復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵改善甘薯渣營養(yǎng)價值的研究

趙 華 王雪濤* 湯加勇 湯小朋 賈 剛劉光芒 陳小玲 龍定彪 王康寧

(1.四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，成都 611130;2.重慶市畜牧科學院，重慶 402460)

我國是甘薯生產(chǎn)大國，種植面積大，總產(chǎn)量高，分別占到全世界的70%和85%左右，年產(chǎn)量高達1.2億 t［1］。甘薯渣是甘薯加工中提取淀粉后的副產(chǎn)品，每年我國都有大量的甘薯渣產(chǎn)生，有資料顯示，一個甘薯淀粉生產(chǎn)加工企業(yè)，每年產(chǎn)淀粉3 000 t，那么每年將會產(chǎn)生甘薯渣4 000 t以上。甘薯渣纖維素含量高，蛋白質(zhì)含量低，同時水分含量很高，不易儲存，并且極易受微生物污染而腐敗變質(zhì)，因此限制了其利用，通常是直接作為農(nóng)家飼料加以簡單利用或被當作廢棄物丟棄。隨著我國飼料資源的日益匱乏，人們開始關(guān)注甘薯渣的開發(fā)利用，以農(nóng)副產(chǎn)品廢棄物為原料，利用微生物固態(tài)發(fā)酵(solid-state fermentation，SSF)生產(chǎn)生物飼料逐漸受到人們的重視。目前我國對甘薯渣開發(fā)利用較多的是利用其發(fā)酵生產(chǎn)酒精、膳食纖維、果膠、檸檬酸、多聚γ-谷氨酸等［2-3］。國外對甘薯渣的應(yīng)用主要是用于生產(chǎn)不飽和脂肪酸以及用單菌或混菌固態(tài)發(fā)酵甘薯渣富集蛋白質(zhì)等［4-5］。有關(guān)甘薯渣固態(tài)發(fā)酵開發(fā)新飼料資源的研究報道較少，若通過菌種的篩選及復(fù)配，探討甘薯渣的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)，可望有效提高甘薯渣營養(yǎng)價值，開拓新的飼料資源。在此本研究擬以曲霉類、木霉類、芽孢桿菌類、酵母類4類共12種菌株對甘薯渣進行單菌發(fā)酵，從中篩選1株發(fā)酵效果好的菌株作為混菌發(fā)酵的主菌種，與其他3類篩選出的菌株進行復(fù)配，篩選最佳菌種組合，采用正交試驗設(shè)計，對發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、料水比、接種量及菌種復(fù)配比例等條件進行優(yōu)化，篩選出適合甘薯渣發(fā)酵的工藝參數(shù)。研究結(jié)果可望為甘薯渣等低品質(zhì)的非常規(guī)飼料原料的開發(fā)與利用提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

發(fā)酵菌種:本試驗所用菌種均為購買或獲贈于其他實驗室，共12株，包含曲霉菌3株，木霉菌2株，枯草芽孢桿菌4株，酵母菌3株。菌種保存在4℃冰箱，每3個月活化1次。

發(fā)酵培養(yǎng)基:甘薯渣和菜籽粕按9∶1混勻，30 g裝入250 mL廣口瓶，121℃滅菌20 min。木薯渣購于綿陽一淀粉加工廠，為提取淀粉后的殘渣，粗蛋白質(zhì)含量為1.76%，粗纖維含量為8.80%;菜籽粕購于四川省雅安市農(nóng)牧市場，粗蛋白質(zhì)含量為36.93%，粗纖維含量為12.27%。

1.2 最適單菌種的篩選及菌種復(fù)配篩選

采用單因子試驗設(shè)計，4類共12株菌種分別接種于甘薯渣發(fā)酵培養(yǎng)基進行單菌發(fā)酵。發(fā)酵條件為接種量1×106個/g，加水60%，溫度30℃，發(fā)酵4 d，pH自然，每株菌重復(fù)3次，以未添加菌液的空白發(fā)酵組為對照?？疾彀l(fā)酵前后粗蛋白質(zhì)含量、羧甲基纖維素酶(carboxymethyl cellulose，CMCase)活性和還原糖含量變化，從曲霉類、木霉類、芽孢桿菌類、酵母類菌株中，各篩選1株最適發(fā)酵菌種，并以篩選出的4株菌中發(fā)酵效果最好的菌種作為主菌種(A)，分別和其他的3株輔發(fā)酵菌種(B、C、D)進行雙菌、三菌和四菌混菌復(fù)配篩選。各菌種的接種比例為 1∶1(1∶1∶1、1∶1∶1∶1)，每組均設(shè)3個重復(fù)。發(fā)酵條件參考主發(fā)酵菌單因素發(fā)酵優(yōu)化試驗結(jié)果:接種量1×106個/g，發(fā)酵時間4 d，料水比(m/V)1∶1.3，培養(yǎng)溫度 38 ℃。最終以粗蛋白質(zhì)含量為主要指標，CMCase活性和還原糖為輔助指標，確定最優(yōu)的菌種組合。

1.3 正交試驗優(yōu)發(fā)混菌發(fā)酵條件

采用正交設(shè)計進一步對發(fā)酵溫度(A)、發(fā)酵時間(B)、料水比(C)、接種量(D)、菌種復(fù)配比例(E)進行5因素4水平的發(fā)酵條件優(yōu)化(n=3)。其中接種量、發(fā)酵時間、料水比、發(fā)酵溫度水平設(shè)置參考主發(fā)酵菌單因素發(fā)酵條件優(yōu)化試驗結(jié)果。發(fā)酵結(jié)束后，取部分鮮樣測定CMCase活性，剩余部分65℃烘干，粉碎過40目篩，用于測定粗蛋白質(zhì)和還原糖含量。

1.4 最優(yōu)發(fā)酵條件發(fā)酵對甘薯渣營養(yǎng)價值的影響

根據(jù)正交試驗設(shè)計優(yōu)化出的混菌發(fā)酵參數(shù)，對甘薯渣進行固態(tài)發(fā)酵，設(shè)置1個對照組(不接種菌種)，其他條件與試驗組一致。每組設(shè)3個重復(fù)。發(fā)酵結(jié)束后，取部分鮮樣測定CMCase、濾紙酶(filter paper，F(xiàn)PA)、β - 葡萄糖苷酶(β-glucosidase)、淀粉酶活性，剩余部分65℃烘干，粉碎過40目篩，用于測定干物質(zhì)、粗灰分、粗纖維、粗脂肪、粗蛋白質(zhì)、還原糖含量。

1.5 指標測定

還原糖含量測定參照黃曉鈺等［6］《食品化學綜合實驗》;水分、粗脂肪、粗蛋白質(zhì)、粗灰分、粗纖維含量的測定參照張麗英［7］《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》;纖維素酶活性參照國標 GB/T 23881—2009［8］、何鳳琴等［9］及湯小朋等［10］的測定方法;淀粉酶活性參照陳毓荃［11］主編的《生物化學實驗方法和技術(shù)》中介紹的淀粉酶活性的測定方法。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)先用Excel 2003進行整理，再用 SPSS 21.0處理、分析。單因素篩選試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析并結(jié)合Duncan氏法進行多重比較;正交試驗數(shù)據(jù)進行極差分析及方差分析。所有試驗結(jié)果均用平均值±標準差表示，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適單菌種發(fā)酵的篩選

12種單菌種發(fā)酵甘薯渣后，粗蛋白質(zhì)含量、CMCase活性、還原糖含量見表1。從表中可以看出，黑曲霉2發(fā)酵甘薯渣后其粗蛋白質(zhì)含量從5.64%提高到 7.89%，提高了 44.7%，顯著高于其他菌種發(fā)酵組(P＜0.05);黑曲霉2發(fā)酵組所產(chǎn)的CMCase活性為2.61 U/g，顯著高于其他單菌發(fā)酵組(P＜0.05)。綜合考慮粗蛋白質(zhì)含量、CMCase活性和還原糖含量等指標，確定黑曲霉2為曲霉組中優(yōu)勢菌種，同時也是12種菌株中最優(yōu)發(fā)酵菌種，將其定為本試驗主發(fā)酵菌種，記作A。

木霉組中里氏木霉和綠色木霉發(fā)酵甘薯渣后，其粗蛋白質(zhì)含量無顯著差異(P＞0.05)，但CMCase活性高于綠色木霉發(fā)酵組(P＜0.05)，因此選擇里氏木霉作為木霉組中優(yōu)勢菌種，記作B。芽孢桿菌組中，枯草芽孢桿菌1組粗蛋白質(zhì)含量顯著高于其他3個組(P＜0.05);枯草芽孢桿菌1和3發(fā)酵后CMCase活性相當，顯著高于其余2個芽孢桿菌發(fā)酵組(P＜0.05)，因此確定枯草芽孢桿菌1作為芽孢桿菌中的優(yōu)勢菌種，記作C。酵母發(fā)酵組中，釀酒酵母1發(fā)酵后的粗蛋白質(zhì)含量顯著高于其他2個發(fā)酵組(P＜0.05)。選擇釀酒酵母1作為酵母菌中的優(yōu)勢菌種，記作D。

表1 甘薯渣固態(tài)發(fā)酵最適單菌株篩選(風干基礎(chǔ))Table 1 The screening of single microbial strain for sweet potato residue fermentation(air-dry basis)

2.2 最優(yōu)復(fù)配菌種組合篩選

以黑曲霉2為主發(fā)酵菌株(A)，與2.1試驗篩選出的優(yōu)勢菌株里氏木霉(B)、枯草芽孢桿菌1(C)和釀酒酵母 1(D)分別進行 1∶1、1∶1∶1 和1∶1∶1∶1的復(fù)配，考察不同混菌組合對甘薯渣發(fā)酵效果的影響，結(jié)果見表2。

從表2可以看出，混菌組合發(fā)酵與單菌發(fā)酵相比，均提高發(fā)酵后原料粗蛋白質(zhì)含量。粗蛋白質(zhì)含量最高的是ABCD組合，達到8.39%，其次是ABC組合，2種組合發(fā)酵甘薯渣的粗蛋白質(zhì)含量均顯著高于其他發(fā)酵組合(P＜0.05)。同時ABCD組合CMCase活性顯著高于其他菌種組合(P＜0.05)，達到3.04 U。還原糖含量除 ACD組合最低外(P＜0.05)，其余的組合之間差異不顯著(P＞0.05)。綜合分析，ABCD組合發(fā)酵對甘薯渣營養(yǎng)價值改善最高，確定該組合為最優(yōu)菌種組合。

2.3 正交試驗結(jié)果

采用L16(45)的正交試驗設(shè)計，考察發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量、料水比、菌種復(fù)配比例對甘薯渣發(fā)酵的影響。各因素水平為發(fā)酵溫度(32、34、36、38 ℃)、發(fā)酵時間(3、3.5、4、4.5 d)、接種量(2.5、5、10、20 ×105CFU/g)，料水比(1∶1.2、1∶1.3、1∶1.4、1∶1.5)，菌種復(fù)配比例(黑曲霉 2∶里氏木霉∶枯草芽孢桿菌 1∶釀酒酵母 1=1∶1∶1∶1、1∶1∶2∶1、1∶2∶1∶1、1∶2∶2∶1)，分別用 A、B、C、D、E表示。由極差分析(表3)粗蛋白質(zhì)R值可以看出，RD＞RC＞RE＞RA＞RB，即接種量對發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)含量影響最大，其次是料水比，然后是菌種復(fù)配比例，再是溫度，最后是發(fā)酵時間。由粗蛋白質(zhì)K值可得最佳發(fā)酵組合A4B2C1D3E2。從CMCase R值可以看出，RA＞RB＞RC＞RD＞RE，即5個參數(shù)對CMCase活的影響程度有大到小依次是發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、料水比、接種量、菌種復(fù)配比例。由CMCase K值可得最佳組合為A4B4C1D3E1。綜合粗蛋白質(zhì)和CMCase R值和K值，得出最適發(fā)酵參數(shù)組合是 A4B4C1D3E2，即發(fā)酵溫度38 ℃，培養(yǎng)時間4.5 d，料水比1∶1.2，接種量1 ×106個/g，接種比例為 1∶1∶2∶1。

表2 不同混菌組合發(fā)酵對甘薯渣粗蛋白質(zhì)、CMCase活性和還原糖含量的影響(風干基礎(chǔ))Table 2 Effects of different mixed microbe strain fermentation on the crude protein content，CMCase activity and reducing sugar content of sweet potato residue(air-dry basis)

表3 正交試驗結(jié)果的極差分析表Table 3 The range analysis of the orthogonal test result

2.4 最優(yōu)條件發(fā)酵結(jié)果

由表4可知，以最優(yōu)條件發(fā)酵甘薯渣后，CMCase、FPA、β-葡萄糖苷酶和淀粉酶活性分別為 4.26、3.29、3.75 和 5.15 U/g DM。與對照組相比，以干物質(zhì)為基礎(chǔ)，粗蛋白質(zhì)含量從6.37%提高到9.75%，提高了53%;粗脂肪含量從2.71%提高到4.92%，提高了82%;粗灰分含量從4.47%提高到6.56%，發(fā)酵后粗纖維含量沒有下降，反而有所提升，從9.64%提高到13.08%。

表4 混菌發(fā)酵對甘薯渣營養(yǎng)成分變化的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 4 Effect of mixed microbe strain fermentation on nutrients composition of sweet potato residue(DM basis)

3 討論

不同的微生物產(chǎn)酶的種類和產(chǎn)酶能力不同，需要根據(jù)發(fā)酵目的不同來選擇不同的微生物進行發(fā)酵［12］。本研究一共對4類共12種菌株進行發(fā)酵篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)曲霉中的黑曲霉2，木霉中的里氏木霉，芽孢桿菌枯草芽孢桿菌1，酵母中的釀酒酵母1效果較好。其中黑曲霉能產(chǎn)生淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、葡萄糖酶、植酸酶、半乳甘露聚糖酶等酶類，因此在發(fā)酵中得到廣泛的應(yīng)用，但黑曲霉因變異性大，不同的黑曲霉菌株，發(fā)酵效果不一樣。木霉也廣泛用于微生物發(fā)酵，資料報道里氏木霉能分泌大量的纖維素酶和木聚糖酶［13-14］。芽孢桿菌作為益生菌，可促進動物對飼料的消化、吸收、利用，從而提高飼料的轉(zhuǎn)化率，并在防病促生長中起到非常重要作用［15-16］。酵母屬于益生菌，在發(fā)酵中應(yīng)用廣泛，發(fā)酵過程中酵母自身的繁殖生長會產(chǎn)生大量的高營養(yǎng)價值菌體蛋白［17］。

以篩選出的黑曲霉2為主發(fā)酵菌，與篩選出的其他3種菌種進行不同復(fù)配，發(fā)現(xiàn)四菌組合發(fā)酵效果優(yōu)于雙菌和三菌組合，發(fā)酵后甘薯渣粗蛋白質(zhì)含量和CMCase酶活均高于其他組合(表2)。有研究報道，里氏木霉與黑曲霉混合發(fā)酵可彌補里氏木霉所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶活性較低的不足，提高酶解效率，讓基質(zhì)充分發(fā)酵［18-20］。Ahamed等［21］對里氏木霉RUT-C30與黑曲霉LMA進行混合發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)FPA可達到7.1 U/mL，與單菌發(fā)酵的3.4 U/mL相比提高了108.8%。本研究發(fā)現(xiàn)4菌混合發(fā)酵，效果優(yōu)于其他發(fā)酵組合，可能原因在于多菌組合發(fā)揮了各個菌種相互之間的協(xié)同效應(yīng)。

微生物接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、水分含量等因素也對發(fā)酵效果有著重要的影響［12，22］。本研究利用L16(45)正交試驗設(shè)計考察了4菌混合發(fā)酵的最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)，試驗獲得的混菌發(fā)酵最適參數(shù)為:培養(yǎng)溫度38℃，培養(yǎng)時間4.5 d，料水比1∶1.3，接種量 1 ×106個/g，接種比例 1∶1∶2∶1。傅婭梅［23］對復(fù)合蛋白質(zhì)飼料適宜的發(fā)酵參數(shù)進行探討，發(fā)現(xiàn)最適參數(shù)為:發(fā)酵時間2.5 d，加水量65%，接種量10%，枯草芽孢桿菌:產(chǎn)朊假絲酵母:植物乳酸桿菌為 1∶1∶1;胡瑞等［24］用復(fù)合益生菌發(fā)酵豆粕，發(fā)現(xiàn)在復(fù)合益生菌(釀酒酵母∶米曲霉∶枯草芽孢桿菌=5∶1∶2)總添加量0.5%，料水比1∶0.4，發(fā)酵 48 h 小效果最佳。

陳松等［25］利用產(chǎn)朊假絲酵母、白地霉、枯草芽孢桿菌和黑曲霉混菌發(fā)酵蘋果渣，發(fā)酵后基質(zhì)粗蛋白質(zhì)含量較發(fā)酵前提高了108%。王叔軍等［26］向甘薯渣中添加少量的麩皮和尿素作為氮源，用微生物進行混菌發(fā)酵后，粗蛋白質(zhì)含量提高到42.4%。趙啟美等［27］采用固液結(jié)合的方法，發(fā)酵甘薯渣后，粗蛋白質(zhì)含量提高了58.4%;粗纖維含量由25.3%下降到14.2%。本研究中，發(fā)酵后產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和灰分含量顯著提高。但發(fā)酵后粗纖維含量沒有下降，反而有所上升，可能原因在于甘薯渣在提取淀粉過程中，因淀粉提取程度不同，造成甘薯渣粗纖維含量差異很大，本研究中所用原料粗纖維只有8.8%，低于資料報道的27%的水平［28］。因此發(fā)酵時微生物優(yōu)先利用淀粉生長，這也是本研究中甘薯渣發(fā)酵后與湯小鵬等［10］發(fā)酵木薯渣相比，本試驗中產(chǎn)物中淀粉酶活性高，而CMCase等纖維素降解酶活性相對較低的原因。多菌混菌固態(tài)發(fā)酵，可有效提高產(chǎn)物中FPA、CMCase和淀粉酶等活性［29］，本研究采用 4種不同菌株混菌發(fā)酵，產(chǎn)物中檢測出了FPA、CMCase、β-葡萄糖苷酶和淀粉酶等活性。微生物在發(fā)酵過程中，利用發(fā)酵底物提供的氮源和碳源進行繁殖、生長，消耗部分底物，導(dǎo)致底物干物質(zhì)含量降低，從而使粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分含量相對提高，但是通過微生物發(fā)酵，一方面微生物可將甘薯渣中低質(zhì)量蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為高質(zhì)量菌體蛋白，提高蛋白質(zhì)質(zhì)量;另一方面固態(tài)發(fā)酵后產(chǎn)生的各種酶，以及微生物發(fā)酵過程中累積大量營養(yǎng)豐富的菌體蛋白及許多微生物代謝產(chǎn)物，間接提高了發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)價值，可望使甘薯渣營養(yǎng)價值得到進一步改善。此外，混菌發(fā)酵時有益微生物的競爭性生長，可望有效抑制導(dǎo)致甘薯渣腐爛變質(zhì)的有害微生物如黑根霉(Rhizopus stolonifer)軟腐菌生長，提高甘薯渣的存儲價值。

4 結(jié)論

①通過L16(45)正交試驗得到多菌混合發(fā)酵甘薯渣的最優(yōu)條件為:發(fā)酵溫度38℃，發(fā)酵時間4.5 d，料水比1∶1.3，接種量 1 ×106個/g，接種比例為黑曲霉2∶里氏木霉∶枯草芽孢桿菌1∶釀酒酵母1=1∶1∶2∶1。

②以最優(yōu)條件混菌發(fā)酵甘薯渣后，發(fā)酵產(chǎn)物中可檢測到CMCase、FPA、β-葡萄糖苷酶和淀粉酶等酶活性。與對照相比，以干物質(zhì)為基礎(chǔ)，發(fā)酵后顯著提高了產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和還原糖含量。發(fā)酵后粗纖維含量沒有下降，反而有所上升。

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