肥城桃果實多酚氧化酶酶學(xué)特性的研究

王娟

（菏澤學(xué)院園林工程系，山東菏澤274015）

肥城桃果實多酚氧化酶酶學(xué)特性的研究

王娟

（菏澤學(xué)院園林工程系，山東菏澤274015）

以肥城桃果實為試材，分離純化了導(dǎo)致酶促褐變的多酚氧化酶（PPO），并對其性質(zhì)進行了分析。結(jié)果表明，以叔丁基鄰苯二酚和綠原酸為底物，加入十二烷基磺酸鈉（SDS）后使PPO活性分別增大19倍和12倍，催化效率分別提高11.5倍和17倍，PPO最適pH為6.5，2-羥基-2，4，6-環(huán)庚三烯酚酮顯著抑制PPO活性。部分變性SDS-PAGE顯示PPO在表觀分子量分別為49ku和50ku有兩條活性條帶，等電聚焦IEF顯示可溶性PPO和膜結(jié)合PPO都含有兩個酸性范圍的條帶，其pI為5.7和5.8，膜結(jié)合PPO還有一條pI為5.4的條帶。結(jié)合western雜交在膜結(jié)合PPO的3種同工酶中，只有2種能被抗體識別；全變性SDS-PAGE和western blot發(fā)現(xiàn)存在一條分子量為60ku的多肽。

肥城桃，果實，多酚氧化酶，酶學(xué)特性

多酚氧化酶（PPO），也稱為酪氨酸酶（EC1.14.18.1），是引起果實采后酶促褐變的關(guān)鍵酶[1]。多酚氧化酶是一種含銅酶，在氧的作用下可以催化兩種不同的反應(yīng)：使單酚發(fā)生羥基化作用形成O-二元酚（單酚氧化酶活性）和氧化O-二元酚形成O-醌（二元酚氧化酶活性）[2]。酚類物質(zhì)和多酚氧化酶在正常生物體的細胞內(nèi)是相互分開的，但是在提取液中或者細胞受到傷害時，酚類物質(zhì)和多酚氧化酶相互接觸，迅速氧化產(chǎn)生O-二元酚。氧化作用產(chǎn)生的O-醌性質(zhì)活潑，能夠迅速聚集形成相對難溶的褐色聚合物，如黑色素。O-醌還可以與氨基酸、肽、蛋白質(zhì)反應(yīng)，既改變了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，又改變了營養(yǎng)價值[3]。

肥城桃（Prunus persica L.cv Feicheng）是我國著名的傳統(tǒng)名果，深受人們的喜愛，在國內(nèi)外擁有很高的聲譽。但肥城桃果實采后極易褐變和腐爛變質(zhì)，軟化快、耐貯性差，大大限制了肥城桃的發(fā)展。朱樹華等研究了一氧化氮對采后肥城桃果實細胞壁代謝的影響和貯藏期間乙烯生物合成和脂氧合酶活性的抑制作用[4-5]，李富軍等研究了1-MCP和AVG對肥城桃果實采后衰老的影響[6]，但對于肥城桃果實中PPO的性質(zhì)了解較少。研究表明，導(dǎo)致鴨梨、蘋果和桃的主要褐變物質(zhì)是綠原酸[7]，鄰苯二酚也是導(dǎo)致褐變的重要褐變物質(zhì)，且中華壽桃果肉的PPO最適作用底物是綠原酸和鄰苯二酚[8]。因此，本實驗以肥城桃果實為試材，分離純化了果實中的PPO，以綠原酸和鄰苯二酚作為PPO的作用底物，對其性質(zhì)進行了研究。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

實驗用肥城桃果實采自山東省肥城市儀陽鄉(xiāng)果園，運回實驗室后，切碎用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆?；抗壞血酸、綠原酸、2-羥基-2，4，6-環(huán)庚三烯酚酮、叔丁基鄰苯二酚（4-TBC）、硫酸銨、Triton X-114均購自Sigma公司，Triton X-114用100mmol·L-1磷酸鈉緩沖溶液（pH7.3）稀釋3倍[9]；其他化學(xué)試劑均為分析純，購自Fluka公司。

UV-1700型分光光度計日本島津公司；5418型高速離心機德國Eppendorf有限公司；HH-2型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋上海悅豐儀器儀表有限公司；FSH-2A型可調(diào)高速勻漿機金壇市華偉儀器廠；Sartorius精密pH計北京澤祥恒達科技發(fā)展公司；Mini Trans-Blot電泳槽、電泳儀美國Bio-Rad公司。

1.2實驗方法

1.2.1酶的提取參照Xu[10]的方法并加以改進。取50g果肉用剪刀剪碎，按1∶1比例加入100mmol·L-14℃預(yù)冷的pH7.3的PBS中，并加入1mmol·L-1苯甲基磺酰氟（PMSF），10mmol·L-1的抗壞血酸和1mmol·L-1鹽酸苯甲脒，用高速勻漿機勻漿1min。勻漿液用8層紗布過濾，濾液于4℃下4000×g離心10min，取沉淀加入12.5mL 100mmol·L-1的磷酸鈉緩沖溶液[pH7.3，含60g·L-1（w/v）Triton X-114]，4℃懸浮培養(yǎng)30min后，于37℃水浴15min。水浴期間，含有疏水蛋白和酚類物質(zhì)的去垢劑聚集成為混合型膠束，使溶液變渾濁。渾濁液在25℃10000×g離心15min，收集澄清透明的上清液即為含有PPO的酶液。加入pH7.0的硫酸銨使其達到250g·L-1，4℃攪拌過夜，再于4℃ 12000×g離心30min。取上清液并加入80%的飽和硫酸銨，4℃攪拌1h，再次離心，沉淀中加入5mL 10mmol·L-1pH7.3的PBS透析除鹽，得到的溶液進行PPO活性的分析。

1.2.2酶活性的檢測

1.2.2.1測定方法PPO活性的測定反應(yīng)液含底物、緩沖液和80μg·mL-1PPO。以分光光度法檢測25℃反應(yīng)生成物在400nm的吸光度[11]。以25℃每分鐘OD值變化0.001所需的酶量定義為PPO的一個酶活性單位（U）。

1.2.2.2底物、pH、SDS對PPO活性的影響底物對PPO活性的影響：以4-TBC為底物，檢測25℃反應(yīng)生成的4-（叔丁基）苯并-1，2-醌在400nm的吸光度[11]。反應(yīng)液含6mmol·L-14-TBC、50mmol·L-1乙酸（pH3.5～5.0）和80μg·mL-1PPO。以綠原酸為底物，檢測25℃綠原酸轉(zhuǎn)化為O-醌時在400nm波長的吸光度變化。反應(yīng)液為1.0mL的50mmol·L-1磷酸鈉緩沖液（pH6.5，含有2mmol·L-1的綠原酸和80μg·mL-1PPO。

pH對PPO活性的影響：配制pH3.5～7.0的50mmol·L-1醋酸鈉-磷酸鈉緩沖溶液，按酶活測定體系加入酶液，測定PPO活性的變化。

SDS對PPO活性的影響：在反應(yīng)體系中分別設(shè)加和不加2mmol·L-1SDS，室溫下測定pH，反應(yīng)前后各測一次pH。按酶活測定方法測定PPO活性的變化。以加SDS和不加SDS條件下PPO酶活性的比值來表示活化度。

抑制劑對PPO活性的影響：以2-羥基-2，4，6-環(huán)庚三烯酚酮作為PPO的抑制劑。每毫升反應(yīng)液含有50mmol·L-1磷酸鈉緩沖液（pH6.5）、0～3.6mmol·L-14-TBC、0～60μmol·L-12-羥基-2，4，6-環(huán)庚三烯酚酮和2mmol·L-1SDS，PPO濃度為87μg·mL-1。按酶活性測定方法測定PPO活性。

1.2.3變性SDS-PAGE和部分變性SDS-PAGE按照Laemmli[12]的方法進行PPO的變性SDS-PAGE；部分變性SDS-PAGE不加β-巰基乙醇且不加熱以保護酶的活性。

1.2.4等電聚焦（IEF）電泳、凝膠染色及Western分析

參照O’Farrell[13]的方法檢測PPO同工酶。等點聚焦電泳、凝膠染色及Western分析同過氧化物酶的分析方法[14]。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007和Origin 8.0進行數(shù)據(jù)分析和作圖。根據(jù)Michaelis-Menten方程，得到米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速度（Vm）；Dixon作圖法進行PPO的動力學(xué)研究，確定抑制類型并求得抑制常數(shù)（KI）；用凝膠成像系統(tǒng)對電泳結(jié)果進行觀察，并采集圖像。

2　結(jié)果與分析

2.1PPO的提取

圖1　肥城桃果實不同組織的PPO活性Fig.1　PPO activity at different tissues of Feicheng peach fruit

用Triton X-114和硫酸銨從桃果實中提取PPO，Triton X-114可以起到增溶膜蛋白的作用。該方法可以得到澄清濃縮的酶液，有利于進一步的電泳分析。從圖1可以看出，在膜和可溶性組分中均檢測到PPO活性，膜上的PPO活性單位（90.5U）遠高于可溶性組織中的PPO酶量（11.4U），表明PPO主要存在于膜組織中。

2.2PPO的酶學(xué)特性

2.2.1底物、pH和SDS對PPO活性的影響圖2表示分別以4-TBC和綠原酸為底物，不同pH及有無2mmol·L-1SDS對膜結(jié)合PPO的影響。無SDS時，在酸性pH范圍內(nèi)PPO活性高，PPO的最適pH為4；加入2mmol·L-1SDS后PPO活性提高，PPO的最適pH變?yōu)?.5。底物4-TBC比綠原酸對PPO活性的影響大，以4-TBC為底物加入2mmol·L-1SDS可使PPO活性增大19倍，而以綠原酸為底物時加入2mmol·L-1SDS可使PPO活性增大12倍。有研究表明最適pH低的原因是PPO活性受酸的影響[15]。為了研究SDS的這種激活作用是否依賴于底物，對不同底物下的活化作用進行了實驗。由圖2可以看出，兩種底物存在時，PPO活化度的變化趨勢基本一致，但底物4-TBC存在時比綠原酸存在時的PPO活化度要高。

圖2　不同pH下桃PPO活性Fig.2　Activity of peach PPO at different pH values

2.2.2PPO的動力學(xué)特征分別以4-TBC和綠原酸為底物研究桃果實中膜結(jié)合PPO的動力學(xué)特征。由表1可知，相同SDS條件下，兩種底物得到的Km值相近。而SDS引起Vm明顯增大，使得以綠原酸和4-TBC為底物時PPO的催化效率（Vm/Km）與不加SDS時相比分別增大了17倍和11.5倍。這種PPO催化效率的變化與前人[16]的報道相一致。

表1　桃PPO的動力學(xué)指標(biāo)Table.1　Kinetic parameters of peach polyphenol oxidase

2.2.32-羥基-2，4，6-環(huán)庚三烯酚酮對PPO的抑制為進一步研究膜結(jié)合PPO的特性，選擇2-羥基-2，4，6-環(huán)庚三烯酚酮（一種特異的PPO抑制劑），并研究其對PPO的抑制作用。為了分析抑制動力學(xué)，以4-TBC為底物，選擇5個不同的底物濃度，以1/V對抑制劑濃度進行Dixon作圖。圖3表明，2-羥基-2，4，6-環(huán)庚三烯酚酮是一種典型的競爭性抑制劑，各直線延伸的交點所對應(yīng)X軸的截距為-3μmol·L-1，因此得到抑制常數(shù)KI=3μmol·L-1。

圖3　2-羥基-2，4，6-環(huán)庚三烯酚酮抑制PPO活性的Dixon圖Fig.3　Dixon plots for the inhibitory effect of tropolone on PPO activity

2.3PPO的同工酶分析

2.3.1SDS-PAGE分析部分變性SDS-PAGE檢測桃果實PPO同工酶結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，膜結(jié)合PPO（2）和可溶性PPO（3）有兩個分子量約49ku和50ku的活性條帶，通過進一步的轉(zhuǎn)膜可以得到更清晰的條帶（4）。加入PPO特異抑制劑2-羥基-2，4，6-環(huán)庚三烯酚酮后進行染色，以確定這些條帶是否和PPO相對應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是膜結(jié)合PPO（5）還是可溶性PPO（6）均不存在活性物質(zhì)條帶，因此兩個條帶和PPO相對應(yīng)。

圖4　SDS-PAGE分析Fig.4　SDS-PAGE analysis

2.3.2IEF分析用IEF（pH3.5～10）分析肥城桃的PPO結(jié)果見圖5?？扇苄訮PO（1）和膜結(jié)合PPO（2）都含有兩個酸性范圍的條帶，其pI為5.7和5.8。此外，膜結(jié)合PPO（2）還有一條pI為5.4的條帶。當(dāng)PPO活性抑制劑2-羥基-2，4，6-環(huán)庚三烯酚酮存在時染色不能檢測到PPO條帶（3、4），可以看出桃果實的PPO呈酸性同工酶形式。Hoyle采用IEF分析從蠶豆葉的葉綠體中純化的PPO同工酶，發(fā)現(xiàn)其等電點在4.9～5.9，均含有分子量為65ku的蛋白質(zhì)[17]，在胡蘿卜[18]和雙孢蘑菇[19]中也得到了相同的結(jié)果。

圖5　PPO的IEF分析Fig.5　Isoenzymatic patterns of the different PPO

2.3.3Western雜交用蠶豆葉中PPO的多克隆抗體對IEF凝膠中的PPO進行western雜交。由圖5可以看出，在可溶性PPO（5）中進行抗體免疫雜交未發(fā)現(xiàn)條帶，而在IEF檢測的膜結(jié)合PPO（6）的3種同工酶中，只有2種能被抗體識別。

變性SDS-PAGE，并在電泳后進行Western雜交，結(jié)果顯示膜結(jié)合PPO（1）僅有一條分子量大約為60ku的條帶。前人研究表明，胡蘿卜PPO的36ku的條帶表現(xiàn)PPO的活性，而在變性條件下條帶的分子量為59ku[18]。甜菜根中也發(fā)現(xiàn)了36ku的PPO條帶，在變性條件下條帶的分子量為60ku[20]。

圖6　桃PPO變性SDS－PAGE的Western雜交Fig.6　Western blotting of totally denaturing SDS-PAGE of peach PPO

3　結(jié)論

在膜和可溶性組分中均檢測到PPO活性，其主要存在于膜組織中，具有很高的酚氧化酶活性。陰離子去污劑SDS大大提高了PPO活性及其催化效率，使PPO最適pH變?yōu)?.5。可溶性和束縛膜PPO在非變性IEF和SDS-PAGE中均有兩條相似條帶。而Western雜交后，IEF檢測的膜結(jié)合PPO的3種同工酶中有2種能被抗體識別，但變性SDS-PAGE檢測的膜結(jié)合PPO僅有一條分子量大約為60ku的條帶。該研究為桃的褐變機理提供了一定的理論依據(jù)，以選用合適的調(diào)控因子，降低褐變率，延長貨架期。

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Study on enzymatic characteristics of polyphenol oxidase in Feicheng peach fruit

WANG Juan
（Department of Landscape Engineering，Heze University，Heze 274015，China）

Polyphenol oxidase involved in enzymatic browning was extracted from Feicheng peach fruit and its characteristics were analyzed.Results showed that the PPO activity increased 19 and 12 times respectively after adding sodium dodecyl sulfate with the substrates of 4-tert-butylcatechol and chlorogenic acid.The catalytic efficiency enhanced 11.5 and 17 times respectively.The optimum pH value increased to 6.5.And 2-hydroxy-2，4，6-tropolone was a typical competitive inhibitor.A partially denatured sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）showed the presence of two active bands with apparent molecular weight of 49ku and 50ku.Under native isoelectric focusing（IEF），two bands existed in the acidic range with the pI of 5.7 and 5.8 both in soluble and membrane-bound tissues.A band with the isoelectric point（pI）of 5.4 was also found in membrane-bound tissues.No active band was obtained in soluble tissues of PPO.Only two kinds of antibodies were distinguished with western blotting in the three isoenzymes of membrane-bound PPO.A totally denatured SDS-PAGE and western blotting indicated the presence of a single polypeptide with a molecular weight of 60ku.

Feicheng peach；fruit；polyphenol oxidase；enzymtic characteristics

TS255.3

A

1002-0306（2015）04-0132-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.019

2014－06－09

王娟（1977-），女，博士，副教授，研究方向：園林園藝植物生物技術(shù)。