近紅外熒光染料用于腫瘤檢測的初步研究

田　迎，盧光明，鄭　玲

近紅外熒光染料用于腫瘤檢測的初步研究

田迎，盧光明，鄭玲

目的：體內(nèi)外研究新型近紅外熒光染料IR-808對腫瘤的檢測作用，并初步探索其潛在的臨床應用。方法：體外培養(yǎng)3種人腫瘤細胞（結腸癌細胞系HCT116、肺癌細胞系A549和乳腺癌細胞系MCF-7），與濃度為20 μmol/L的IR-808共孵育20 min，以正常人胚腎細胞系293T作為對照；建立乳腺癌皮下瘤動物模型，靜脈注射劑量為1 mg/kg的IR-808，24 h后觀察體內(nèi)成像效果；收集1例惡性胸水標本，分別與同等濃度的染料孵育24和48 h，觀察其熒光信號的穩(wěn)定性，并與臨床病理結果比較，判斷其檢測腫瘤細胞的效果。結果：體內(nèi)外實驗證明近紅外熒光染料IR-808只靶向腫瘤成像；與胸水共孵育后，IR-808信號穩(wěn)定，初步證實其能檢測到標本中的腫瘤細胞。結論：IR-808具有良好的靶向腫瘤成像的性能，利用此性質(zhì)可以用來檢測臨床標本中的腫瘤細胞，具有重要的應用前景。

近紅外熒光染料IR-808；腫瘤；靶向成像

0　引言

惡性腫瘤一直是威脅人類健康和生命的重大疾病。目前，設計并制備無毒、靶向性能好且性能穩(wěn)定的分子探針一直是研究的熱點，對于臨床上診斷腫瘤細胞，尤其是惡性積液腫瘤細胞尤為迫切[1-2]。臨床上常規(guī)方法主要是細胞病理診斷和臨床生化檢查。細胞病理診斷一直被認為是檢測腫瘤細胞的金標準，但是在某些形態(tài)結構相似的細胞類型，例如腫瘤細胞和間皮細胞，其檢查存在誤差性[3]。

最近，近紅外（near-infrared，NIR）吲哚花菁染料以其特殊的靶向腫瘤近紅外成像且熒光信號穩(wěn)定、無需借助化學作用等優(yōu)點受到廣泛關注[4-6]。因此，本文選取新型近紅外熒光染料IR-808，初步驗證其特殊性能，首次嘗試檢測臨床胸水中腫瘤細胞，開發(fā)其潛在的臨床價值。

1　主要材料與方法

1.1主要材料與設備

近紅外花菁染料IR-808由第三軍醫(yī)大學史春夢教授饋贈。細胞培養(yǎng)試劑均購自美國GIBCO公司，Xenogen IVIS小動物活體可見光成像系統(tǒng)購自美國Caliper公司，近紅外熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2細胞培養(yǎng)

人胚腎細胞系293 T、腫瘤細胞系結腸癌細胞系HCT116、肺癌細胞系A549以及乳腺癌細胞系MCF-7均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）細胞庫，培養(yǎng)條件參考ATCC要求，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，每48 h傳代1次。細胞制成細胞爬片后分別與20 μmol/L IR-808及4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI），DAPI孵育20 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌后，用近紅外熒光顯微鏡觀察（激發(fā)光：684～719 μm；發(fā)射光：740～950 μm）。

1.3動物模型構建

實驗動物BAIB/c—nu/nu雌性裸鼠10只購自南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學科，鼠齡6周，體質(zhì)量18 g。動物隨機分成2組，正常對照組（n=5）和皮下移植瘤組（n=5）。皮下瘤動物模型為乳腺癌動物模型，待乳腺癌細胞系MCF-7匯合度達到80%后，收集細胞，5×106個/只接種于裸鼠后背部皮下。2組動物分別尾靜脈注射0.2 ml生理鹽水和0.2 ml染料IR-808（生理鹽水稀釋，劑量為1 mg/kg）。24 h后用小動物活體可見光成像系統(tǒng)對模型小鼠進行X線掃描和近紅外熒光成像。實驗結束后解剖取組織再次進行近紅外熒光成像。

1.4胸水檢測

收集1例臨床惡性腫瘤患者胸水標本，孵育IR-808后，可見光成像系統(tǒng)在24和48h時進行觀察。分別與20 μmol/L IR-808及DAPI孵育20 min后，近紅外熒光顯微鏡觀察其靶向成像效果。

1.5病理染色

將收集的此例惡性胸水標本離心后沉淀浸泡在95%的酒精中，次日進行蘇木素與伊紅染色，進行細胞病理學分析。

2　結果

2.1近紅外熒光成像系統(tǒng)觀察IR-808對細胞的成像結果

將正常細胞系293T、結腸癌細胞系HCT116、肺癌細胞系A549及乳腺癌細胞系MCF-7與一定濃度的近紅外熒光染料IR-808及DAPI孵育，IR-808標記腫瘤細胞，DAPI主要染細胞核。近紅外熒光顯微鏡對其進行成像，不同細胞系的曝光時間及拍攝條件一致。如圖1所示，IR-808僅靶向腫瘤細胞成像，而293 T細胞不成像；且腫瘤細胞品系之間沒有明顯差異，均能有較好的近紅外成像效果。

2.2IR-808在正常小鼠及乳腺癌皮下移植瘤模型小鼠體內(nèi)的分布

將生理鹽水及IR-808分別尾靜脈注射入正常小鼠及乳腺癌移植瘤模型小鼠，24 h后觀察染料在小鼠體內(nèi)的分布情況。實驗結果發(fā)現(xiàn)IR-808逐漸靶向乳腺癌模型小鼠的腫瘤部位，周圍組織信號相比腫瘤熒光信號區(qū)域較低，而正常小鼠沒有明顯的熒光信號的聚集。解剖小鼠，取肝臟、肺、脾臟、心臟、腎臟及腫瘤重要組織器官進行成像，發(fā)現(xiàn)只有腫瘤組織有較強的熒光信號，而包括肝、腎在內(nèi)的其他組織無明顯信號。離體組織與活體成像結果基本一致。在觀察期間，小鼠活動、反應及食欲正常，體質(zhì)量未見減輕，未見明顯毒性反應（如圖2～4所示）。

圖1　正常細胞系293T、結腸癌細胞系HCT116、肺癌細胞系A 549及乳腺癌細胞系MCF-7分別孵育IR-808及DAPI的近紅外顯微鏡觀察結果

圖2　正常小鼠X線成像及生物熒光成像結果

圖3　移植瘤小鼠X線成像及生物熒光成像結果

圖4　動物模型組織近紅外成像結果

2.3IR-808對惡性胸水標本腫瘤細胞的檢測結果

收集臨床惡性胸水標本1例，與20 μmol/L IR-808及DAPI共孵育20 min，小動物活體成像系統(tǒng)檢測胸水中腫瘤細胞的熒光信號穩(wěn)定性。與IR-808共孵育后的胸水如圖5所示，它顯示出更強的熒光信號強度，沒有孵育染料的標本并沒有熒光信號產(chǎn)生；且24和48 h后其熒光信號仍然很穩(wěn)定，有利于長期檢測。近紅外熒光顯微鏡檢測胸水標本爬片結果，與DAPI染色結合，發(fā)現(xiàn)胸水中的腫瘤細胞被染上，而非腫瘤細胞沒有被染上，進一步證實此染料的特異性。細胞病理染色結果與染料孵育結果一致，此染色方法有一定的正確性，其準確率需較多病例支持并作進一步統(tǒng)計分析。

圖5　臨床胸水標本孵育IR-808后近紅外熒光信號檢測結果

3　討論

目前，生化瑞氏染色和細胞病理學診斷是臨床上檢測胸腹水中癌細胞最常用的方法。細胞病理學診斷以尋找組織碎片、細胞群、細胞團和單個細胞的形態(tài)結構及彼此關系為依據(jù)，對惡性腫瘤漿膜腔積液中癌細胞作出早期的診斷，為進一步治療提供重要參考。但是針對某些形態(tài)結構極其相似的細胞如不典型增生細胞、組織修復細胞和某些良性改變細胞會造成假陽性診斷，還有不典型組織修復細胞，常常出現(xiàn)大核仁、多核仁，偶爾見到核分裂相，其與低分化癌或腺癌鑒別困難，往往誤診或不能確診。此外，對于某些不明原因引起的胸腹腔積液也不能作出準確的判斷[7-8]。

NIR熒光成像具有分辨率較高、實時動態(tài)、活體無創(chuàng)等優(yōu)點，是最具臨床轉(zhuǎn)化潛力的光學成像技術，其近紅外光譜范圍為700～1 000 μm，穿透組織距離可高達數(shù)厘米，并且不受生物體自發(fā)熒光的干擾，進而提高了成像的靈敏度和準確性[9]。目前，NIR熒光成像研究的熱點是分子探針的開發(fā)和制備，其中無機熒光分子如量子點（quantum dots，QDs）及有機熒光染料吲哚類菁染料如ICG、Cy3、Cy5應用最為廣泛[10]。但是這些熒光材料本身不具有腫瘤靶向識別能力，需通過化學連接的方法結合某些具有腫瘤靶向識別作用的生物分子，如短肽、RNA或DNA、蛋白質(zhì)和抗體等，制備多功能分子探針。潛在的化學合成作用可能會改變某些近紅外染料或腫瘤配體的結構，影響其成像及靶向性能；此外，探針的表面修飾和制備費用昂貴，攜帶的重金屬成分具有潛在毒性，因此篩選能直接靶向腫瘤細胞的小分子熒光化合物迫在眉睫[11]。

最近發(fā)現(xiàn)某些天然NIR熒光染料如IR-780，無需借助化學作用，能直接靶向腫瘤近紅外成像。在細胞水平、腫瘤皮下瘤動物模型和腫瘤轉(zhuǎn)基因動物模型等方面，這一特性均得到驗證[12]。研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織熒光信號比較，IR-780在腫瘤組織中的熒光信號強度可提高20倍，傳統(tǒng)生物發(fā)光信號標準界定熒光信號比值達到2.5即具有腫瘤主動靶向作用，且在腫瘤組織中可穩(wěn)定存在2周以上，因此此類染料具有較強的熒光信號強度，適合體內(nèi)外長期示蹤、重復成像[13]。此外，IR-780在體內(nèi)代謝較為穩(wěn)定，能通過循環(huán)系統(tǒng)代謝排出體外，生物相容性好，未見明顯的毒副作用。但目前其作用機制還不是很清楚，此類染料屬于親脂性陽離子染料，而腫瘤細胞中線粒體具有較高的膜電位，染料會選擇性地聚集在活的腫瘤細胞線粒體內(nèi)，具體作用機制還需進一步探索[14-15]。

IR-808在IR-780化學結構的基礎上進行了改進，增加了親水性基團，無需有機溶劑助溶即可在水中溶解，且性能沒有改變。我們將IR-808分別與正常細胞和腫瘤細胞共孵育，近紅外熒光成像發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞有強熒光信號，而正常細胞無明顯信號；在正常小鼠、人乳腺癌動物模型體內(nèi)也觀察到IR-808靶向腫瘤近紅外熒光成像的性能，染料尾靜脈注射24 h后開始靶向腫瘤成像，且信號在24及48 h仍然很穩(wěn)定；解剖發(fā)現(xiàn)僅腫瘤組織有信號，其他重要組織器官無信號，得到了較好的預期結果?；谏鲜鲅芯砍晒?，我們推測IR-808也能與胸水中癌細胞靶向結合，用靈敏性、特異性更高的近紅外成像方法即可檢出。我們收集臨床上1例惡性胸水標本，孵育染料IR-808，發(fā)現(xiàn)其能檢測到標本中的腫瘤細胞，并結合病理診斷驗證其準確性。近紅外花青染料IR-808有可能成為檢測腫瘤發(fā)生的新指標，為惡性腫瘤患者胸水甚至其他體液中腫瘤細胞的診斷提供一種新方法。

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（收稿：2015-02-03修回：2015-05-12）

Preliminary research on tumor detection by new near-infrared fluorescence dye

TIAN Ying,LU Guang-ming,ZHENG Ling
（Department of Medical Imaging,Nanjing General Hospital of Nanjing Military Area Command,Nanjing 210002,China）

Objective To explore IR-808 near-infrared fluorescence dye for its in vivo and in vitro application to tumor detection and other clinical application.Methods Human malignant cell lines(colon cancer cell line HCT116,lung cancer cell line A549 and breast cancer cell line MCF-7)were incubated with IR-808 with a concentration of 20 μmol/L for 20 min,and human normal cells embryonic kidney cells(293T)were used as control.The subcutaneous tumor xenografts models were established by bearing human breast cancer cells,the imaging effect was observed 24 h after i.v injection of IR-808 at the dose of 1 mg/kg.One malignant pleuroperitoneal effusion sample was collected and incubated with IR-808 at the same concentration 24 and 48 h after,and then the stability of fluorescence signal and the tumor imaging effect were detected subsequently.Results The targeted imaging performance to cancer cells using IR-808 was confirmed in vitro and in vivo,and the fluorescence signal was very stable.Cancer cells in clinical effusion incubation with IR-808 were also detected.Conclusion IR-808 exhibits the property of tumor targeted imaging,which could be further used to detect tumor cells in clinical samples.So IR-808 will have great potential application in the future.[Chinese Medical Equipment Journal，2015，36（10）：24-26，29]

near-infrared fluorescence dye IR-808;tumor;targeting imaging

[中國圖書資料分類號]R318；R730.4A

1003-8868（2015）10-0024-04

10.7687/J.ISSN1003-8868.2015.10.024

田迎（1983—），女，技師，主要從事分子影像與分子病理學方面的研究工作，E-mail：ty52111@sina.com。

210002南京，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院醫(yī)學影像科（田迎，盧光明，鄭玲）

鄭玲，E-mail：cjr.zhengling@vip.163.com