胎次和泌乳階段對(duì)荷斯坦奶牛血液乳成分前體物及泌乳相關(guān)激素含量的影響

韓英東 楊 亮 潘曉花 辛海瑞 熊本海

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

奶牛乳的合成受血液中乳成分前體物及血液中神經(jīng)內(nèi)分泌因子的共同調(diào)控，這些泌乳相關(guān)的血液指標(biāo)影響機(jī)體的物質(zhì)代謝及能量代謝，進(jìn)而影響乳品質(zhì)，因此研究血液中相關(guān)因子的變化規(guī)律，可以揭示泌乳奶牛在不同胎次和泌乳階段泌乳性能變化規(guī)律，為乳合成和分泌調(diào)控提供依據(jù)。血液中游離氨基酸及小肽、β-羥丁酸(β-hydroxybutyrate，BHBA)、長(zhǎng)鏈脂肪酸、葡萄糖(glucose，GLU)等營(yíng)養(yǎng)成分是乳成分的重要前體物質(zhì)(milk component precursor，MCP)，乳腺選擇性從血液中攝取乳成分前體物，在乳腺腺泡的分泌細(xì)胞中合成乳蛋白、乳脂肪、乳糖。另外，血液中神經(jīng)內(nèi)分泌因子在乳成分的合成過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用，目前研究比較透徹的泌乳相關(guān)的激素有生長(zhǎng)激素 (growth hormone，GH)、皮 質(zhì) 醇 (cortisol，COR)、胰島素(insulin，INS)、催乳素(prolactin，PRL)、孕酮(pregnendione，PRG)、甲狀腺素(thyroxine，T4)等［1-4］。研究發(fā)現(xiàn)，胎次、泌乳階段都會(huì)影響乳成分，同樣的因素也會(huì)影響正常奶牛的血液指標(biāo)。然而，已經(jīng)發(fā)表的血液指標(biāo)范圍并沒(méi)有把奶牛和肉牛區(qū)分開(kāi)來(lái)［5-6］，且血液指標(biāo)值多集中在發(fā)情期和圍產(chǎn)期這樣的特殊生理期［7-8］。對(duì)奶牛整個(gè)泌乳期泌乳相關(guān)血液指標(biāo)的研究還比較少。本研究通過(guò)研究不同胎次和泌乳階段的奶牛血液乳成分前體物和泌乳相關(guān)激素含量的變化，旨在幫助奶牛養(yǎng)殖者在個(gè)體和群體水平上監(jiān)測(cè)奶牛健康、識(shí)別異常情況，同時(shí)為進(jìn)一步研究泌乳的調(diào)節(jié)機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

選用健康1～4胎荷斯坦奶牛60頭，其中一胎牛23頭(日均產(chǎn)奶量20 kg以上)、二胎牛16頭、三胎牛11頭、四胎牛10頭(多胎次奶牛上一胎次日均產(chǎn)奶量在25 kg以上)。統(tǒng)一飼喂全混合日糧(total mixed ration，TMR)，其營(yíng)養(yǎng)水平滿(mǎn)足我國(guó)《奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 34—2004)［9］。TMR 組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。試驗(yàn)?zāi)膛２扇∩谑斤曃?，不同泌乳期的奶牛使用相同的TMR，但通過(guò)自由采食量的不同滿(mǎn)足對(duì)營(yíng)養(yǎng)需要量的差異。每天分別于07:00和19:00飼喂TMR，按每天每頭奶牛提供45 kg TMR，并保證奶牛每天至少20 h能采食到TMR。每天擠奶2次(04:30和15:30)，飼喂及擠奶時(shí)間外試驗(yàn)牛只散放于運(yùn)動(dòng)場(chǎng)中，自由飲水，牛舍及運(yùn)動(dòng)場(chǎng)每天打掃2次，保證牛舍及運(yùn)動(dòng)場(chǎng)衛(wèi)生。

表1 全混合日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the TMR(DM basis) %

1.2 樣品的采集與測(cè)定

試驗(yàn)時(shí)間為2013年9月17日至2014年1月3日，共108 d。每30 d測(cè)定1次產(chǎn)奶量并采集乳樣，由北京奶牛中心測(cè)定乳成分。血樣每15 d采集1次，于晨飼之前利用真空采血管采集尾根靜脈血9 mL，并記錄采樣日期，奶牛當(dāng)日的泌乳天數(shù)(DIM)。采集的血樣與3 000 r/min離心15～20 min，吸取血清分裝于 1 mL離心管中，于-20℃保存，待檢。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

所有血液指標(biāo)的檢測(cè)均送至北京中同藍(lán)博臨床檢驗(yàn)所檢測(cè)，指標(biāo)有GLU、甘油三酯(triglyceride，TG)、非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acid，NEFA)、BHBA、總 氨 基 酸 (total amino acids，T-AA)5 種乳成分前體物及 T4、GH、COR、INS、PRL、PRG 6種激素。具體檢測(cè)方法見(jiàn)表2。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

各血液指標(biāo)置信區(qū)間的計(jì)算采用采用國(guó)際醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(huì)(The International Federation of Clinical Chemistry)的推薦程序［10］。首先，去掉每個(gè)血液變量的離群值和超過(guò)平均值3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的值。然后，利用Proc Univeriate(SAS 9.2)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)并計(jì)算峰度值(kurtosis)和偏度值(skewness)以檢驗(yàn)分布的不對(duì)稱(chēng)性和峰度。Shapiro-Wilk試驗(yàn)W值≥0.98的變量，認(rèn)為是符合正態(tài)分布，其他非正態(tài)變量在進(jìn)行分析之前，要進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)變。

表2 血液指標(biāo)的單位、分析方法、檢測(cè)儀器Table 2 Units，analytical methods and instruments of blood parameters

符合正態(tài)分布和經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化的數(shù)據(jù)利用Proc Mixed(SAS 9.2)線(xiàn)性模型評(píng)估胎次、泌乳階段的固定效應(yīng)，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。數(shù)據(jù)處理結(jié)果見(jiàn)表3。

2 結(jié)果

2.1 血液指標(biāo)數(shù)據(jù)整理

由表3可知，血液 COR、GH、T4和 BHBA含量符合正態(tài)分布，其他指標(biāo)經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)變后可用于Proc Mixed分析。

表3 血液指標(biāo):去除異常值的樣本數(shù)、平均值、中位數(shù)、斜度、峰度、W值和標(biāo)準(zhǔn)差Table 3 Blood parameters:No.of samples after outlier deletion，mean，median，skewness and kurtosis，W-value and SD

2.2 胎次對(duì)奶牛血液乳成分前體物及泌乳相關(guān)激素含量的影響

由表4可知，不同胎次對(duì)泌乳奶牛血液中INS含量有顯著的影響(P＜0.05)，三胎、四胎奶牛血液中INS含量高于一胎奶牛INS含量，其中顯著高于一胎奶牛(P＜0.05);不同胎次對(duì)泌乳奶牛血液中PRL含量有顯著的影響(P＜0.05)，二胎、三胎奶牛血液中的PRL含量顯著高于四胎奶牛(P＜0.05)。胎次對(duì)奶牛血液中COR、GH、PRG、T4及5種乳成分前體物含量無(wú)顯著的影響(P＞0.05)。

表4 胎次對(duì)奶牛血液乳成分前體物及泌乳相關(guān)激素含量的影響Table 4 Effects of parities on blood contents of MCP and hormone related to lactation of dairy cows

2.3 泌乳階段對(duì)奶牛血液乳成分前體物及相關(guān)激素含量的影響

由表5可知，泌乳階段對(duì)奶牛血液中COR、INS、GH、PRG、T4含量均有顯著的影響(P＜0.05)。隨著泌乳時(shí)間的延長(zhǎng)，COR含量呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，泌乳中期、后期顯著低于泌乳前期和高峰期(P＜0.05);GH含量呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)，泌乳后期顯著高于前3期(P＜0.05);PRG含量泌乳早期和高峰期顯著低于泌乳中期和后期(P＜0.05)，且在泌乳中期和后期維持一個(gè)較高的水平;T4含量泌乳早期顯著低于其他3期(P＜0.05)。經(jīng)產(chǎn)和初產(chǎn)奶牛產(chǎn)奶量均隨泌乳時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降，與血液中COR、GH、PRG、T4含量變化趨勢(shì)未見(jiàn)一致性(圖1)。

由表5可知，泌乳階段對(duì)血液中GLU、BHBA、NEFA及T-AA含量有顯著的影響(P＜0.05)，對(duì)血液中的 TG含量無(wú)顯著影響(P＞0.05)。隨著泌乳時(shí)間的延長(zhǎng)，血液中GLU含量呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)，泌乳早期顯著低于其他3期(P＜0.05)，泌乳高峰期顯著低于泌乳中期和后期(P＜0.05);BHBA含量在泌乳早期顯著高于其他泌乳時(shí)期(P＜0.05);NEFA含量呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì)，泌乳早期顯著高于其他3期(P＜0.05)，泌乳高峰期顯著高于泌乳中期和后期(P＜0.05);T-AA含量泌乳中期顯著高于其他泌乳時(shí)期(P＜0.05)。乳蛋白含量和血液T-AA和GH含量的變化趨勢(shì)基本一致(圖2)。乳脂肪含量和血液 NEFA、COR、GH和BHBA含量的變化趨勢(shì)基本一致(圖3)。乳糖含量和血液GLU、GH含量的變化趨勢(shì)基本一致(圖4)。

圖1 產(chǎn)奶量與血液COR、T4、GH、PRG含量的變化趨勢(shì)Fig.1 The changing trends of MY and blood COR，T4，GH and PRG contents

圖2 乳蛋白和血液T-AA、GH含量的變化趨勢(shì)Fig.2 The changing trends of MP，and blood T-AA and GH contents

3 討論

3.1 胎次對(duì)奶牛血液乳成分前體物及泌乳相關(guān)激素含量的影響

不同胎次之間奶牛的產(chǎn)奶能力、乳成分及血液指標(biāo)具有很大的差異。奶牛的產(chǎn)奶能力隨胎次的增加而發(fā)生規(guī)律性的變化。在正常飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下的荷斯坦牛的產(chǎn)奶量高峰值出現(xiàn)在五胎左右，在此之前，奶牛的產(chǎn)奶量呈逐胎次上升的趨勢(shì)，此后，奶牛的產(chǎn)奶量呈依胎次下降的趨勢(shì)。不同胎次的奶牛乳成分的含量會(huì)有顯著的不同，熊本海等［11］研究發(fā)現(xiàn)乳中干物質(zhì)、蛋白質(zhì)以及乳糖含量從第4胎開(kāi)始顯著下降，而體細(xì)胞數(shù)在第4胎開(kāi)始顯著上升，奶損失量也隨胎次顯著增加。同樣，奶牛的血液組成隨胎次增加而發(fā)生變化。Cozzi等［12］研究表明血液中的總蛋白、球蛋白、肌酐酸含量和堿性磷酸酶、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、肌酸激酶活性在初產(chǎn)牛和多胎次牛之間有差異。Doornenbal等［13］研究表明肉牛血液中尿素氮、總蛋白、膽紅素含量和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶的活性隨年齡的增加而增加，鈣和磷含量隨年齡(0～10歲)的增加而降低。

圖3 乳脂肪和血液NEFA、COR、GH和BHBA含量的變化趨勢(shì)Fig.3 The changing trends of MF，and blood NEFA，COR，GH and BHBA contents

圖4 乳糖和血液GLU、GH含量的變化趨勢(shì)Fig.4 The changing trends of lactose，and blood GLU and GH contents

表5 泌乳階段對(duì)奶牛血液乳成分前體物及相關(guān)激素含量的影響Table 5 Effects of stage of lactation on blood contents of MCP and hormone related to lactation of dairy cows

本研究發(fā)現(xiàn)不同胎次對(duì)泌乳奶牛血液中PRL含量有顯著的影響，二胎、三胎奶牛血液中的PRL含量高于四胎奶牛血液中的PRL含量。PRL是脊椎動(dòng)物腺垂體的PRL細(xì)胞合成分泌的一種肽類(lèi)激素，主要作用是促進(jìn)乳腺生長(zhǎng)發(fā)育、發(fā)動(dòng)和維持泌乳。PRL含量的高峰對(duì)于整個(gè)泌乳的啟動(dòng)過(guò)程特別是全乳分泌的啟動(dòng)非常重要。體外研究表明，在INS和COR存在的情況下PRL能夠誘導(dǎo)乳蛋白的分泌。與促進(jìn)乳腺發(fā)育的機(jī)制相似，PRL與它的受體結(jié)合能夠啟動(dòng)生乳反應(yīng)，隨后一連串的生物反應(yīng)也被啟動(dòng)，并最后影響基因轉(zhuǎn)錄以及對(duì)乳蛋白分泌進(jìn)行調(diào)節(jié)［14-15］。胎次對(duì)泌乳奶牛血液中INS含量有顯著的影響，三胎、四胎奶牛血液中INS含量高于一胎奶牛。INS是由胰島β細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)激素，是機(jī)體內(nèi)唯一降低血液GLU的激素，同時(shí)促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)的合成。INS參與調(diào)節(jié)糖代謝，控制血液GLU平衡。機(jī)體的能量狀況對(duì)INS含量影響較大，是反映體內(nèi)能量狀況的一種激素。研究表明，增加血液中INS含量則提高產(chǎn)奶量，明顯增加了乳腺血流量［16-17］。而在本研究中發(fā)現(xiàn)胎次對(duì)血液中乳成分前體物含量并沒(méi)有顯著的影響，而不同胎次之間的乳成分是有差別的［18］。因此奶牛產(chǎn)奶性能及乳成分含量隨胎次發(fā)生變化的原因可能是血液中的激素含量的不同，引起機(jī)體新陳代謝和乳腺生理功能的變化，但具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

3.2 泌乳階段對(duì)奶牛血液乳成分前體物及相關(guān)激素含量的影響

奶牛的整個(gè)泌乳期產(chǎn)奶量有較大變化，母牛產(chǎn)犢后，在正常情況下產(chǎn)奶量逐日增加，到產(chǎn)后42～70 d出現(xiàn)最高日產(chǎn)奶量，若按泌乳月計(jì)算，約在第2個(gè)泌乳月產(chǎn)奶量出現(xiàn)最高峰。此后3～5個(gè)月為平穩(wěn)期，高產(chǎn)奶牛其曲線(xiàn)基本不變，6～10個(gè)月為泌乳后期，高產(chǎn)奶牛產(chǎn)奶量下降得很少或不下降。研究表明，奶牛泌乳期間體內(nèi)代謝過(guò)程變化劇烈，并且在血液指標(biāo)上得以反應(yīng)。王小龍等［19］發(fā)現(xiàn)血液中的谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、肌酸磷酸激酶活性和無(wú)機(jī)磷、總蛋白、總膽紅素含量在妊娠后期、泌乳早期與泌乳晚期均有較大的變化。Cozzi等［12］研究發(fā)現(xiàn)血液中的 NEFA、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、肌酸激酶、膽固醇的含量泌乳早期和中期之間有顯著的差異。

本研究發(fā)現(xiàn)泌乳階段對(duì)血液指標(biāo)乳成分前體物中的GLU、BHBA、NEFA及T-AA含量有顯著的影響，對(duì)血液中TG含量無(wú)影響。GLU是乳腺上皮細(xì)胞合成乳糖的主要前體物，乳腺主要通過(guò)從血液攝取GLU合成乳糖。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺對(duì)GLU的攝取受到血液GLU含量的直接影響。本研究發(fā)現(xiàn)血液中的GLU在4個(gè)泌乳階段含量呈現(xiàn)依次遞增，與Cozzi等［12］的研究結(jié)果不一致，且乳糖含量與血液GLU含量變化趨勢(shì)不一致。Cant等［20］和 Zhao 等［21］研究結(jié)果說(shuō)明增加血液 GLU含量將會(huì)增加乳腺對(duì)其的攝取量，引起乳糖的合成量增加，但機(jī)體可通過(guò)調(diào)節(jié)乳腺血流速度控制GLU的攝取。本研究發(fā)現(xiàn)整個(gè)泌乳期乳脂含量變化趨勢(shì)和乳脂前體物BHBA、NEFA的變化趨勢(shì)基本一致。BHBA是酮體的主要成分，約占酮體的70%，奶牛養(yǎng)殖者用血液中的BHBA來(lái)作為診斷亞臨床酮病的一項(xiàng)指標(biāo)［22］。但是血液中的BHBA含量受飼喂時(shí)間，飼喂次數(shù)及飼糧組成的影響［23］。NEFA含量的高低是檢測(cè)奶牛能量負(fù)平衡的標(biāo)志［24］。在泌乳早期，NEFA含量反映了動(dòng)員脂肪儲(chǔ)備來(lái)彌補(bǔ)奶牛吸收營(yíng)養(yǎng)和泌乳所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之間的不平衡［24-25］。在泌乳中期 NEFA含量相對(duì)較低，因?yàn)槟膛Ｄ芰看x正平衡及奶牛重新補(bǔ)充動(dòng)員的機(jī)體儲(chǔ)備［26］。T-AA含量泌乳中期高于其他泌乳時(shí)期，可能是奶牛自身為了調(diào)節(jié)泌乳初期氨基酸供給的不足，動(dòng)用貯存于組織間的易動(dòng)性蛋白質(zhì)的氨基酸，增加供給量。研究認(rèn)為，增加進(jìn)入乳腺的氨基酸含量可促進(jìn)乳蛋白質(zhì)的生成［27-28］。本研究發(fā)現(xiàn)血液GLU含量泌乳前期顯著低于其他階段，而B(niǎo)HBA和NEFA含量顯著高于其他階段，原因是圍產(chǎn)期奶牛能量供應(yīng)不足，需動(dòng)用體脂供應(yīng)能量。

泌乳階段對(duì)奶牛血液指標(biāo)中GH、COR、PRG、T4、GH含量均有顯著的影響。GH是腺垂體分泌的一種具有種屬特性的蛋白質(zhì)激素，是調(diào)節(jié)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育和三大代謝過(guò)程的一個(gè)重要內(nèi)分泌因子。牛GH主要調(diào)節(jié)機(jī)體物質(zhì)代謝，促進(jìn)GLU吸收及碳水化合物和脂肪的分解，調(diào)節(jié)核酸與蛋白質(zhì)的合成，提高飼料的轉(zhuǎn)化率。對(duì)于反芻動(dòng)物，GH可增加乳汁的生成，這種作用是否通過(guò)進(jìn)入乳房的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流量間接發(fā)生，還是直接作用于腺泡上皮細(xì)胞發(fā)生還不清楚。研究表明，當(dāng)給泌乳奶牛注射外源性GH時(shí)，則能夠明顯提高乳腺組織氨基酸的攝取速度及乳腺的血流量，最終使產(chǎn)奶量增加［29］。此外，GH還可能具有使泌乳期奶牛體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)重新分配的作用，這有利于動(dòng)員體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)產(chǎn)奶過(guò)程的供應(yīng)［30］。本研究發(fā)現(xiàn)GH的變化趨勢(shì)和產(chǎn)奶量的趨勢(shì)并不一致，T4含量在泌乳后期有下降的趨勢(shì)，可能是因?yàn)镚H促進(jìn)泌乳需要其他激素的協(xié)同作用。Kahl等［31］研究表明甲狀腺激素對(duì)GH和PRL促進(jìn)乳腺生乳也是必需的。COR是奶牛主要的內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素，其基本功能是促進(jìn)乳腺腺泡系統(tǒng)分化發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)COR含量在泌乳早期較高，可能是因?yàn)樘瞧べ|(zhì)激素所誘導(dǎo)的細(xì)胞分化是PRL促進(jìn)乳蛋白合成的前提條件［32］。PRG在孕激素中活性最高，黃體分泌的PRG能抑制泌乳的啟動(dòng)。PRG主要作用是促進(jìn)乳腺小葉及腺泡的發(fā)育，在雌激素刺激乳腺導(dǎo)管發(fā)育的基礎(chǔ)上，使得乳腺充分發(fā)育。

1個(gè)泌乳周期中，乳腺泌乳功能受多種因素影響，其調(diào)控機(jī)理尚不清楚，現(xiàn)有研究表明，多種激素及其受體與泌乳及乳腺的生長(zhǎng)、分化和退化密切相關(guān)，整個(gè)泌乳期奶牛血液中乳成分前體物含量的高低也是影響產(chǎn)奶量及乳成分的重要因素，其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

① 不同胎次之間泌乳奶牛血液中INS、PRL含量有極顯著的差異，而血液中COR、GH、PRG、T4及5種乳成分前體物乳成分前體物含量無(wú)顯著的差異。胎次之間的產(chǎn)奶量及乳成分含量的差異可能與血液中激素含量有關(guān)，與乳成分前體物含量無(wú)關(guān)。

②不同的泌乳階段之間奶牛血液指標(biāo)中COR、GH、PRG、T4含量均有顯著的差異，泌乳階段對(duì)血液乳成分前體物中的GLU、BHBA、NEFA及T-AA有顯著的影響，對(duì)TG含量無(wú)顯著影響。泌乳早期和高峰期奶牛血液指標(biāo)變化較劇烈，容易發(fā)生各種代謝疾病，應(yīng)重點(diǎn)監(jiān)測(cè)。

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