%，差異極顯著（p＜0.01），而上清液的抑菌圈直徑比菌體的大76.5%，差異極顯著（p＜0.01）。此結(jié)果說明在體外乳酸菌菌體的抑菌作用很弱，大量的抑菌活性物質(zhì)存在于發(fā)酵上清液中，即乳酸菌的代謝產(chǎn)物抑菌活性較強。

表1　乳酸菌菌體及排除乳酸對乳酸菌抑菌效果的影響（mm）Table.1　Effect of Lactobacillus cell and removed lactic acid onCLA-producing Lactobacillus（mm）

表2　熱處理對產(chǎn)CLA乳酸菌抑菌作用的影響（mm）Table.2　Effect of heat treatment on CLA-producing Lactobacillus（mm）

2.1.2熱處理對乳酸菌抑菌作用的影響從表2可以看出，乳酸菌發(fā)酵上清液對三種指示菌均有較強的抑制作用，其中對大腸桿菌的抑制作用最強（p＜0.01），與王菲、李南薇等[14-15]對乳酸菌抑制大腸桿菌作用的研究結(jié)果較一致。將發(fā)酵上清液在不同溫度下處理，當(dāng)溫度達90℃時，發(fā)酵液對上述三種菌的抑菌活性盡管較對照組顯著下降（p＜0.05）但仍有抑菌活性。在50℃時，乳酸菌上清液對大腸桿菌的抑菌作用相對對照組下降了近44.4%，差異極顯著（p＜0.01）；當(dāng)處理溫度從50～90℃時，盡管發(fā)酵液抑菌作用緩慢下降，但是抑菌圈直徑大小差異不顯著（p＞0.05），說明該株植物乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)當(dāng)中，有一部分具有一定的耐熱性。與郭穎等[16]對植物乳酸桿菌抑菌物質(zhì)耐熱性特性研究結(jié)果較一致。

2.1.3pH對產(chǎn)CLA乳酸菌抑菌作用的影響從表3看出，乳酸菌發(fā)酵上清液pH為2.0時，對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均有較高的抑菌活性。隨著pH的升高，抑菌活性均呈下降趨勢，由于指示菌不同，各組發(fā)酵上清液抑菌活性下降程度略有不同；當(dāng)發(fā)酵上清液pH為5.0時，對三種菌都表現(xiàn)出較低的抑菌活性，并且差異極顯著（p＜0.01），pH為6.0時，對三種菌均失去于抑菌活性。說明酸度對乳酸菌的抑菌活性影響較大，可能是因為在較低的pH下，大量的酸性物質(zhì)抑制了細菌的生長繁殖，同時酸性物質(zhì)又能與乳酸菌產(chǎn)生的細菌素和其他的抑菌活性物質(zhì)協(xié)同作用，因此發(fā)酵上清液的抑菌效果較好。該結(jié)果與熊駿等[17]研究結(jié)果一致。

表3　pH對產(chǎn)CLA乳酸菌抑菌作用的影響（mm）Table.3　Effect of pH on CLA-producing Lactobacillus（mm）

2.1.4乳酸菌發(fā)酵上清液經(jīng)酶處理后的抑菌效果從表4可以看出乳酸桿菌代謝產(chǎn)物經(jīng)過過氧化氫酶、蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶處理后對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性幾乎沒有變化，三種指示菌的抑菌圈直徑差異不顯著（p＞0.05），說明該乳酸菌的代謝產(chǎn)物有較好的抗蛋白酶和抗過氧化氫酶的活性。

表4　酶處理對產(chǎn)CLA乳酸菌發(fā)酵上清液抑菌作用的影響（mm）Table.4　Effect of enzyme on CLA-producing Lactobacillus fermented supernatant（mm）

2.2產(chǎn)CLA乳酸菌的體內(nèi)抑菌活性的研究

通過預(yù)實驗對小鼠注射不同濃度的大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌懸菌液，確定了其50%致死率濃度分別為8.0×107、4.2×1011、7.0×107cfu/mL，此濃度為正式實驗注射濃度。注射后，觀察結(jié)果如表5。

表5　各小組注射致病菌后小鼠存活情況的比較Table.5　Effect of different does of CLA-producing Lactobacillus on survival in mice

圖1　CLA紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of ultraviolet absorption of CLA

圖2　產(chǎn)CLA乳酸菌對小鼠食糜CLA產(chǎn)量的影響Fig.2　Effect of CLA-producing Lactobacillus cultures on CLA in mice’s chyme

由表5可見，產(chǎn)CLA乳酸菌培養(yǎng)物對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌這三種致病菌引起的小鼠死亡率均有降低作用，并且隨著乳酸菌的劑量增加，體內(nèi)抑菌效果增強，小鼠死亡率極顯著的下降（p＜0.01）。從圖2看出，隨著灌服乳酸菌劑量的增大，小鼠腸道內(nèi)CLA產(chǎn)量上升，說明此菌株在腸道內(nèi)產(chǎn)CLA活性較高，其原因可能是在體內(nèi)產(chǎn)生的CLA能夠協(xié)同其他抑菌活性物質(zhì)共同作用，增強體內(nèi)抗菌作用，提高小鼠免疫力，降低死亡率。實驗期內(nèi)觀察小鼠精神狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)存活小鼠精神良好，無萎靡抑郁癥狀，采食正常。

3　結(jié)論

本實驗發(fā)現(xiàn)產(chǎn)CLA乳酸桿菌發(fā)酵液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌都有較強的抑菌活性。在體外，菌株產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物在較低pH下，具有很強的抑菌活性，但是單獨的乳酸桿菌菌體卻沒有很強的抑菌活性，說明在乳酸桿菌抑菌中起主要作用的成分存在于其代謝產(chǎn)物中，而菌體的抑菌活性可能只有在體內(nèi)有可能表現(xiàn)出來，因為它可與其他致病菌競爭消化道粘附位點，通過競爭營養(yǎng)而抑制病原菌的生長[18]。CLA除了具有改善脂肪代謝，抗癌、抑癌等一些生理活性功能外，一些動物實驗研究證明了：CLA在體內(nèi)可以增加溶菌酶活性，提高體內(nèi)抗體水平，增強機體的免疫力[19-20]。本實驗中乳酸菌產(chǎn)生的CLA與乳酸菌本身產(chǎn)生協(xié)同作用，共同增強了體內(nèi)的抑菌效果，顯著提高小鼠的存活率。所以本文研究表明了產(chǎn)CLA乳酸桿菌在體內(nèi)和體外均具有較開發(fā)應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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Study on antibacterial activity of conjugated linoleic acid producing Lactobacillus in vivo and vitro

CHEN Jia，XU Hui
（Department of Food and Bioengineering，Bengbu College，Bengbu 233030，China）

To evaluate and compare the antibacterial activity of conjugated linoleic acid producing Lactobacillus（CLA-producing Lactobacillus）to E.coli，Staphylococcus aureus and Salmonella in vivo and vitro.In vitro test results showed：the antibacterial activity of LAB against E.coli was better than Staphylococcus aureus and Salmonella.The Lactobacillus showed high temperature stability up to 90℃，stability in the rage of pH2.0～5.0 and anti-protease activity and anti-catalyase activity.In vivo，the Lactobacillus had more powerful bacteriostatic effect and enhanced bacteriostatic effect to be with increasing does.Conclusions：The CLA-producing Lactobacillus was proved to be of bacteriostatic actions in vitro and in vivo．

conjugated linoleic acid；Lactobacillus；antibacterial activity；in vivo；in vitro

TS201.3

A

1002-0306（2015）04-0167-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.028

2014－05－08

陳佳（1982-），女，博士，講師，研究方向：食品營養(yǎng)與生物技術(shù)。

安徽高校省級自然科學(xué)研究重大項目（KJ2012ZD10）；校級科研啟動項目（2014ZR02zd）；省級社科規(guī)劃項目（AHSK11-12D199）。