異丙腎上腺素對(duì)乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞自動(dòng)節(jié)律和鈉鈣交換電流的影響

項(xiàng)國(guó)劍，張建成，陳 茜，魏國(guó)良，魏芝雄，李 泱

2.福建省立醫(yī)院 心內(nèi)科，福州 350001；

3.解放軍總醫(yī)院 老年心血管病研究所，北京 100853

心臟的正常生理活動(dòng)由竇房結(jié)細(xì)胞的自發(fā)性搏動(dòng)調(diào)控，細(xì)胞膜上各種離子通道的復(fù)雜活動(dòng)是構(gòu)成竇房結(jié)細(xì)胞電生理機(jī)制的基礎(chǔ)[1－3]。關(guān)于竇房結(jié)細(xì)胞在心臟起搏活動(dòng)中離子通道的活動(dòng)機(jī)制是近年來的研究熱點(diǎn)，但目前對(duì)于乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞的膜片鉗研究在國(guó)內(nèi)只見于個(gè)別學(xué)者報(bào)道[4]。目前認(rèn)為，心臟的起搏活動(dòng)是竇房結(jié)的兩種機(jī)制共同作用的結(jié)果，即“膜鐘（membrane voltage clock）”和“鈣鐘（calcium clock）”[5]。膜鐘主要由起搏電流組成，它可引起竇房結(jié)細(xì)胞膜電位的變化，引發(fā)電壓依賴性鈣通道開放，使Ca2＋內(nèi)流，造成細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度增加，觸發(fā)肌漿網(wǎng)大量釋放Ca2＋，使細(xì)胞內(nèi)Ca2＋瞬間增高稱為鈣瞬變，同時(shí)激活鈉鈣交換體（sodium－calcium exchanger，NCX）正向轉(zhuǎn)運(yùn)模式（3個(gè) Na＋進(jìn)入細(xì)胞，1個(gè) Ca2＋出 細(xì)胞）產(chǎn) 生 NCX 電 流（Na＋／Ca2＋current，INCX）。INCX是起搏電流產(chǎn)生和維持的一個(gè)重要組成，其在舒張末期產(chǎn)生內(nèi)向電流，可引發(fā)動(dòng)作電位[6]。INCX在竇房結(jié)起搏中的作用雖然受到關(guān)注，但該電流對(duì)竇房結(jié)節(jié)律的影響尚不清楚，另外異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）可顯著增加細(xì)胞內(nèi)Ca2＋釋放及鈣火花頻率，激發(fā)竇房結(jié)細(xì)胞活動(dòng)，但I(xiàn)SO對(duì)NCX活動(dòng)影響的研究還存在矛盾[7－8]。因此，本研究采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄了竇房結(jié)細(xì)胞自發(fā)性動(dòng)作電位（action potentials，AP）和INCX，觀察ISO對(duì)其影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 新生24h內(nèi)Wistar大鼠乳鼠，雌雄不拘，SPF級(jí)，[斯貝福（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2014－0002]。

1.2 試劑 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、PBS磷酸鹽緩沖液（美國(guó)Thermo公司）；FBS胎牛血清（美國(guó)Invitrogen公司）；胰蛋白酶1∶250、氯化鎳（美國(guó)Sigma公司）；HEPES（美國(guó)Amresco公司）；鹽酸ISO（美國(guó)Sigma公司）。

1.3 鈉 鈣 交 換 體 電 流 的 細(xì) 胞 外 液 （mmol／L）：NaCl 140；MgCl21.0；CaCl21.0；KCl 4；HEPES 10；Glucose 5；pH值用NaOH調(diào)至7.4。記錄鈉鈣交換體的電極內(nèi)液（mmol／L）：KCl 130；MgCl21.0；EGTA 5；HEPES 10；Glucose 10；Na2ATP 5。pH值用KOH 調(diào)至7.2。

1.4 竇房結(jié)細(xì)胞急性分離與培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[9]。取乳鼠12只，仰臥位固定四肢，沿胸骨右緣剪開并去除胸前壁，暴露心臟，置于解剖顯微鏡下分離心包膜，輕撥移右心耳，看清上腔靜脈，于界嵴中部靜脈竇側(cè)、上腔靜脈根部取約1.0mm×1.0mm×1.0mm的組織塊，立即置于預(yù)冷的不含血清的DMEM培養(yǎng)基中，沖洗2次。將所取下的組織塊剪碎成0.2～0.6mm3乳糜狀，加入30～50倍組織塊體積的0.08%胰酶，輕柔吹打0.5min，靜置沉淀后棄上清液，加入同體積的0.08%胰酶，置于37℃水浴中輕輕振蕩3～5min，再次吹打0.5min，沉淀后吸取上清液，用等體積的含15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液終止消化，重復(fù)消化3～5次至基本消化成單細(xì)胞為止。將細(xì)胞懸液用400目金屬濾網(wǎng)過濾后，940r／min離心7min，棄上清液。將離心后的細(xì)胞用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸，接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，后置培養(yǎng)皿于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵箱中培養(yǎng)90min，采用差速貼壁技術(shù)去除成纖維細(xì)胞，分離得到較純化的竇房結(jié)細(xì)胞，并分裝于培養(yǎng)皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，每天換液1次。24h后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并以手按計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞收縮頻率。

1.5 膜片鉗形成及參數(shù) 將Axon－700B膜片鉗放大器（美國(guó) MDC公司）與計(jì)算機(jī)連接。應(yīng)用Digidata 1440A數(shù)模轉(zhuǎn)換器（美國(guó)MDC公司）采集刺激信號(hào)及電壓輸入信號(hào)，此過程均由pCLAMP10.2軟件控制。GG－17玻璃毛坯經(jīng)pp－83微電極拉制儀（日本NARISHIGE公司）拉制成入液電阻為2.0～5.5MΩ的電極。調(diào)節(jié)三維微操縱器進(jìn)行細(xì)胞封接，使封接電阻達(dá)1GΩ以上，采用脈沖式負(fù)壓抽吸法吸破細(xì)胞膜形成全細(xì)胞記錄模式。利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄方法，在電流鉗模式下記錄AP，在電壓鉗模式下記錄電流。測(cè)定細(xì)胞膜電容時(shí)，施以0.4V／s的 斜 坡 刺 激。電 流 值I以 電 流 密 度（pA／pF）表示以消除細(xì)胞間的誤差。信號(hào)經(jīng)截止頻率為1kHz的四階貝塞爾低通濾波器濾波，采樣率為5kHz。為消除膜電容的充放電影響，串聯(lián)電阻補(bǔ)償90%～95%以消除電壓偏差，液接電位補(bǔ)償校正至小于2mV，慢電容補(bǔ)償約為85%～90%。細(xì)胞膜電容計(jì)算方程：

1.6 干擾電流的排除 于細(xì)胞外液加入BaCl2200μmol／L阻斷IK1，多非利特（Dofetilide，Dof）5nmol／L阻 斷IKr，CdCl2100μmol／L 阻 斷ICa，L，TTX 100μmol／L阻斷INa。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)處理采用pCLAMP 9.2處理，采用Spss 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以±s表示。多組間數(shù)據(jù)比較用ANOVA方差分析，組間兩兩比較用SNK－q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況 分離培養(yǎng)后的竇房結(jié)細(xì)胞呈大小不等、圓形、清亮的單細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，4h后開始貼壁生長(zhǎng)，后胞體逐漸增大，約17h后可見散在細(xì)胞開始搏動(dòng)，48h后貼壁的搏動(dòng)細(xì)胞逐漸增多，偶見融合成片的細(xì)胞進(jìn)行同步搏動(dòng)。于倒置顯微鏡下，隨機(jī)選取10個(gè)視野，觀察鏡下細(xì)胞形態(tài)，在分離培養(yǎng)的乳鼠竇房結(jié)中可見梭形、三角形、多邊形等3種形態(tài)的細(xì)胞，計(jì)算各形態(tài)細(xì)胞所占比例，再取平均值，即可得到該種形狀細(xì)胞所占比例。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，梭形細(xì)胞比例最高，達(dá)（56.2±3.0）%，三 角 形 及 多 邊 形 細(xì) 胞 分 別 為（28.2±3.0）%和（15.6±2.1）%（圖1）。

圖1 乳鼠竇房結(jié)分離培養(yǎng)后3種細(xì)胞形態(tài)（ ×100）Fig 1 Three cellular types after disassociating and culturing sino－atrial node in newborn rats（ ×100）

2.2 搏動(dòng)頻率觀察 分別選取梭形細(xì)胞、三角形細(xì)胞和多邊形細(xì)胞各10個(gè)觀察搏動(dòng)頻率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，梭形細(xì)胞的搏動(dòng)頻率為（147.9±9.9）min－1，三角形細(xì)胞的搏動(dòng)頻率為（56.5±7.8）min－1，多邊形細(xì)胞搏動(dòng)頻率為（6.3±1.8）min－1。梭形細(xì)胞較其他兩形細(xì)胞快，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖2）。

圖2 乳鼠竇房結(jié)3種細(xì)胞搏動(dòng)次數(shù)Fig 2 The beating rates of three kinds of cells in newborn rats’sino－atrial node.

2.3 自發(fā)性AP及ISO的作用 以ISO用藥前的細(xì)胞AP次數(shù)為對(duì)照組，在電流鉗模式下記錄梭形細(xì)胞AP。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在無任何電流刺激下，梭形細(xì)胞可記錄到自發(fā)性AP；于細(xì)胞外加入1.0μmol／L ISO后，細(xì)胞AP的發(fā)生頻率明顯增加，從（147.9±9.9）min－1增 加 至 （278±11.2）min－1（圖3）。

2.4 竇房結(jié)細(xì)胞INCX電流 應(yīng)用電壓鉗模式研究通道電流密度，鉗制電位為－60mV，預(yù)先給予＋80mV，500ms的方波刺激，緊接著以斜坡電壓脈沖從＋80mV以90V／s的速度去極化至－120mV，此后恢復(fù)到－60mV，記錄到在去極化電壓下外向電流，而超極化電壓下內(nèi)向電流，應(yīng)用5mmol／L NiCl2阻斷該電流[10]，記錄用藥前、后的電流值，并將原始電流減去Ni2＋作用后剩余電流值，即為INCX（圖4）。

圖3 ISO對(duì)乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞自發(fā)性動(dòng)作電位的影響Fig 3 The effect of ISO on spontaneous action potential in newborn rats’sino－atrial node cells.

圖4 乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞INCX電流Fig 4 INCXin newborn rats’sino－atrial node cells

2.5 ISO對(duì)INCX電流的作用 以用藥前INCX為空白對(duì)照組，于細(xì)胞外加入1.0μmol／L ISO。結(jié)果顯示，ISO可使＋80mV起始時(shí)外向INCX密度從（0.52±0.03）pA／pF增加至（0.72±0.04）pA／pF（n＝10，P＜0.05），平 均 增 加 約 36.7%；而－120mV時(shí)內(nèi)向電流從（－3.26±0.02）pA／pF增加至（－7.81±0.06）pA／pF（n＝10，P＜0.01，圖5）。

2.6 ISO對(duì)INCX影響的電壓依賴性和濃度依賴性

將電流密度差值與相應(yīng)電位作圖，即得INCX電流的I－V曲線。以用藥前INCX為空白對(duì)照組相對(duì)比，在負(fù)于－20mV時(shí)，ISO可使INCX內(nèi)向電流顯著增加，在大于0時(shí)，ISO可使INCX外向電流升高明顯（圖6A）。于細(xì)胞外液分別加入0.1，0.5，1.0，5.0，10.0μmol／L ISO，將用藥前INCX電流密度作為標(biāo)準(zhǔn)化基線值，將其他ISO不同濃度作用后各電流密度與之比較，取相對(duì)值，可見INCX電流隨ISO呈現(xiàn)濃度增加而依賴性升高（圖6B）。

圖5 ISO對(duì)乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞INCX電流的影響Fig 5 The increasing effect of ISO on INCXin newborn rats’sino－atrial node cells.

圖6 ISO對(duì)INCX影響的電壓和濃度依賴性Fig 6 The voltage－and concentration－dependent fashion of ISO on INCX

3 討 論

近年來，以Ca2＋釋放為特征的“鈣鐘”在竇房結(jié)起搏活動(dòng)中的作用成為研究熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外有不少關(guān)于“膜鐘”和“鈣鐘”的發(fā)生和作用機(jī)制的研究證據(jù)表明，“膜鐘”（膜上離子通道周期激活和失活引起）和“鈣鐘”（節(jié)律性肌漿網(wǎng)Ca2＋釋放引起）共同參與調(diào)節(jié)竇房結(jié)的自律性[11]。文獻(xiàn)顯示，在胚胎干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞中，鈉鈣交換體在起搏活動(dòng)中起著重要的作用[12]。2009年，Maltsev等在計(jì)算機(jī)模擬兔竇房結(jié)模型中，發(fā)現(xiàn)有鈉鈣交換體電流的參與，能使起搏活動(dòng)更加穩(wěn)定，且不易誘發(fā)節(jié)律失?；螂娀顒?dòng)終止[13]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞上存在較大的INCX電流，該電流分為內(nèi)向和外向二部分，在不同的刺激電壓下其大小不同：在更正的電壓下其外向電流更大，而在更負(fù)的電壓下其內(nèi)向電流增加明顯。該電流的變化將直接影響竇房結(jié)細(xì)胞的自發(fā)性AP和起搏頻率，這為該電流在心臟起搏活動(dòng)中的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2006年，Lakatta等提出INCX是竇房結(jié)細(xì)胞起搏產(chǎn)生和維持的一個(gè)重要組成[14]，其在舒張末期產(chǎn)生內(nèi)向電流，最終導(dǎo)致膜AP的產(chǎn)生。Lyashkov等研究發(fā)現(xiàn)，NCX在竇房結(jié)上的數(shù)量分布多于心房及心室肌[15]。Bogdanov等發(fā)現(xiàn)，抑制細(xì)胞內(nèi)鈣釋放將限制心臟起搏細(xì)胞的自發(fā)跳動(dòng)頻率[16]。

目前，對(duì)于ISO是否能直接影響鈉鈣交換體活動(dòng)還沒有定論。有部分研究證實(shí)，β腎上腺素可以加強(qiáng) NCX 的作用[17－18]；另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，β腎上腺素受體／cAMP通路具有下調(diào)NCX的作用[19]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在ISO的作用下，INCX內(nèi)向及外向電流均顯著升高，且此作用呈電壓依賴性及濃度依賴性特征，提示β腎上腺素受體激動(dòng)可能通過調(diào)節(jié)INCX電流的大小，從而影響竇房結(jié)的自動(dòng)去極化過程和起搏頻率，同時(shí)ISO可能通過NCX產(chǎn)生正性變時(shí)作用。然而，ISO增加INCX電流是否存在頻率依賴性，以及INCX電流是否受頻率的影響還有待進(jìn)一步研究。

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