花鱸和西伯利亞鱘生長(zhǎng)激素/類胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ軸相關(guān)基因全長(zhǎng)cDNA的克隆和序列分析

張志勇 薛 敏 王 嘉 吳秀峰 鄭銀樺 韓 芳

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，國(guó)家水產(chǎn)飼料安全評(píng)價(jià)基地，北京 100081;2.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料中心，北京 102209;3.農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

魚類的生長(zhǎng)是受到生長(zhǎng)激素(GH)/類胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)軸的相關(guān)基因控制的。GH/IGF-Ⅰ軸主要包括GH、生長(zhǎng)激素受體(GHR)和類胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGFs)以及下游IGFs受體等。GH是由脊椎動(dòng)物腺垂體細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)，是一種肽類激素。它能夠促進(jìn)生長(zhǎng)、促進(jìn)蛋白質(zhì)和脂肪的代謝、提高食物的轉(zhuǎn)化效率和調(diào)節(jié)魚類的滲透壓，是動(dòng)物生長(zhǎng)最主要的調(diào)控因子。GH與靶細(xì)胞膜表面的GHR結(jié)合后，開啟細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，促進(jìn)肝臟中IGF-Ⅰ的表達(dá)和分泌，通過血液循環(huán)到達(dá)其他組織，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化［1］。

花鱸(Lateolabrax japonicus)和西伯利亞鱘(Acipenser baerii Brandt)均為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚類，在 FishBase(www.fishbase.org)中兩者均被列為廣鹽肉食性品種，但在分類學(xué)地位上相差較遠(yuǎn)?；|，又稱鱸魚、七星鱸，屬鱸形目，鮨科，是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖魚類品種，年產(chǎn)量突破10萬(wàn)t，穩(wěn)居我國(guó)海水養(yǎng)殖魚類之首。西伯利亞鱘，屬鱘型目，鱘科，是一類古老的軟骨硬鱗魚類，在魚類的進(jìn)化史上占有重要地位，有“活化石”之稱，常常被作為魚類生物學(xué)模型動(dòng)物。本課題組前期在對(duì)2種魚類利用混合植物蛋白源替代魚粉的比較研究中發(fā)現(xiàn)，高植物蛋白質(zhì)替代魚粉會(huì)導(dǎo)致花鱸生長(zhǎng)性能顯著下降，而西伯利亞鱘的生長(zhǎng)則不受影響［2］。這種生長(zhǎng)性能上的差異，有可能是2種魚類的GH/IGF-Ⅰ軸應(yīng)對(duì)植物蛋白質(zhì)不同的響應(yīng)調(diào)控機(jī)制所致。為進(jìn)一步深入研究這2種魚類的GH/IGF-Ⅰ軸，本研究擬通過簡(jiǎn)并引物反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)和 cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid-amplification of cDNA ends，RACE)相結(jié)合的方法，克隆花鱸和西伯利亞鱘GH和GHR基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并進(jìn)行同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，為探討花鱸和西伯利亞鱘的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)理提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用花鱸和西伯利亞鱘分別購(gòu)自山東威海裕隆水產(chǎn)開發(fā)有限公司和北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所房山基地。待試驗(yàn)魚被麻醉后，在冰盤上分離出垂體、肝臟組織，立即置于液氮中，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱中保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)GenBank中已知其他物種的 GH、GHR、GHRⅠ和GHRⅡ的氨基酸序列尋找相應(yīng)的保守片段，采用CodeHop原理［3］設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物克隆花鱸相應(yīng)基因的保守片段。根據(jù)擴(kuò)增到的保守片段，使用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)用于3'-和5'-RACE擴(kuò)增的特異性引物。根據(jù)GenBank中西伯利亞鱘GH(Gen-Bank登錄號(hào)FJ428829)和GHR(GenBank登錄號(hào)FJ428827)的3'末端部分序列設(shè)計(jì)用于5'-RACE擴(kuò)增的特異性引物。所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。本研究中所用到的引物序列及相應(yīng)的退火溫度(Tm)見表1。

1.3 總RNA提取

從-80℃冰箱中取出2種試驗(yàn)魚的垂體和肝臟，經(jīng)液氮研磨后用RNAiso Plus(TaKaRa，大連)分別抽提總RNA?？俁NA用變性瓊脂糖凝膠電泳顯示28S和18S條帶，驗(yàn)證所提取的總RNA的完整性。采用PowerWaveTMXS2全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(BioTek，美國(guó))檢測(cè)其在260 nm處的吸光度值與在280 nm處的吸光度值的比值(A260/A280)，并對(duì)所提取的總RNA進(jìn)行定量。

表1 本研究中所用到的引物序列及相應(yīng)的退火溫度Table 1 Primer sequence and Tm used in this study

1.4 保守片段克隆

cDNA第1鏈的合成采用PrimeScriptⅡ 1stStrand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，大連)，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用約1.0μg相應(yīng)組織的總RNA，操作步驟參照說明書進(jìn)行。分別采用各基因的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行保守片段PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系包含合成的cDNA 第1鏈1μL、10×PCR Buffer 2.5μL、TaKaRa Ex Taq 0.625 U、dNTP 200 μmol/L、上游引物0.4 μmol/L、下游引物 0.4 μmol/L，加滅菌水至總體積25 uL。PCR擴(kuò)增條件為:94℃，30 s;Tm，30 s;72℃，1 min，共35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后，在紫外燈下切取與目標(biāo)序列大小一致的片段，使用 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa，大連)對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行純化。純化產(chǎn)物與pMD19-T Vctor(TaKaRa，大連)連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(E.coli)JM109感受態(tài)細(xì)胞(TaKa-Ra，大連)中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，對(duì)有插入片段的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序(北京華大基因服務(wù)公司)。

1.5 3'-RACE 擴(kuò)增

3'-RACE擴(kuò)增采用3'-Full RACE Core Set Ver.2.0(TaKaRa，大連)，操作步驟參照說明書進(jìn)行。采用1.0μg垂體或肝臟總RNA和3'-RACE Adaptor合成cDNA第1鏈，經(jīng)過2輪嵌套PCR反應(yīng)擴(kuò)增各基因的3'末端。首先以合成的cDNA第1鏈為模板，分別以試劑盒提供的3'-RACE Outer primer和所設(shè)計(jì)的基因特異性3'-RACE Outer primer為引物進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94 ℃，30 s;Tm，30 s;72 ℃，1.5 min，共 35 個(gè)循環(huán)。再以100倍稀釋的Outer PCR產(chǎn)物為模板，分別以試劑盒提供的3'-RACE Inner primer和所設(shè)計(jì)的基因特異性3'-RACE Inner primer為引物進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94℃，30 s;Tm，30 s;72℃，1.5 min，共30個(gè)循環(huán)。對(duì) Inner PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳、切膠純化、連接、轉(zhuǎn)化和測(cè)序。

1.6 5'-RACE 擴(kuò)增

5'-RACE擴(kuò)增采用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech，美國(guó))，操作步驟參照說明書進(jìn)行。采用1.0μg垂體或肝臟總 RNA、5'-CDS Primer A和SMARTⅡ A Oligo合成cDNA第1鏈，以Advantage 2 PCR Enzyme System(Clontech，美國(guó))、UPM引物和所設(shè)計(jì)的基因特異性5'-RACE引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增采用Touch-Down PCR程序:94 ℃，30 s;72℃，2.5 min;5個(gè)循環(huán);94℃，30 s;70℃，30 s;72℃，2 min;5個(gè)循環(huán);94℃，30 s;68℃，30 s;72℃，2 min;30個(gè)循環(huán)。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳、切膠純化、連接、轉(zhuǎn)化和測(cè)序。

1.7 序列分析、同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

將測(cè)序所獲得的核心片段與3'和5'區(qū)域拼接即獲得了相關(guān)基因的全長(zhǎng)序列。將拼接結(jié)果與NCBI GenBank中的已知序列作blastx同源性分析，用 DNAMAN(VERSION 5.2.2)軟件分析所得cDNA序列及開放閱讀框，預(yù)測(cè)編碼氨基酸序列。根據(jù)GenBank中已報(bào)道的GH/IGF-Ⅰ軸相關(guān)基因的蛋白質(zhì)序列用Lasergene 7.0程序中MegAlign進(jìn)行多序列比對(duì)和一致性數(shù)值計(jì)算。采用MEGA 5.1 軟件，選擇鄰接(neighbor-joining，NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹［4］。

2 結(jié)果

2.1 cDNA全長(zhǎng)序列和結(jié)構(gòu)分析

花鱸GH cDNA全長(zhǎng)序列及推測(cè)編碼的氨基酸序列見圖1。cDNA全長(zhǎng)949 bp，包括72 bp的5'非翻譯區(qū)，615 bp的開放閱讀框及262 bp的3'非翻譯區(qū);開放閱讀框編碼204個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為 23.06 ku，等電點(diǎn)為 7.27。經(jīng)過 blastx比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與其他物種GH具有很高的相似性，提交至GenBank獲得登錄號(hào)為JQ995145。

花鱸GHRⅠcDNA全長(zhǎng)序列及推測(cè)編碼的氨基酸序列見圖2。cDNA全長(zhǎng) 3 070 bp，包括227 bp的5'非翻譯區(qū)，1 911 bp的開放閱讀框及932 bp的3'非翻譯區(qū);開放閱讀框編碼637個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為70.79 ku，等電點(diǎn)為4.37。經(jīng)過blastx比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與其他物種GHR和GHRⅠ具有很高的相似性，提交至GenBank獲得登錄號(hào)為JX402001。

花鱸GHRⅡcDNA全長(zhǎng)序列及推測(cè)編碼的氨基酸序列見圖 3。cDNA全長(zhǎng) 2 926 bp，包括252 bp的5'非翻譯區(qū)，1 749 bp的開放閱讀框及925 bp的3'非翻譯區(qū);開放閱讀框編碼582個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為64.42 ku。經(jīng)過blastx比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與其他物種GHR和GHRⅡ具有很高的相似性，提交至GenBank獲得登錄號(hào)為JQ995146。

圖1 花鱸GH cDNA全長(zhǎng)序列和預(yù)測(cè)的氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)JQ995145)Fig.1 GH full length cDNA sequence and deduced amino acid sequence of Lateolabrax japonicas(GenBank accession No.JQ995145)

西伯利亞鱘GH cDNA全長(zhǎng)序列及推測(cè)編碼的氨基酸序列見圖4。cDNA全長(zhǎng)999 bp，包括53 bp的5'非翻譯區(qū)，645 bp的開放閱讀框及301 bp的3'非翻譯區(qū);開放閱讀框編碼214個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為 24.14 ku，等電點(diǎn)為 5.76。經(jīng)過blastx比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與其他物種GH具有很高的相似性，提交至GenBank獲得登錄號(hào)為JX003684。

西伯利亞鱘GHR cDNA全長(zhǎng)序列及推測(cè)編碼的氨基酸序列見圖5。cDNA全長(zhǎng)2 283 bp，包括377 bp的5'非翻譯區(qū)，1 716 bp的開放閱讀框及190 bp的3'非翻譯區(qū);開放閱讀框編碼571個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為63.41 ku，等電點(diǎn)為4.92。經(jīng)過blastx比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與其他物種GHR和GHRⅡ具有很高的相似性，提交至GenBank獲得登錄號(hào)為JX003685。

2.2 多序列比對(duì)

將花鱸和西伯利亞鱘GH的氨基酸序列與其他脊椎動(dòng)物GH的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析和多序列比對(duì)，結(jié)果見圖6。分析表明，花鱸GH與羅非魚(Oreochromis niloticus)GH的同源性最高，為90.2%;與斑點(diǎn)叉尾(Ictalurus punctatus)、雞(Gallus gallus)、非洲爪蜍(Xenopus laevis)、草龜(Mauremys reevesis)、西伯利亞鱘和小鼠(Mus musculus)GH的同源性分別為56.2%、39.3%、38.9% 、38.8% 、38.8% 和 36.0% 。對(duì)于西伯利亞鱘而言，其GH與草龜GH的同源性最高，為70.1%;與雞、小鼠、非洲爪蜍、斑點(diǎn)叉尾、花鱸和羅非魚 GH 的同源性分別為 66.4%、65.7%、62.6% 、44.2% 、38.8% 和 38.3% 。

將花鱸GHRⅠ的氨基酸序列與其他脊椎動(dòng)物GHRⅠ或GHR的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析和多序列比對(duì)，結(jié)果見圖7。分析表明，花鱸GHRⅠ與金頭鯛(Sparus aurata)和黑棘鯛(Acanthopagrus schlegelii)GHRⅠ的同源性最高，均為86.2%;與西伯利亞鱘、雞、海龜(Chelonia mydas)、非洲爪蜍及人(Homo sapiens)GHR的同源性分別為43.7% 、35.6% 、34.9% 、34.8% 和 32.2% 。

圖2 花鱸GHRⅠcDNA全長(zhǎng)序列和預(yù)測(cè)的氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)JX402001)Fig.2 GHRⅠ full length cDNA sequence and deduced amino acid sequence of Lateolabrax japonicas(GenBank accession No.JX402001)

圖3 花鱸GHRⅡcDNA全長(zhǎng)序列和預(yù)測(cè)的氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)JQ995146)Fig.3 GHRⅡ full length cDNA sequence and deduced amino acid sequence of Lateolabrax japonicas(GenBank accession No.JQ995146)

圖4 西伯利亞鱘GHR cDNA全長(zhǎng)序列和預(yù)測(cè)的氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)JX003684)Fig.4 GHR full length cDNA sequence and deduced amino acid sequence of Acipenser baerii Brandt(GenBank accession No.JX003684)

將花鱸GHRⅡ的氨基酸序列與其他脊椎動(dòng)物GHRⅡ或GHR的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析和多序列比對(duì)，結(jié)果見圖8。分析表明，花鱸GHRⅡ與金頭鯛GHRⅡ的同源性最高，為81.4%;與羅非魚 GHRⅡ、西伯利亞鱘 GHR、海龜 GHR、雞GHR、非洲爪蜍GHR及人GHR的同源性分別為72.7%、39.5%、32.6%、32.1%、31.2% 和 30.8%。

將西伯利亞鱘GHR的氨基酸序列與其他脊椎動(dòng)物GHR或GHRⅠ的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析和多序列比對(duì)，結(jié)果見圖9。分析表明，西伯利亞鱘GHR與草魚(Ctenopharyngodon idella)GHRⅠ的同源性最高，為49.2%;與雞、鯉魚(Cyprinus carpio)、海龜、小鼠、人和非洲爪蜍GHR的同源性分別為 48.4%、48.4%、47.4%、45.8%、43.4%和 43.4%。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

花鱸和西伯利亞鱘GH系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果見圖10。如圖所示，花鱸GH與羅非魚的GH以bootstrap值為100的支持度形成了一小分支，再以bootstrap值為94的支持度與大西洋鮭(Salmo salar)的GH合并為一支，最后以bootstrap值為100的支持度與其他硬骨魚類形成大支;西伯利亞鱘的GH與虎螈(Ambystoma barbouri)、非洲爪蜍及其他高等動(dòng)物的GH形成另外一大支。

花鱸和西伯利亞鱘GHR系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果見圖11。如圖所示，整個(gè)進(jìn)化樹分為兩大支，一支為高等硬骨魚類，一支為西伯利亞鱘、陸生動(dòng)物及鳥類;花鱸的GHRⅠ與黑棘鯛和金頭鯛的GHRⅠ以bootstrap值為82的支持度合并為一支，再與大菱鲆(Scophthalmus maximus)、羅非魚及紅樹林鳉(Kryptolebias marmoratus)的GHRⅠ合并為支，再與鯉魚的 GHR、草魚的 GHRⅠ、黃顙魚(Pelteobagrus vachellii)的GHR和南方鲇(Silurus meridionalis)GHRⅠ以bootstrap值為95的支持度合并為一大支;花鱸的GHRⅡ和金頭鯛 GHRⅡ以bootstrap值為91的支持度合并為1支，再與羅非魚、紅樹林鳉、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、大麻哈魚(Oncorhynchus keta)、南方鲇的GHRⅡ合并為一大支，然后兩大支形成一大支。西伯利亞鱘的GHR與非洲爪蜍、人、小鼠、雞及海龜?shù)腉HR形成另外一大支。

圖5 西伯利亞鱘GHR cDNA全長(zhǎng)序列和預(yù)測(cè)的氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)JX003685)Fig.5 GHR full length cDNA sequence and deduced amino acid sequence of Acipenser baerii Brandt(GenBank accession No.JX003685)

圖6 花鱸和西伯利亞鱘與其他物種GH氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig.6 Alignment results of GH amino acid sequences between Lateolabrax japonicas，Acipenser baerii Brandt and other species

圖7 花鱸與其他物種GHR或GHRⅠ氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig.7 Alignment results of GHR or GHRⅠ amino acid sequences between Lateolabrax japonicas and other species

圖8 花鱸與其他物種GHR或GHRⅡ氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig.8 Alignment results of GHR or GHRⅡ amino acid sequences between Lateolabrax japonicas and other species

3 討論

Pérez-Sánchez 等［5］研究證實(shí)魚類的 GH 與促乳素(PRL)和垂體生長(zhǎng)促乳素(SL)一起組成了GH/PRL/SL家族。這類家族具有類似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并認(rèn)為它們起源于共同的祖先。在有關(guān)GH/PRL/SL家族各激素的研究中，對(duì)GH的研究比較全面和深入。本研究成功克隆了花鱸和西伯利亞鱘GH的cDNA全長(zhǎng)序列，并推導(dǎo)出它們的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)。花鱸GH的成熟肽中有4個(gè)半胱氨酸(C)，可以形成2個(gè)二硫鍵，二硫鍵的形成對(duì)于GH的二級(jí)空間結(jié)構(gòu)的維持、正常折疊和生理功能的有效發(fā)揮有著重要的作用［4］。Ayson 等［6］經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)鯉科魚類和鮭鱒魚類的GH中有2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，而花鱸只有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，與尼羅羅非魚和加州鱸的GH結(jié)構(gòu)相似［7-8］，這個(gè)糖基化位點(diǎn)是蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)入膜的信號(hào)，是硬骨魚GH的特征之一。同源性分析發(fā)現(xiàn)，花鱸的GH與羅非魚的相似性最高，與其結(jié)構(gòu)的相似度呈現(xiàn)一致性。西伯利亞鱘的GH成熟肽中含有5個(gè)半胱氨酸，也可以形成2個(gè)二硫鍵，且與花鱸的GH類似，只含有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。同源性分析發(fā)現(xiàn)，西伯利亞鱘的GH與硬骨魚類的相似性較低，而與高等脊椎動(dòng)物的相似性較高;從系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖10)分析中也發(fā)現(xiàn)，其與高等脊椎動(dòng)物的親緣關(guān)系較近，這可能與鱘魚在進(jìn)化中的特殊地位有關(guān)［9］。

圖9 西伯利亞鱘與其他物種GHR或GHRⅠ氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig.9 Alignment results of GHR or GHRⅠ amino acid sequences between Acipenser baerii Brandt and other species

花鱸的GHRⅠ胞外區(qū)在靠近跨膜區(qū)的位置有一個(gè)保守的FGEFSmofit(232～235)基序，這是已知魚類GHR的共性之一，這一結(jié)構(gòu)可能在 GH與GHR結(jié)合過程中穩(wěn)定空間構(gòu)象，對(duì)于GH與GHR結(jié)合及其后的信號(hào)傳導(dǎo)起非常重要的作用［10］。另外，花鱸GHRⅠ胞外區(qū)有7個(gè)保守的半胱氨酸，其中6個(gè)可形成3個(gè)二硫鍵，起著維持GHR胞外區(qū)段特定空間結(jié)構(gòu)的作用。大多數(shù)硬骨魚類中均存在2種類型的GHR［11-13］，本研究也同樣克隆到花鱸2種類型的GHR cDNA全長(zhǎng)序列。花鱸的GHRⅡ沒有FGEFSmofit基序，說明其與GHRⅠ在結(jié)構(gòu)上存在較大差異，二者的同源性也較低。硬骨魚類的2種類型的GHR雖然在結(jié)構(gòu)、體內(nèi)表達(dá)位置及表達(dá)量存在差異，但二者共同作用維持機(jī)體正常的生長(zhǎng)及新陳代謝［12］。系統(tǒng)進(jìn)化樹及同源性分析表明，花鱸的GHRⅠ與黑棘鯛和金頭鯛的GHRⅠ同源性最高，GHRⅡ與金頭鯛的GHRⅡ同源性最高，這與二者的分類地位及食性相一致。而對(duì)于西伯利亞鱘而言，其GHR也沒有FGEFSmofit基序，說明其與硬骨魚類的GHRⅠ差異較大。同源性分析發(fā)現(xiàn)，西伯利亞鱘的GHR與硬骨魚類的GHRⅠ和GHRⅡ以及與高等脊椎動(dòng)物的GHR的同源性均不高(＜50%)，這也說明西伯利亞鱘不同于硬骨魚類，可能只存在1種類型的GHR。此外，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，西伯利亞鱘的GHR與高等脊椎動(dòng)物的親緣關(guān)系較硬骨魚類更近，這與對(duì)GH的分析結(jié)果一致。

圖10 花鱸和西伯利亞鱘與其他物種GH氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹聚類分析Fig.10 Cluster analysis of phylogenetic tree of GH amino acid sequence in Lateolabrax japonicas，Acipenser baerii Brandt and other species

4 結(jié)論

①本研究成功克隆到花鱸的GH、GHRⅠ、GHRⅡ和西伯利亞鱘的GH、GHR的cDNA全長(zhǎng)序列;多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)花鱸的GH、GHRⅠ及GHRⅡ和西伯利亞鱘的GH與其他已知物種的相應(yīng)基因具有很高的相似性，但西伯利亞鱘的GHR與其他已知物種的相應(yīng)基因相似性均較低。

②系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，花鱸的GH、GHRⅠ及GHRⅡ與硬骨魚類的親緣關(guān)系較近，而西伯利亞鱘的GH和GHR與高等脊椎動(dòng)物的親緣關(guān)系較硬骨魚類更近，這可能與鱘魚特殊的進(jìn)化地位有關(guān)。

圖11 花鱸和西伯利亞鱘與其他物種GHR氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹聚類分析Fig.11 Cluster analysis of phylogenetic tree of GHR amino acid sequence in Lateolabrax japonicas，Acipenser baerii Brandt and other species

［1］ 鐘歡.GH/IGF軸相關(guān)基因在不同倍性鯽鯉中的表達(dá)及與生長(zhǎng)的相關(guān)性研究［D］.博士學(xué)位論文.長(zhǎng)沙:湖南師范大學(xué)，2012.

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