口腔血管瘤組織中TIP30／CC3基因的表達(dá)及意義

陳忠輝

（新疆兵團(tuán)第五師八十六團(tuán)南區(qū)醫(yī)院，博樂833414）

血管瘤是由血管形成異常而引起的疾病。50%以上發(fā)生于頭頸部?？谇活M面血管瘤是頜面外科常見的一種良性血管腫瘤，雖然大多數(shù)血管瘤能自發(fā)消退，但是一些血管瘤病變可嚴(yán)重?fù)p壞正常組織，并產(chǎn)生并發(fā)癥［1］，往往給患者及其家人帶來極大痛苦。但關(guān)于血管瘤的發(fā)病機(jī)制，目前還未明了，這對于血管瘤的臨床治療也是目前急待解決的關(guān)鍵問題。

TIP30（Tat interacting protein 30）基因是新近發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制基因，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移侵襲，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤血管的生成。它在多種腫瘤組織中的表達(dá)明顯減少，如黑色素瘤、胃癌、惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤、乳腺癌和肝細(xì)胞癌等，序列分析發(fā)現(xiàn)TIP30蛋白與腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因CC3基因?yàn)橥坏鞍?。近年來的研究表明，TIP30參與細(xì)胞調(diào)控，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［2］、抑制腫瘤新生血管生成［3］以及抑制骨橋蛋白［4］等，從而抑制腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移。表明TIP30／CC3基因的表達(dá)失調(diào)與腫瘤之間存在密切關(guān)系。

研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和圖像分析技術(shù)檢測了口腔血管瘤及正常周圍組織中TIP30／CC3基因表達(dá)水平，探討TIP30／CC3基因在口腔血管瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的表達(dá)變化，為臨床上治療口腔血管瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1材料

1.1 材料來源 收集新疆兵團(tuán)第五師醫(yī)院病理科2008－2013年口腔血管瘤存檔蠟塊20例，其中男性15例，女性5例。這些血管瘤所在的部位主要為頜面部。患者術(shù)前均未做任何輔助性治療。

1.2 材料分組 將所有標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)S－P法檢測增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA），按 Mulliken分類標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合PCNA的表達(dá)進(jìn)行分組：石蠟標(biāo)本中增生期血管瘤12例，退化期血管瘤8例。另取距癌組織5cm外的周圍正常頜面部組織5例作對照。

1.3 主要試劑 即用型鼠抗人PCNA單克隆抗體、鼠抗人TIP30／CC3單克隆抗體（購于北京中杉生物技術(shù)有限公司）；超敏即用型SP通用型免疫組織化學(xué)試劑盒（購于福州邁新公司）；DAB顯色試劑盒及多聚賴氨酸（購于北京中杉生物技術(shù)有限公司）。

2方法

2.1 免疫組織化學(xué)SP法檢測TIP30／CC3和PCNA相關(guān)抗原

具體步驟：（1）4μm組織切片常規(guī)脫蠟入水；（2）抗原修復(fù)（檸檬酸緩沖液微波抗原修復(fù)法）；（3）滴加3%H2O2，37℃濕盒孵育10min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性；（4）正常羊血清37℃濕盒孵育10min以減少非特異性背景；（5）分別滴加一抗；（6）滴加鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物復(fù)合物37℃濕盒孵育；（7）滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色；（8）蘇木素復(fù)染；（9）梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢；（10）用PBS代替一抗作為陰性對照組，購買的陽性片作為TIP30／CC3的陽性對照組，人正常皮膚組織作為PCNA的陽性對照組。

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

（1）TIP30／CC3以細(xì)胞膜或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，PCNA以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。陰性對照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，應(yīng)無棕黃色反應(yīng)物。

（2）采用HPIAS－1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)（同濟(jì)千屏影像公司）對TIP30／CC3的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測定每個(gè)視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計(jì)算陽性面積率。以每例5個(gè)視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。（陽性面積率＝單位面積中陽性反應(yīng)的總面積／單位面積中細(xì)胞的總面積×100%）

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS11.5軟件對各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和SNK（q）檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

結(jié) 果

1 PCNA的表達(dá)

增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞核肥大，核內(nèi)彌漫分布棕黃色顆粒，PCNA表達(dá)強(qiáng)（圖1）；退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞核扁平，胞核內(nèi)有少量棕黃色顆粒，PCNA表達(dá)弱（圖2）。

2 TIP30／CC3的表達(dá)

增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞膜或胞漿內(nèi)有少量的棕黃色顆粒，TIP30／CC3呈低表達(dá)（圖3）；退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞胞膜或胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒，TIP30／CC3呈高表達(dá)（圖4）；正常皮膚組織內(nèi)皮細(xì)胞膜或胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒，TIP30／CC3呈高表達(dá)（圖5）。圖像分析結(jié)果見表。增生期組TIP30／CC3的表達(dá)明顯低于退化期組和正常組織（P＜0.05），而后兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

討 論

血管瘤以內(nèi)皮細(xì)胞異常增長為其特點(diǎn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞在血管瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，而血管內(nèi)皮細(xì)胞生長受制一系列正調(diào)控因子和負(fù)調(diào)控因子的調(diào)節(jié)［5－7］。一般認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與消退是血管瘤生長和消退的關(guān)鍵原因。近年來的許多研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡是血管瘤增生、消退的病理組織學(xué)基礎(chǔ)，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是血管瘤自然消退的關(guān)鍵所在。

TIP30是一種30KD的Tat結(jié)合蛋白，又稱為HTATIP2 （HIV1Tat interactive protein 2），是Xiao H 等［8］通過研究人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV ）的體外轉(zhuǎn)錄時(shí)發(fā)現(xiàn)的。TIP30作為HIV轉(zhuǎn)錄的輔助因子可以和Tat結(jié)合蛋白相互結(jié)合從而提高HIV的增殖。通過序列分析發(fā)現(xiàn)TIP30和腫瘤抑制基因CC3為同一蛋白。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)TIP30/CC3在多種腫瘤組織中的表達(dá)率明顯降低，如乳腺癌、肝細(xì)胞癌、黑色素瘤、惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌等，證明TIP30／CC3的下調(diào)與腫瘤的發(fā)生存在密切關(guān)系［9－15］。其主要機(jī)制是通過抑制血管的生成和促進(jìn)細(xì)胞的凋亡來實(shí)現(xiàn)的。

表1 口腔血管瘤不同時(shí)期TIP30／CC3表達(dá)的平均光密度和陽性面積率（）Table 1 The average optical density and the rate of TIP30／CC3positive area in different period of human dermal hemangiomas（）

表1 口腔血管瘤不同時(shí)期TIP30／CC3表達(dá)的平均光密度和陽性面積率（）Table 1 The average optical density and the rate of TIP30／CC3positive area in different period of human dermal hemangiomas（）

＊增生期組與退化期組比較，P＜0.05；（Comparison between proliferatinghemangiomas and involuting hemangiomas）＊P＜0.05；△退化期組與正常組比較，P＞0.05；（Comparison betweeninvoluting hemangiomas and normal skin tissue）△P＞0.05；▲正常組與增生期組比較，P＞0.05（Comparison between proliferatinghemangiomas and normal skin tissue） ▲P＞0.05

Groups例數(shù)N平均光密度Average Optical Density組別Rate of Positive Area 陽性面積率Involuting Group正常組 5 0.2980±0.0324▲ 0.2859±0.0318▲Normal Grou＊Proliferating Group退化期組 8 0.2868±0.0323△ 0.2788±0.0316△增生期組 12 0.0804±0.0104＊ 0.0721±0.0103 p

研究結(jié)果顯示：口腔血管瘤增生期組織中TIP30／CC3基因的表達(dá)明顯低于退化期血管瘤和正?？谇徽衬そM織（P＜0.05）。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程，是多因素、多基因發(fā)生改變所造成的。我們實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：抑癌基因TIP30/CC3可能通過促進(jìn)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡參與血管瘤的退化過程，表明TIP30表達(dá)失調(diào)可能與口腔血管瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。血管瘤是一種血管生成控制失去平衡而引起的疾病，為研究惡性腫瘤血管生成提供了一個(gè)良好的模型。血管生成是多種調(diào)節(jié)因子共同參與相互作用的結(jié)果，健康狀態(tài)下，機(jī)體通過這些因子的完美平衡來控制血管生成。研究這些因子在血管瘤形成過程中的表達(dá)可以為研究腫瘤的血管生成提供參考和指導(dǎo)，通過了解這些調(diào)節(jié)因子在腫瘤血管生成中的作用，為抑制腫瘤的血管生成提供理論和方法學(xué)依據(jù)。

因此，進(jìn)一步研究TIP30基因與血管瘤其它生物學(xué)指標(biāo)的關(guān)系及其相互作用機(jī)制，將有助于了解血管瘤發(fā)病的分子生物學(xué)機(jī)制，進(jìn)而指導(dǎo)臨床治療。今后的實(shí)驗(yàn)中我們將進(jìn)一步探索TIP30基因在多種腫瘤組織表達(dá)降低的機(jī)制，涉及到哪些分子調(diào)控通路，并希望通過基因或蛋白水平的干預(yù)來阻斷其分子調(diào)控通路，為今后多種腫瘤的生物治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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圖 版 說 明

圖1 增生期血管瘤PCNA的表達(dá)

增生的內(nèi)皮細(xì)胞核內(nèi)彌漫分布棕黃色顆粒（→），PCNA表達(dá)強(qiáng)，S－P×200

圖2 退化期血管瘤PCNA的表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞核內(nèi)有少量棕黃色顆粒（→），PCNA表達(dá)弱，S－P×200

圖3 增生期血管瘤TIP30／CC3的表達(dá)增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞膜或胞漿內(nèi)有少量的棕黃色顆粒，TIP30／CC3呈低表達(dá)（→），S－P×200

圖4 退化期血管瘤TIP30／CC3的表達(dá)退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞胞膜或胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒，TIP30／CC3呈高表達(dá)（→），S－P×200

圖5 正常對照組TIP30／CC3的表達(dá)正常皮膚組織內(nèi)皮細(xì)胞膜或胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒，TIP30／CC3呈高表達(dá)（→），S－P×200

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1PCNA expression in proliferating hemangiomas SP ×200

Fig.2PCNA expression in involuting hemangiomas SP ×200

Fig.3TIP30／CC3expression in proliferating hemangiomas SP×200

Fig.4TIP30／CC3expression in involuting hemangiomas SP×200

Fig.5TIP30／CC3expression in normal skin tissue SP ×200