血流動力學變化對大鼠靜脈重建影響模型建立及微觀結構觀察

郭占芳，梁向黨，孫 賡，鄒秀強，余寬寬，房卓群

血流動力學變化對大鼠靜脈重建影響模型建立及微觀結構觀察

郭占芳，梁向黨，孫 賡，鄒秀強，余寬寬，房卓群

目的：觀察血流動力學變化對大鼠頸動靜脈內瘺后血管重建的影響。方法：取30只雄性SD大鼠，體質量300～350 g，行頸總動脈、頸外靜脈造瘺術，以動靜脈吻合口為中心、由靜脈端1 cm進行取材作為實驗組，對側正常靜脈1 cm處進行取材作為對照組，分別于術后1、2和4周觀察頸動靜脈重建微觀結構變化情況。移植段血管縱行切開后，（1）行大體觀察；（2）行HE染色，測量血管內膜厚度；（3）行EVG（Verhoeff's Van Gieson）染色，觀察膠原纖維、彈性纖維變化；（4）行增殖細胞核抗原免疫組化，觀察細胞增生情況。結果：超聲掃描和大體觀察結果顯示，實驗組和對照組血管均通暢。術后2和4周蘇木精-伊紅染色（hematoxyin-eosin staining，HE）結果顯示，實驗組血管內膜增生嚴重。EVG染色結果顯示，實驗組和對照組比較，彈性纖維無明顯變化，實驗組較對照組膠原纖維含量增多。增殖細胞核抗原免疫組化結果顯示，實驗組可見大量增生細胞，對照組未見增生細胞。結論：大鼠頸動靜脈瘺模型制作簡單，可作為觀察血流動力學變化對血管重建影響的模型。

血流動力學；動靜脈瘺；增生；萎縮

0 引言

眾所周知，血流動力學變化是靜脈血管重建的重要影響因素，但其相關影響機制仍未完全清楚。許多學者通過靜動脈移植建立研究模型，但靜動脈移植后近期血栓形成發(fā)生率高，或者靜脈橋血管早期狹窄閉塞時有發(fā)生，造模失敗在一定程度上阻礙了研究進展，因此建立一種簡單可重復的相關研究模型極為重要。筆者認為動靜脈瘺作為相關研究模型比較合適。1966年，美國學者Brescia和Cimino通過顯微外科技術成功建立了第一例腕部動靜脈內瘺[1]，在以后的40多年間動靜脈內瘺成為血液透析血管通路構建的首選方法。目前，動靜脈內瘺2 a通暢率為65%[2]，一般動靜脈內瘺的血液透析治療過程中4～5 a即會出現(xiàn)血管狹窄閉塞的情況。為了延長動靜脈內瘺的使用時間，有學者使用了球囊擴張術、外科手術再通術、遠紅外線照射、基因轉染等技術[3-6]，減少狹窄或使動靜脈內瘺二次再通。動靜脈瘺技術目前已經(jīng)非常成熟。筆者建立了大鼠頸動靜脈瘺，對動靜脈瘺后血管重建進行觀測。主要從靜脈管壁內膜厚度、管壁細胞增生情況、膠原纖維和彈性纖維含量變化方面進行觀測。進一步探討血流動力學變化和靜脈重構之間的關系，檢驗動靜脈瘺模型的適用性。

1 實驗資料

1.1 動物、材料和儀器

健康成年SD雄性大鼠30只，質量為300～350g/只，由解放軍總醫(yī)院動物實驗中心提供；超聲診斷儀（美國Logiq3exp），組織切片機（德國Leica），光學顯微鏡及照相裝置（日本Nikon）。

1.2 實驗方法

取30只SD大鼠，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，按35 mg/kg計算用量。使大鼠仰臥于手術臺上，通過頸部正中切口，切開皮膚、皮下筋膜和頸闊肌，暴露左側頸總動脈和頸外靜脈，顯微鑷游離頸總動脈和頸外靜脈。整齊切斷頸總動脈和（或）頸外靜脈，結扎遠端血管，近段動靜脈吻合造瘺。術后1、2和4周，分別對10只大鼠取材，以動靜脈吻合口為中心，靜脈端1 cm進行取材，對側正常靜脈1 cm進行取材，觀察頸動靜脈重建超微結構變化。實驗組為頸靜脈側離吻合口1 cm以內段；對照組為對側頸靜脈側1 cm段。血管吻合采用傳統(tǒng)針線縫合方法，縫線為10-0絲線。逐層縫合手術切口，關閉切口，手術時間30 min內。關閉切口前用青霉素4×105萬U鹽水沖洗切口，術后用100U/mL肝素鹽水1mL皮下注射3 d。

1.3 觀察方法

1.3.1 大體觀察

于手術后1、2和4周，用相同方法腹腔注射麻醉，手術臺上暴露左側頸動靜脈瘺，分別行血流夾斷通暢實驗。

1.3.2 血管超聲檢查

于手術后1、2和4周，用超聲診斷儀（美國Logiq3exp）行頸動靜脈瘺檢查，觀察血管血流通暢情況并作記錄。

1.3.3 組織學觀察

用血管夾夾持造瘺血管吻合口兩端，眼科剪橫斷血管，用注射器吸生理鹽水沖洗離體血管，取吻合口靜脈側血管1 cm、對側正常靜脈1 cm，置于10%福爾馬林中，8 h后行沖洗、脫水、浸蠟，石蠟包埋，預切厚度5 μm，組織切片，脫水、透明、蘇木精-伊紅染色（hematoxyin-eosin staining，HE）和 EVG（Verhoeff's Van Gieson）染色、中性樹膠固定。樹膠凝固干燥后，在光學顯微鏡下觀察，用ImageProfessionPlus6.0軟件測量血管內膜厚度，觀測膠原纖維和彈性纖維含量變化。

1.3.4 抗PCNA陽性細胞計數(shù)

用增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體（abcom[PC10，ab29]）經(jīng)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）染色，定位細胞核，陽性細胞為棕黃色。隨機計數(shù)血管內膜500細胞內陽性細胞比例。實驗步驟參照試劑說明書。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 大體觀察

術后1、2和4周行大體觀察，血管血流均通暢。動物處死后血管縱向切開觀察，吻合口處內膜部分增生。

2.2 血管超聲檢查

術后1、2和4周超聲檢查，血流通暢，動靜脈瘺靜脈管腔明顯變大。

2.3 組織學觀察

術后1周，實驗組血管管壁厚度輕微變薄，內膜厚度和對照組間比較無統(tǒng)計學差異；術后2周，實驗組血管管壁明顯變厚，內膜明顯變厚，內膜厚度和對照組間比較有統(tǒng)計學差異；術后4周，實驗組血管管壁進一步變厚，內膜厚度和對照組間比較有統(tǒng)計學差異。由圖像分析軟件測量的內膜厚度結果如圖1所示，具體數(shù)據(jù)見表1。

圖1 對照組術后4周和實驗組術后1、2、4周靜脈管壁圖像（HE，×400）

2.4 抗PCNA陽性細胞計數(shù)

實驗組血管管壁：術后1周，抗PCNA陽性細胞有少量表達，內膜、中膜和外膜可見增殖細胞；術后2周，抗PCNA陽性細胞有較多表達，中膜和內膜多見；術后4周，抗PCNA陽性細胞有大量表達，多分布于內膜增生斑塊。對照組血管管壁：各時期抗PCNA陽性細胞極少量或無表達。結果如圖2所示，具體數(shù)據(jù)見表2。

表1 觀察時間點血管內膜厚度（±s）μm

表1 觀察時間點血管內膜厚度（±s）μm

實驗組 6.35±0.74 9.38±0.92 14.75±1.21對照組 6.87±0.52 6.79±0.34 06.41±0.77 P值 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 1周 2周 4周組別 血管內膜厚度

圖2 對照組術后4周和實驗組術后1、2、4周靜脈管壁抗PCNA陽性細胞表達圖像（免疫組化，×400）

表2 觀察時間點血管內膜PCNA指數(shù)（±s）%

表2 觀察時間點血管內膜PCNA指數(shù)（±s）%

實驗組 5.12±0.97 26.68±4.51 30.58±3.16對照組 — 01.82±0.06 01.15±0.02 P值 ＜0.05 ＜0.05 1周 2周 4周組別 血管內膜PCNA指數(shù)

2.5 彈性纖維和膠原纖維含量變化

應用EVG染色，各觀察時間點彈性纖維含量無明顯變化（對照組為（2±0.3）%；實驗組術后1周為（2±0.1）%，術后2周為（2±0.3）%，術后4周為（2± 0.2）%）；膠原纖維含量明顯增加（對照組為（29± 4.2）%；實驗組術后1周為（30±3.2）%，術后2周為（39±3.9）%，術后4周為（47%±5.8）%）。結果如圖3所示。

3 討論

血流動力學變化對血管內膜增生重構的影響很早就被發(fā)現(xiàn)[7]，相關研究模型也有很多種，但很少有學者將大鼠頸動靜脈瘺作為血流動力學變化對血管重構影響研究的模型。筆者采用的大鼠動靜脈瘺模型，對研究血流動力學變化對靜脈重構的影響方面具備較多優(yōu)點。頸動靜脈瘺術后4周內，大鼠精神狀態(tài)好，飲食正常，無死亡發(fā)生。動靜脈瘺模型制備較簡單且成功率高，筆者在前期進行大鼠頸外靜脈移植到頸總動脈的模型制備中，發(fā)現(xiàn)即使在肝素等藥物的干預下血栓發(fā)生率仍極高。并且相對于大動物模型，小動物實驗飼養(yǎng)成本低，大鼠抗病能力強，更重要的是近年鼠的基因敲除技術應用廣泛。筆者建立的大鼠動靜脈瘺模型較好地模擬了血流動力學變化和靜脈重構的發(fā)生。

圖3 對照組術后4周和試驗組術后1、2、4周靜脈管壁膠原纖維和彈性纖維染色圖像（EVG，×400）

血流動力學變化引起血管中膜血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）表型改變，進而增殖并向內膜遷移，引起內膜增生，已經(jīng)被許多學者在動物實驗中驗證[8]。特別是靜脈血管在解剖學上缺乏內彈力膜，與內膜鄰近的中膜血管平滑肌細胞對內膜增生的影響更為明顯。這一現(xiàn)象在大鼠頸動脈瘺模型中也得到了較好體現(xiàn)。筆者在實驗中發(fā)現(xiàn)，在術后1周靠近吻合口的靜脈處，抗PCNA陽性細胞表達比較明顯的部位是血管外膜和內膜，說明外膜和內膜較早參與了血管重構，血管中膜在術后2周和術后4周的血管重構中表現(xiàn)較明顯。以前研究重點大多集中在血管中膜，而外膜成肌纖維細胞的表型改變、增殖遷移并未引起足夠重視。血管內膜增生重構與血流動力學變化有緊密的聯(lián)系，而血管外膜的早期重構也許與必然的手術操作等外部機械力損傷關系密切。外膜重構在整個血管重構中的啟動作用不可忽視，還需要進一步研究。

血流動力學變化引起血管重構也表現(xiàn)為細胞外基質（extracellular matrixc，ECM）的變化[9]。通過EVG染色，可以觀察到血管重構后，彈性纖維有部分斷裂，彈性纖維含量變化不具有統(tǒng)計學意義。術后

（????）（????）1周，靜脈血管膠原纖維含量未見明顯變化，術后2周及術后4周膠原纖維含量卻出現(xiàn)了大幅提高。血流動力學變化對血管重構的影響在細胞外基質變化方面有明顯體現(xiàn)。細胞外基質為細胞分泌產生，同時細胞外基質對細胞具有支持作用，并對細胞增殖、分化、代謝和遷移起到重要作用。正常靜脈，細胞外基質有抑制平滑肌細胞增生的作用。筆者實驗中觀察到術后4周動靜脈瘺吻合口有大量膠原纖維呈現(xiàn)息肉樣增生，包含了大量的抗PCNA陽性細胞。在預防動靜脈瘺狹窄導致血管功能喪失方面，對膠原纖維的分泌進行調解是一個重要的研究新途徑。

大鼠頸動靜脈瘺模型制作簡單，血流動力學變化對血管重構影響明顯，因此不但可以作為動靜脈瘺導致血管功能喪失的研究模型，作為血流動力學變化影響血管重構研究模型也同樣適用。與其他研究模型相比較，該模型具有經(jīng)濟、實用、成功率高等諸多優(yōu)點。

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（收稿：2014-12-24）

Effect of hemodynamic changes on rat vein reconstruction:model establishing and microstructure observation

GUO Zhan-fang1,LIANG Xiang-dang1,SUN Geng2,ZOU Xiu-qiang3,YU Kuan-kuan1,FANG Zhuo-qun1
（1.No.1 Section of Orthopaedics Department,General Hospital of the PLA,Beijing 100853,China; 2.The 252nd Hospital of the PLA,Baoding 350025,Hebei Province,China）

ObjectiveTo explore the effects of hemodynamic changes on rat vein reconstruction after carotid-jugular arteriovenous fistula.MethodsA total of 30 male SD rats weighting 300 to 350 g underwent common carotid fistula and external jugular fistula.With the arteriovenous anastomoses as the centers,some 1-cm segments at the side of vein were extracted and enrolled in an experiment group,and some 1-cm vein segments at the opposite side were cut off and enrolled into a control group.Hemodynamic changes on rat vein reconstruction were observed 1,2 and 4 weeks after.The segments were split longitudinally and observed grossly,and then underwent hematoxyin-eosin(HE)staining to measure endangium thickness,Verhoeff's Van Gieson(EVG)staining to determine the changes of collagen fiber and elastic fiber,and proliferating cell nuclear antigen(PCNA)immunohistochemistry examination to make clear cellular proliferation.ResultsUltrasound and gross observation showed that the blood flows were smooth in all the groups.HE staining 2 and 4 weeks after found that there was serious endangium hyperplasia in the experiment group.EVG staining showed that the experiment group had the elastic fibers with no obvious difference with those of the control group,while the collagen fibers significantly different from those of the latter.PCNA immunohistochemistry examination proved that there were lots of hyperplastic cells in the experiment group while no ones in the control group.ConclusionRat carotid-jugular arteriovenous fistula model is easy to make, which can be used to observe the effect of hemodynamic changes on vascular reconstruction.[Chinese Medical Equipment Journal，2015，36（4）：5-7,11]

hemodynamics;arteriovenous fistula;hyperplasia;analosis

R318

A

1003-8868（2015）04-0005-04

10.7687/J.ISSN1003-8868.2015.04.005

國家科技部國際合作項目（2014DFA31230）

郭占芳（1981—），男，主治醫(yī)師，主要從事血管、神經(jīng)的創(chuàng)傷修復方面的研究工作，E-mail：13321109019@189.cn。

100853北京，解放軍總醫(yī)院骨科一病區(qū)（郭占芳，梁向黨，鄒秀強，余寬寬，房卓群）；071000河北保定，解放軍252醫(yī)院骨科（孫 賡）

梁向黨，E-mail：lxd301@263.net