香樟延伸因子EF1a基因片段的克隆及表達(dá)分析

張力維，李勇鵬，姚 瑤，梁 優(yōu)，杜 麗

（南陽師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南 南陽 473000）

香樟延伸因子EF1a基因片段的克隆及表達(dá)分析

張力維，李勇鵬，姚 瑤，梁 優(yōu)，杜 麗

（南陽師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南 南陽 473000）

通過同源克隆的方法從香樟Cinnamomum camphora中分離到一個(gè)編碼延伸因子EF1a的cDNA序列片段。根據(jù)已經(jīng)在GenBank中登錄的其它物種的EF1a基因的保守序列設(shè)計(jì)一對兼并引物，通過反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)獲得一個(gè)1 297 bp的基因片段。同源比對表明：CcEF1a與GenBank中注冊的其它植物EF1a基因核苷酸序列的相似性均在80%以上，氨基酸序列的相似性高達(dá)96%以上。將所獲得基因片段命名為CcEF1a并提交GenBank，登錄號為KM086740。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，CcEF1a在低溫脅迫下的葉片中表達(dá)量穩(wěn)定，可以在實(shí)時(shí)定量PCR分析中作為內(nèi)參基因。

香樟；延伸因子；EF1a基因片段； 克??； 表達(dá)分析

香 樟Cinnamomum camphora， 樟 科Lauraceae，常綠喬木，是貴重家具、高級建筑、造船和雕刻等的理想用材，近年來，香樟在園林綠化中的應(yīng)用越來越多，成為城市重要的園林綠化樹種[1]。香樟在抗有害氣體中也發(fā)揮重要作用，是城區(qū)抗有害氣體的骨干樹種[2]。但是耐寒性差這一不良性狀嚴(yán)重限制了香樟的地理分布及其在園林綠化中的應(yīng)用，香樟抗寒新品種的培育有利于香樟的推廣，豐富北方冬天的園林植物組合。研究香樟抗寒相關(guān)基因從而通過基因工程技術(shù)獲得抗寒性增強(qiáng)的香樟新品種是一個(gè)有效的途徑，基因工程育種與傳統(tǒng)育種相比具有較強(qiáng)的目的性、育種周期短和克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的優(yōu)點(diǎn)。

近 年 來，CBF/DREB1（CRT/DRE binding factor 1）轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為是對植物冷馴化機(jī)制具有重要調(diào)節(jié)作用的一類基因，該基因能感受上游傳遞的低溫信號，在低溫誘導(dǎo)下迅速合成，并在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控多個(gè)抗逆基因，從而提高植物的耐寒性。周靜等[3]獲得了藍(lán)花楹JaCBF1基因的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)耐寒性分析，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥抗寒性較對照組增強(qiáng)，因而對該家族基因的克隆和分子重組為實(shí)現(xiàn)育種目標(biāo)提供了新思路。CBF/DREB1途徑廣泛存在于各個(gè)物種中，近年來科學(xué)家們相繼從平榛、巨桉、梅花等木本植物中分離到CBF/DREB1家族基因[4-6]，本實(shí)驗(yàn)室也已經(jīng)從香樟中克隆到2個(gè)CBF/DREB1家族基因（數(shù)據(jù)未公布），要深入研究這些基因的抗寒相關(guān)性及表達(dá)模式，一般通過實(shí)時(shí)定量PCR手段對基因的表達(dá)量進(jìn)行定量分析。

實(shí)時(shí)定量PCR(realtime quantitative reverse transcription polymerase chain reaction )即RT-qPCR由于其再現(xiàn)性和靈敏度（reproducibility and sensitivity）高而成為對基因的表達(dá)量進(jìn)行定量的最佳選擇，并廣泛應(yīng)用于植物的表達(dá)分析中[7-8]。RT-qPCR技術(shù)需要合適的內(nèi)參基因才能使對基因的定量分析有意義[9]。研究抗寒相關(guān)基因的表達(dá)模式需要一個(gè)在低溫條件下表達(dá)量相對恒定的持家基因作為內(nèi)參，從而實(shí)現(xiàn)該基因的定量和標(biāo)準(zhǔn)化。近年來關(guān)于各個(gè)物種實(shí)時(shí)定量PCR分析中內(nèi)參基因篩選的報(bào)道很多，如牡丹、馬鈴薯、柳枝稷等[10-12]，傳統(tǒng)持家基因像甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、肌動(dòng)蛋白（ACT）和延伸因子（EF1a）因?yàn)槠浣M成型表達(dá)而被廣泛認(rèn)為是比較可靠的內(nèi) 參 基 因[13]。EF1a基 因（elongation factor 1 alpha）編碼真核生物翻譯延伸因子（eEF1）的一個(gè)亞基，在細(xì)胞中表達(dá)豐都較高，真核生物的延伸因子是一類在蛋白質(zhì)合成中發(fā)揮作用的組成型蛋白，幫助肽鏈的延伸，其中eEF1由4個(gè)亞基構(gòu)成[14]。EF1a被認(rèn)為在黃瓜、矮牽牛和大白菜中最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因[15-17]。很多研究者在研究抗寒相關(guān)基因DREB1家族基因的表達(dá)模式中應(yīng)用了EF1a基因作為內(nèi)參基因[6,18]，因而，本研究也首選EF1a基因作為后續(xù)實(shí)時(shí)定量PCR工作的內(nèi)參基因。然而，目前為止，國內(nèi)外還沒有見到香樟延伸因子EF1a相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道，GenBank中也沒有與香樟延伸因子EF1a有關(guān)的基因序列登錄。本研究從香樟中克隆了EF1a基因片段，并設(shè)計(jì)了RT-qPCR引物，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，研究了其在低溫脅迫0～72 h下葉片中的表達(dá)量變化，并利用軟件對該基因的穩(wěn)定性做了評估。研究結(jié)果可以為開展香樟抗寒或其它相關(guān)基因的表達(dá)分析和調(diào)控等研究工作提供內(nèi)參基因，也為其他科研工作者們研究香樟提供了優(yōu)良的候選內(nèi)參基因，同時(shí)為其他物種EF1a基因的克隆提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試材料為實(shí)驗(yàn)室保存的香樟無性系組培苗，繼代培養(yǎng)基為 MS+2.0 g·L-1BA+0.5 g·L-12,4-D，生根培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，其中蔗糖30 g·L-1，瓊脂8.0 g·L-1，培養(yǎng)溫度 (25±1) ℃，光照強(qiáng)度 2 500 lx，光照/黑暗時(shí)間16/8 h。待材料在生根培養(yǎng)基中生長至有5～7片葉片時(shí)，對材料進(jìn)行低溫處理，處理溫度為4 ℃，分別于0、0.5、1、2、4、6、12、24、48和72 h 隨機(jī)取葉片，所有的材料平行取4個(gè)重復(fù)，收獲后立即用液氮速凍，-80℃保存直至RNA提??；大腸桿菌TOP10原菌株為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑

EasyTaq DNA Polymerase購自北京全式金（Transgen）生物技術(shù)有限公司；dNTP Mixture、DL2000 DNA Maker、PMD19-T Vector、PrimeScriptII 1st strand cDNA Synthesis Kit購自大連寶生物工程（TaKaRa）有限公司；CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒、EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒購自北京艾德萊（Aidlab）生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒購自蘇州康寧（Axygen）生命科學(xué)有限公司；0.2 mL EU材質(zhì)薄壁8連管購自荷蘭Bioplastics公司；RT-qPCR反應(yīng)試劑FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）購自德國羅氏（Roche）公司；PCR引物合成及測序工作由上海生工生物工程（Sangon Biotech）股份有限公司完成；其他生化試劑采用國產(chǎn)或者進(jìn)口分析純。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA的提取

根據(jù)北京艾德萊EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒的操作說明提取香樟葉片總RNA。

1.2.2 香樟延伸因子CcEF1a基因片段的克隆

通過比對已發(fā)表的EF1a基因cDNA序列，根據(jù)保守區(qū)域利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)一對簡并引物EF1aF和EF1aR，其中EF1aF，ATGGGYAARGARAAGWYYCAYATCAAC；EF1aR，GAAATCCACATCTGYTGGAA。 用 該對引物擴(kuò)增香樟EF1a基因片段，PCR產(chǎn)物利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，利用Axygen公司的DNA回收試劑盒回收目的條帶，連接至TaKaRa公司的PMD19-T載體上，16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)TOP10，菌落PCR檢測，挑選陽性克隆送往上海生工測序。

1.2.3 香樟延伸因子CcEF1a基因的生物信息學(xué)分析

將測序獲得的香樟EF1a基因片段的核苷酸序 列， 在 http：//www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng) 站 上 使用BLAST工具進(jìn)行基因序列相似性分析，利用DNAMAN和CLUSTALX等生物軟件進(jìn)行序列的比對和翻譯，將推導(dǎo)的氨基酸與已公布的其他物種EF1a先利用生物分析軟件CLUSTALX進(jìn)行多序列比對，比對結(jié)果經(jīng)Bioedit剪切對齊后用MEGA5.03進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的建立。

1.2.4 香樟延伸因子CcEF1a基因低溫脅迫下的熒光定量表達(dá)分析

取約200株長勢一致的香樟組培苗置于人工氣候箱進(jìn)行4 ℃低溫處理，分別于0、0.5、1、2、4、6、12、24、48和72 h取葉片作為實(shí)驗(yàn)材料，利用北京艾德萊EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒提取香樟葉片總RNA，以TaKaRa公司的PrimeScriptII 1st strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行cDNA第一鏈的反轉(zhuǎn)錄，起始RNA模板量為2 μg，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍作為RT-qPCR反應(yīng)模板。根據(jù)所獲得香樟CcEF1a基因的核苷酸序列，按照熒光定量PCR引物的要求設(shè)計(jì)一對RT-qPCR引物EF1a-RTF和EF1a-RTR，其序列分別為：EF1a-RTF，TCCAAGGCACGGTATGAT；EF1a-RTR，CCTGAAGAGGGAGACGAA。擴(kuò)增片段大小為232 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶單一、不含引物二聚體，并且測序確保擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。RT-qPCR反應(yīng)采用SYBR Green I法，利用羅氏（Roche）公司的FastStart Universal SYBR Green Master（ROX），在伯樂（BIO RAD）CFX96 實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系（10 μL）：ddH2O 3.4 μL，2×Power Taq PCR MasterMix 5 μL，EF1a-RTF 和 EF1a-RTR（10 μmol） 各 0.3 μL，cDNA 1 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40次循環(huán)；溶解曲線在65～95℃之間，每0.05 s升高0.5 ℃。實(shí)驗(yàn)每一樣品重復(fù)3次，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行重復(fù)。基因表達(dá)分析軟件為Bio-Rad CFX manager 2.0，依據(jù)各樣品的CT值，利用Excell 2007和BestKeeper進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。BestKeeper程序依據(jù)各個(gè)樣品的CT值用Excell軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差SD，SD值越小，基因的穩(wěn)定性越好，若SD＞1，則認(rèn)為該基因不穩(wěn)定[19-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取及檢測

以香樟葉片為材料提取葉片總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果（見圖1A）顯示，28 S和18 S條帶清晰，未見拖帶現(xiàn)象，表明實(shí)驗(yàn)提取的RNA完整性良好，可以用于反轉(zhuǎn)錄。

2.2 香樟延伸因子CcEF1a基因片段的克隆

2.2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

根據(jù)TaKaRa公司PrimeScriptII 1st strand cDNA Synthesis Kit的操作說明，將2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，作為PCR反應(yīng)模板，以EF1aF、EF1aR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1 000 bp與2 000 bp之間有一條亮帶（見圖1B），與預(yù)期片段大小一致，可能是香樟EF1a基因片段，進(jìn)一步測序鑒定。

圖1 香樟葉片總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(A)和香樟EF1a基因PCR擴(kuò)增結(jié)果(B)Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA extracted from the C. camphora leaves and ampli fication results of CcEF1a by PCR

2.2.2 陽性克隆的鑒定

將回收純化的目的片段連接到克隆載體pMD19-T上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑選10株抗性菌進(jìn)行菌落PCR檢測，菌落PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示陽性菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物比目的基因片段PCR產(chǎn)物稍大（見圖2），挑取保存在平板上的相應(yīng)陽性菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并測序。

2.3 香樟延伸因子CcEF1a基因的生物信息學(xué)分析

測序結(jié)果經(jīng)分析并去除兩端引物序列，獲得了1個(gè)大小為1297 bp的cDNA序列片段，編碼432個(gè)氨基酸（見圖3）。將獲得片段的核苷酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列在NCBI中進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果顯示該基因片段的核苷酸序列與BLAST結(jié)果的其它物種EF1a基因的核苷酸序列的相似度均在80%以上，其中與梅花EF1a相似性最高，相似度為87%；氨基酸序列的相似性均在96%以上，與大戟科木薯、蓖麻、小油桐以及棕櫚科的油棕的EF1a氨基酸序列的相似度均達(dá)到98%。推測本實(shí)驗(yàn)所獲得的基因片段是香樟EF1a基因片段，命名為CcEF1a，提交Genbank，登錄號為KM086740。

圖2 部分菌落PCR篩選陽性重組子結(jié)果Fig.2 Positive recombinant screened from partial colony by PCR

將得到的香樟EF1a基因片段所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列NCBI中已經(jīng)登錄的其它物種EF1a的氨基酸序列利用DNAMAN進(jìn)行多序列比對，結(jié)果（見圖4）顯示，EF1a基因所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列相當(dāng)保守，進(jìn)一步證明延伸因子EF1a是高度保守的蛋白質(zhì)。

此外，利用MEGA5.03軟件對香樟EF1a推導(dǎo)的氨基酸序列與橡膠樹、毛果楊、油棕、煙草等14個(gè)物種的EF1a蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果（見圖5）表明，香樟與大戟科木薯、橡膠以及棕櫚科油棕聚為一支，表明它們在氨基酸水平上親緣關(guān)系較近；單子葉植物玉米與水稻聚為一支，表明它們起源相同；此外，單子葉植物油棕與雙子葉植物橡膠樹聚為一支，說明EF1a基因在單子葉植物和雙子葉植物中的進(jìn)化過程相互交叉進(jìn)行，這也充分說明EF1a基因在不同物種行使相近的功能。通過一系列生物信息學(xué)分析，本研究所獲得基因片段應(yīng)為香樟延伸因子基因（CcEF1a）。

2.4 CcEF1a基因在低溫脅迫下香樟葉片中的熒光定量表達(dá)分析

采用RT-qPCR技術(shù)進(jìn)行CcEF1a基因在低溫脅迫下香樟葉片中的表達(dá)分析，根據(jù)各個(gè)樣品的CT值研究該基因的表達(dá)量及穩(wěn)定性，其中基因的表達(dá)量與CT值呈反比例關(guān)系[21]。CT值是指反應(yīng)體系累計(jì)足夠的擴(kuò)增產(chǎn)物，至可以產(chǎn)生可檢測的熒光信號時(shí)的循環(huán)數(shù)，主要由擴(kuò)增反應(yīng)體系中模板的初始濃度決定，如果初始模板濃度低，需要較多的擴(kuò)增循環(huán)才能產(chǎn)生足夠的熒光信號；反之，只需要較少的擴(kuò)增循環(huán)就可以累計(jì)足夠的產(chǎn)物，從而產(chǎn)生高過背景的熒光信號。根據(jù)各個(gè)樣品的CT平均值，利用Excell 2007作圖，結(jié)果見圖6。由圖6可以看出，各個(gè)樣品的CT平均值雖然有一定起伏，但差異并不明顯；BestKeeper程序依據(jù)樣品CT值進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果顯示，各個(gè)樣品的CT平均值為21.95～22.98，所得標(biāo)準(zhǔn)偏差SD為0.23，遠(yuǎn)小于1。綜上可以得出，CcEF1a基因在低溫脅迫下表達(dá)量基本恒定，可以作為實(shí)時(shí)定量PCR分析的內(nèi)參基因。

圖3 CcEF1a基因片段核苷酸序列與推導(dǎo)的對應(yīng)氨基酸序列Fig.3 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequenceof CcEF1a gene fragment from C. camphora

圖4 香樟與其他植物EF1a氨基酸序列的多序列比對Fig.4 Multiple alignment of EF1a proteins from C. camphora and other plants

3 討論與結(jié)論

真核生物延伸因子EF1a（elongation factor 1 alpha）與原核生物的EF-Tu 類似，是翻譯延伸因子（elongation factor，EF）家族當(dāng)中一個(gè)非常重要的成員，主要在蛋白質(zhì)翻譯過程中將氨酰tRNA 運(yùn)輸?shù)胶颂求wA 位點(diǎn)，參與肽鍵的形成及多肽鏈的延伸反應(yīng)，屬于G 蛋白家族，并且它的基因序列及表達(dá)調(diào)控在真核生物中高度保守[22]。由于對樟科植物的相關(guān)研究十分有限，本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時(shí)，并未能找到樟科植物EF1a基因的核苷酸序列；而根據(jù)木本植物楊樹、李樹和薔薇的EF1a基因的核苷酸序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)的1對兼并引物，以香樟cDNA為模板擴(kuò)增即可獲得約1 300 bp的特異條帶，充分證明其核苷酸序列是高度保守的。將該基因片段推導(dǎo)的氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLASTP分析，發(fā)現(xiàn)與大戟科植物的EF1a（木薯，O49169.1）氨基酸序列相似度最高，達(dá)98%。EF1a蛋白的高保守性表明EF1a基因?qū)Ω鱾€(gè)物種生存有著相當(dāng)重要的意義并發(fā)揮相似的作用。EF1a基因由于的表達(dá)量高并且相對穩(wěn)定，因而經(jīng)常在基因的表達(dá)分析中被用作內(nèi)參基因。RT-qPCR的準(zhǔn)確性很大程度上取決于定量分析方法以及內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性[23]，因此一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因?qū)τ赗T-qPCR必不可少。大量研究者報(bào)道，同一種內(nèi)參基因，在不同實(shí)驗(yàn)條件下或不同物種中，甚至同一有機(jī)體的不同組織部位的表達(dá)模式也并非是一成不變的[24-25]，因此，必須對內(nèi)參基因在相應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行評估。

圖5 香樟CcEF1a基因推導(dǎo)的氨基酸序列與其他植物EF1a氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogentic tree based on CcEF1a amino acid sequences from C. camphora and other plants

圖6 CcEF1a基因在低溫處理下的香樟葉片中的表達(dá)量Fig.6 Expression levels of CcEF1a gene in C. camphora under low temperature treaments

本實(shí)驗(yàn)通過同源克隆的方法結(jié)合RT-PCR技術(shù)從香樟葉片cDNA中克隆到了香樟EF1a基因的cDNA片段，利用生物信息學(xué)手段分析所推導(dǎo)氨基酸的序列特征，結(jié)果表明CcEF1a含有EF1a的典型結(jié)構(gòu)域，屬于Ras-like-GTPase 超家族。初步分析所獲得片段與其他物種EF1a基因的同源性及進(jìn)化關(guān)系，表明EF1a基因在分子進(jìn)化水平上較為保守，也證明本實(shí)驗(yàn)獲得的基因片段確實(shí)為香樟EF1a基因。本研究雖然并未克隆到香樟EF1a完整的cDNA全長，但是并不影響其作為內(nèi)參基因的使用，通過設(shè)計(jì)RT-qPCR引物，利用RT-qPCR技術(shù)對其在低溫處理下香樟葉片中的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，CcEF1a基因在低溫脅迫下表達(dá)量穩(wěn)定，期望能成為香樟相關(guān)基因表達(dá)研究的內(nèi)參基因。

[1]杜 麗, 龐振凌, 周 索, 等. 香樟胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系建立[J].林業(yè)科學(xué), 2008, 44(4)： 54-59.

[2]廖建軍, 李 晟, 楊喜生, 等. 城市園林樹種規(guī)劃探討—以衡陽為例[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 29(3)： 162-166.

[3]周 靜, 張 煒, 李大明, 等. 藍(lán)花楹JaCBF1轉(zhuǎn)錄因子片段的序列分析及耐寒性功能驗(yàn)證[J]. 林業(yè)科學(xué)研究, 2013, 26(4)：414-419.

[4]陳 新, 王貴禧, 梁麗松, 等. 平榛冷適應(yīng)相關(guān)基因CBF的克隆及時(shí)空表達(dá)特性分析[J]. 林業(yè)科學(xué), 2012, 48(1)： 167-172.

[5]王京京, 童再康, 黃程前, 等. 巨桉EgrCBF1和EgrCBF2基因的克隆和脅迫響應(yīng)表達(dá)分析[J]. 林業(yè)科學(xué), 2012, 48(10)：41-48.

[6]Guo C, Zhang J Q, Peng T,et al.Structural and expression analyses of three PmCBFs fromPrunus mume[J]. Biologia Plantarum, 2014, 58 (2)： 247-255.

[7]Selim M, Legay S, Berkelmann-Lo¨hnertz B,et al. Identi fication of suitable reference genes for real-time RT-PCR normalization in the grapevine-downy mildew pathosystem[J]. Plant Cell Rep.,2012, 31： 205-216.

[8]李 高, 楊 杞, 張 燁, 等. 檸條錦雞兒肉桂酰輔酶A 還原酶基因克隆和分析[J]. 中國生物工程雜志, 2014, 34(1)：50-56.

[9]Maksup S, Supaibulwatana K, Selvaraj G. High-quality reference genes for quantifying the transcriptional responses ofOryza sativa(ssp. indica and japonica) to abiotic stress conditions[J].Chin. Sci. Bull, 2013, 58： 1919-1930.

[10]王彥杰, 董 麗, 張 超, 等. 牡丹實(shí)時(shí)定量PCR分析中內(nèi)參基因的選擇[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2012, 20(5)： 521-528.

[11]Lopez-Pardo R, Ruiz de Galarreta J I, Ritter E. Selection of housekeeping genes for qRT-PCR analysis in potato tubers under cold stress[J]. Mol. Breeding, 2013,31： 39-45.

[12]蔣曉梅, 張新全, 嚴(yán)海東, 等.柳枝稷根組織實(shí)時(shí)定量PCR分析中內(nèi)參基因的選擇[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2014, 22(1)：55-63.

[13]Lin L Y, Han X J, Chen Y C,et al. Identi fication of appropriate reference genes for normalizing transcript expression by quantitative real-time PCR inLitsea cubeba[J]. Mol. Genet.Genomics, 2013, 288： 727-737.

[14]覃迎姿, 黃先益, 葉興枝, 等. 植物延伸因子eEf1A研究進(jìn)展[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 40 (5)： 472-477.

[15]Wan H, Zhao Z, Qian C,et al. Selection of appropriate reference genes for gene expression studies by quan-titative real-time polymerase chain reaction in cucumber[J]. Anal. Biochem., 2010,399： 257-261.

[16]Mallona I, Lischewski S, Weiss J,et al. Validation of reference genes for quantitative real-time PCR during leaf and flower development inPetunia hybrida[J]. BMC Plant Biol., 2010, 10：4-14.

[17]Qi J, Yu S, Zhang F,et al. Reference gene selection for real-time quantitative polymerase chain reaction of mRNA transcript levels in Chinese cabbage (Brassica rapassp.pekinensis) [J]. Plant Mol. Biol. Rep., 2010, 28： 597-604.

[18]Kudo K, Oi T, Uno Y. Functional characterization and expression pro filing of a DREB2-type gene from lettuce (Lactuca sativa) [J].Plant Cell Tiss Organ Cult., 2014, 116(1)： 97-109.

[19]Mehta R, Birerdinc A, Hossain N,et al.Validation of endogenous reference genes for qRTPCR analysis of human visceral adipose samples[J].BMC Mol. Biol., 2010, 11(39)：1471-2199.

[20]蘇曉娟,樊保國,袁麗釵,等. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析中毛果楊內(nèi)參基因的篩選和驗(yàn)證[J]. 植物學(xué)報(bào),2013,48(5)：507-518.

[21]肖 政, 李紀(jì)元, 范正琪, 等. 荔波連蕊茶肌動(dòng)蛋白基因全長cDNA的克隆及表達(dá)分析[J]. 林業(yè)科學(xué)研究, 2014, 27(3)：374-380.

[22]周 峰, 劉 燕, 馬永貴, 等. 真核翻譯延伸因子1A蛋白家族功能位點(diǎn)的進(jìn)化蹤跡分析[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2013, 29( 8)： 773-782.

[23]Kundu A, Patel A, Pal A. Defining reference genes for qPCR normalization to study biotic and abiotic stress responses in Vigna mungo[J]. Plant Cell Rep., 2013, 32：1647-1658.

[24]Li Q, Fan C M, Zhang X M,et al. Validation of reference genes for real-time quantitative PCR normalization in soybean developmental and germinating seeds [J]. Plant Cell Rep., 2012,31：1789-1798.

[25]Chaouachi M, Alaya A, Ali I H,et al. Development of real-time PCR method for the detection and the quantification of a new endogenous reference gene in sugar beet “Beta vulgarisL.”;GMO application[J]. Plant Cell Rep., 2013, 32：117-128.

Cloning and expression analysis ofEF1agene fragment of elongation factor fromCinnamomum camphora

ZHANG Li-wei, LI Yong-peng, YAO Yao, LIANG You, DU Li
(School of Life Science and Technology, Nangyang Normal University, Nanyang 473000, Henan, China)

A cDNA fragment encoding a putative protein of elongat ion factor 1 alpha (EF1a) was firstly isolated fromCinnamomum camphoraby using homology cloning, A pair of degenerate primers was designed based on the conserved sequences of otherEF1agenes from the different species from GenBank, and a fragment of 1 297 bp was obtained through Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) techniques. The results of homologous alignment show thatCcEF1ashared over 80% nucleotide sequence identity and over 96% amino acid sequence identity withEF1agenes in other plants that had been submitted to GenBank. The cDNA fragment sequence was namedCcEF1aand registered in GenBank with accession number KM086740. According to the results of realtime quantitative PCR, the mRNA level of CcEF1a in leaves under chilling stress was identical. It could be used as an interrnal control in real-time quantitative PCR.

Cinnamomum camphora; elongation factor;EF1agene fragment; cloning; expression analysis

S792.23；Q786

A

1673-923X(2015)05-0122-07

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.05.021

2014-11-05

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31100511）；河南省高校青年骨干教師計(jì)劃項(xiàng)目（2010GGJS-161）；南陽師范學(xué)院博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目（nynu200746）；2015年度研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（2015CX008）

張力維，碩士研究生

杜 麗，副教授，博士；E-mail：dldldlucky@163.com

張力維,李勇鵬,姚 瑤,等. 香樟延伸因子EF1a基因片段的克隆及表達(dá)分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2015,35(5)：122-128.

[本文編校：謝榮秀]