一株產(chǎn)纖溶酶放線菌YY21的生理生化特征和抑菌活性研究

鄧永平，劉曉蘭，*，韓　楊，鄭喜群，艾瑞波（．齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾6006；2．黑龍江省普通高校齊齊哈爾農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾6006）

一株產(chǎn)纖溶酶放線菌YY21的生理生化特征和抑菌活性研究

鄧永平1，2，劉曉蘭1，2，*，韓楊1，鄭喜群1，2，艾瑞波1
（1．齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006；2．黑龍江省普通高校齊齊哈爾農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾161006）

研究一株產(chǎn)胞外纖溶酶的中度嗜酸放線菌YY21，該菌株在GYM和PDA培養(yǎng)基上可以產(chǎn)生基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲分化成波曲狀孢子絲，孢子呈球形；菌株適宜的生長pH范圍為3～7，可以向細胞外分泌蛋白酶、淀粉酶，可以分解含硫氨基酸產(chǎn)生硫化氫，不能產(chǎn)生胞外纖維素酶；能夠利用葡萄糖和棉子糖作為碳源；液體培養(yǎng)3d后培養(yǎng)液對大腸桿菌有較顯著的抑菌效果，抑菌圈直徑達到了36.2mm，培養(yǎng)液中含纖溶酶，在血纖維蛋白平板上溶圈面積可達99.37mm2。

放線菌，纖溶酶，抑菌，生理生化特征

血栓栓塞性疾病嚴重威脅人類生命和健康，溶栓療法效果顯著。人們在針對原有溶栓藥物的弊端進行改造的同時，還在不斷探尋新型、高效、特異、廉價的溶栓劑[1]。微生物易于培養(yǎng)、代謝產(chǎn)物種類多，而且生長條件可人為控制，因而成為開發(fā)新型溶栓劑的主要來源。

目前已見報道的有源自細菌的鏈激酶（SK）[2]、葡激酶（SaK）[3]、納豆激酶（NK）[4]、枯草激酶（CK）[5]等，源自好食脈孢霉[6]、根霉[7]、鐮刀霉[8]、枯青霉[9]等霉菌的纖溶酶，源自蛹蟲草[10]、金針菇[11]等大型真菌的纖溶酶，以及源自鏈霉菌[12]的纖溶酶。

嗜酸放線菌（Acidophilic actinomycetes）廣泛分布于酸性環(huán)境中，可以產(chǎn)生耐酸的胞外酶，如幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、淀粉酶等，在酸性土壤有機物的降解循環(huán)中起著重要作用。此外，由于大多數(shù)真菌適宜于酸性環(huán)境中生存，所以嗜酸放線菌也是極具潛力的抗真菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生者[13]。從嗜酸放線菌的代謝產(chǎn)物中開發(fā)新的天然生物活性物質(zhì)，對新型藥物的開發(fā)具有重要意義。本文報道了一株產(chǎn)胞外纖溶酶的中度嗜酸放線菌的生理生化特征及抑菌活性，以期獲得能夠聯(lián)產(chǎn)纖溶活性物質(zhì)及抑菌活性物質(zhì)的菌株。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

纖溶酶產(chǎn)生菌為中度嗜酸放線菌菌株YY21（Actinomycete sp.），保藏號CGMCC No.5816；枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）D-03、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）W18、大腸桿菌（Escherichia coli）W06-1、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）W21、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黑曲霉（Aspergillus niger）YY-12由齊齊哈爾大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院菌種保藏實驗室提供；牛血纖維蛋白原、牛凝血酶為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血研所產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純；GYM固體培養(yǎng)基葡萄糖0.4%，酵母膏0.4%，麥芽浸膏1%，碳酸鈣0.1%～0.2%，瓊脂1.8%，pH6.7；GYM液體培養(yǎng)基葡萄糖0.4%，酵母膏0.4%，麥芽浸膏1%，碳酸鈣0.1%～0.2%，pH6.7；碳源利用實驗基礎(chǔ)培養(yǎng)基KH2PO40.238%，K2HPO40.565%，MgSO4·7H2O 0.1%，CuSO4·5H2O 0.00064%，F(xiàn)eSO4·7H2O0.00011%，MnCl2·H2O 0.00079%，ZnSO4·7H2O 0.00015%，瓊脂1.5%，pH6.8～7.0，121℃高壓滅菌20min。

PYX-DHS型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱上海躍進醫(yī)療器械廠；pHS-25型酸度計上海精密科學(xué)儀器有限公司；himac CF15RX型冷凍離心機天美科學(xué)儀器有限公司；Nikon 50i型生物顯微鏡尼康公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌株YY21形態(tài)特征

1.2.1.1細胞形態(tài)觀察采用插片法培養(yǎng)菌株YY21，壓印法觀察菌株YY21形態(tài)。

1.2.1.2菌種的培養(yǎng)特征將菌株YY21分別接種于高氏一號培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、GYM培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)6～15d，觀察菌落特征變化。高氏一號培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基培制方法參照沈萍[14]。

1.2.2菌株YY21生理生化特征

1.2.2.1最適生長pH測定將菌株YY21接入不同pH（分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）的GYM瓊脂平板中，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～10d，觀察菌株生長情況。

1.2.2.2菌株生化特性測定將菌株YY21分別接入明膠培養(yǎng)基、脫脂牛奶培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基、纖維素培養(yǎng)基、硫化氫實驗培養(yǎng)基，在28℃下培養(yǎng)一定時間后觀察實驗結(jié)果。培養(yǎng)基配制方法參照沈萍[14]。

1.2.2.3碳源利用實驗基礎(chǔ)培養(yǎng)基滅菌后分別加入過濾滅菌的10%碳素化合物溶液，使其最終濃度為1%（供試碳源包括：葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露糖、果糖、肌醇、阿拉伯糖、棉子糖），充分混勻后分裝到滅菌試管中，每管含5mL培養(yǎng)液，將菌株YY21孢子懸液分別等量接種于各個試管中，以未接菌的作為對照，置28℃靜止培養(yǎng)一定時間，觀察并記錄結(jié)果[15]。

1.2.3抑菌實驗將YY21菌株接種至GYM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)一定時間后取樣，測定樣品的抑菌活性。參照沈萍[14]，采用濾紙片法測定抑菌活性。

1.2.4纖溶酶活力的測定參照Liu的方法[16]，采用血纖維蛋白平板法測定纖溶酶活力。

2　結(jié)果與討論

2.1菌株YY21形態(tài)特征

2.1.1放線菌菌株YY21的細胞形態(tài)放線菌菌株YY21的菌絲形態(tài)及孢子形態(tài)分別見圖1和圖2。由圖1和圖2可以看出，菌絲有大量分支，不斷裂，氣生菌絲分化形成波曲狀孢子絲，孢子呈圓形，表面光滑。

圖1　放線菌菌株YY21的菌絲形態(tài)（200×）Fig.1　The hypha of the strain YY21（200×）

圖2　放線菌菌株YY21孢子形態(tài)（400×）Fig.2　The spores of the strain YY21（400×）

2.1.2放線菌菌株YY21的培養(yǎng)特征菌株YY21在不同培養(yǎng)基上生長情況分別見圖3～圖5，其培養(yǎng)特征如表1所示。實驗結(jié)果表明該菌在GYM培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上長勢良好，其中GYM培養(yǎng)基上生長較快，培養(yǎng)3d菌落即鋪滿平板表面，菌落邊緣呈明顯的放射狀，表面粗糙，產(chǎn)生大量孢子。PDA平板培養(yǎng)3d時菌落表面光滑，孢子產(chǎn)量較少。該菌在高氏一號及察氏培養(yǎng)基上生長速度較慢，分別在5d和7d后菌落長滿平板表面。

圖3　放線菌菌株YY21在GYM培養(yǎng)基上生長情況Fig.3　Cultural characteristics of the strain YY21 in GYM medium

2.2菌株YY21生理生化特征

2.2.1菌株的最適生長pH在28℃條件下于GYM培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株YY21 6～10d，根據(jù)菌落大小，基內(nèi)菌絲、氣生菌絲及孢子絲的茂盛程度判斷其生長狀況，結(jié)果如表2所示。表2結(jié)果表明，放線菌YY21菌株在環(huán)境pH范圍為3～7時都可以生長，pH為4～6時生長良好，pH為5時長勢最好，菌絲繁茂，確定最適生長pH為5，初步判斷菌株YY21為中度嗜酸的放線菌。

圖4　菌株YY21在PDA培養(yǎng)基上生長情況Fig.4　Cultural characteristics of the strain YY21 in PDA medium

圖5　菌株YY21在察氏培養(yǎng)基上生長情況Fig.5　Cultural characteristics of the strain YY21 in czapek’s medium

表1　放線菌菌株YY21培養(yǎng)特征Table.1　Cultural characteristics of the strain YY21

表2　pH對菌株YY21生長的影響Table.2　The effect of pH values on strain YY21

2.2.2菌株的生理生化特性放線菌YY21菌株的生化實驗結(jié)果見表3。表3結(jié)果表明，菌株可以使明膠液化，也可以使牛奶先凝固后胨化，說明該菌能夠向細胞外分泌蛋白酶；菌株能夠水解淀粉，說明其可以向細胞外分泌淀粉酶；該菌株可以分解含硫氨基酸產(chǎn)生硫化氫；該菌株不能分解纖維素培養(yǎng)基中的濾紙，說明不能產(chǎn)生胞外纖維素酶。

表3　放線菌YY21菌株的生化實驗結(jié)果Table.3　Physiological features and carbon-source utilization of the strain YY21

2.2.3菌株對碳源的利用情況菌株對碳源利用的實驗結(jié)果見表4。表4結(jié)果表明，放線菌YY21能夠利用葡萄糖和棉子糖作為碳源，不能利用實驗范圍內(nèi)的其他碳源。

表4　放線菌YY21菌株對碳源的利用情況Table.4　Physiological features and carbon-source utilization of the strain YY21

2.3菌株YY21抑菌實驗

采用濾紙片法檢測放線菌YY21菌株培養(yǎng)液是否具有抑菌作用，實驗結(jié)果如表5所示，表5結(jié)果表明，該放線菌YY21菌株對革蘭氏陽性菌枯草芽胞桿菌及金黃色葡萄球菌沒有抑菌作用，但是抑制革蘭氏陰性菌大腸桿菌效果明顯，第5d培養(yǎng)液的抑菌圈直徑達到36.2mm。推測菌株YY21代謝產(chǎn)物的抑菌作用位點可能是細菌細胞壁[17]。

表5　菌株YY21發(fā)酵液抑菌效果Table.5　Inhibition activity of fermentation broth of the strain YY21 against bacteria

該菌株生長曲線如圖6所示，在GYM培養(yǎng)液中YY21菌株生長至36h后即進入平穩(wěn)期，即開始產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物，繼續(xù)培養(yǎng)，由于次級代謝產(chǎn)物積累引起自身反饋調(diào)節(jié)或是由于前體物質(zhì)耗盡，導(dǎo)致抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量降低，從而導(dǎo)致第7d的培養(yǎng)液形成的抑菌圈直徑小于第5d[18]。

資料表明，抑菌圈直徑達到10mm以上，即具有了較強的抑菌性[19]。李艷利等[20]對鏈霉菌Streptomyces sp.NJ0510的抑菌活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)其次級代謝產(chǎn)物能抑制G+細菌，抑菌圈直徑達到14mm，該菌代謝產(chǎn)物能夠抗耐藥的金色葡萄球菌。本研究中菌株YY21具有明顯抗大腸桿菌活性，具有潛在的應(yīng)用前景。

圖6　放線菌YY21生長曲線Fig.6　The growth curve of the strain YY21

2.4放線菌菌株YY21產(chǎn)纖溶酶實驗

利用GYM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)放線菌菌株YY21，培養(yǎng)一定時間后離心發(fā)酵液，取上清液，測定纖溶酶的活力，結(jié)果如圖7所示。

圖7　放線菌YY21發(fā)酵液纖溶酶活性Fig.7　The enzyme activity of fermentation liquor of the strain YY21

實驗結(jié)果表明，放線菌菌株YY21發(fā)酵液具有纖溶酶活力，第3d發(fā)酵液纖溶酶活性相對最高，在纖維蛋白平板上形成溶圈面積達到99.37mm2，隨發(fā)酵時間的延長，纖溶酶活力變化呈逐漸下降趨勢。

3　結(jié)論

放線菌菌株YY21菌落呈放射狀生長，基內(nèi)菌絲及氣生菌絲呈分枝狀，氣生菌絲體覆蓋在菌落邊緣，形成褶皺的邊緣，成熟的菌落呈土黃色；孢子絲形狀為波曲狀，單個孢子呈球形。

放線菌YY21是一株中度嗜酸放線菌，生長pH范圍為3～7；可向細胞外分泌蛋白酶、淀粉酶，不能產(chǎn)生纖維素酶，可以分解含硫氨基酸產(chǎn)生硫化氫；能夠利用葡萄糖和棉子糖作為碳源。放線菌菌株YY21發(fā)酵液含有抑制大腸桿菌的活性物質(zhì)，同時，其發(fā)酵液中還含有能夠降解牛血纖維蛋白的纖溶酶。

目前對放線菌所產(chǎn)抗生素的研究甚多，而對其產(chǎn)纖溶酶的報道較少，國內(nèi)研究人員武臨專、張立平、湯祝華等[21-23]都報道了鏈霉菌產(chǎn)纖溶酶發(fā)酵條件的優(yōu)化，國外Ratnakar R等[12，24]對一種嗜溫鏈霉菌所產(chǎn)纖溶酶進行了研究，但是，以上報道只是以生產(chǎn)纖溶酶一種產(chǎn)物為目的。該放線菌菌株YY21為一株嗜酸放線菌，產(chǎn)纖溶酶和抑菌活性物質(zhì)能力較強，培養(yǎng)容易，有望開發(fā)為新型纖溶酶和抑菌素的聯(lián)產(chǎn)菌。

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Study on the physiological and biochemical characteristics and antimicrobial activity of actinomycetes YY21 producing fibrinolytic enzyme

DENG Yong-ping1，2，LIU Xiao-lan1，2，*，HAN Yang1，ZHENG Xi-qun1，2，AI Rui-bo1
（1.College of Food and Biotechnology，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China；2.Key Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China）

A extracellular plasmin producing moderately Acidophilic actinomycetes named YY21 was reported in this paper.On the GYM and PDA medium this strain could growth substrate mycelium and aerial hyphae，and aerial hyphae differentiate into wave-like spore-bearing mycelium which could produce spherical spores.The suitable pH range for the growth of the strain YY21 was 3～7.This strain could secrete protease and amylase，but no extracellular cellulase，and could break down the sulfur amino acid to roduce hydrogen sulfide.It could utilize glucose and raffinose as a carbon source.After this strain was cultured in liquid medium for 3 days，the medium had significant inhibitory effect on the E.coli，and the inhibition zone diameter reached 36.2mm.The medium contain plasminogen and the dissolved circle area was 99.37mm2on the fibrin tablet.

actinomycetes；fibrinolytic enzymes；antibacterial；physiological and biochemical characteristics

TS201.3

A

1002-0306（2015）04-0163-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.027

2014－05－09

鄧永平（1978-），女，碩士，副教授，研究方向：微生物學(xué)與應(yīng)用酶學(xué)。

劉曉蘭（1962-），女，博士，教授，研究方向：發(fā)酵工程、微生物學(xué)與應(yīng)用酶學(xué)。

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（12521598）。