EGFP 轉(zhuǎn)基因小鼠建系及其脊髓源神經(jīng)干細(xì)胞應(yīng)用前景的探討

李 宵 王春芳＊ 李鵬飛 王 晶 閆肖卿 田 峰

（1山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類(lèi)疾病動(dòng)物模型山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2山西醫(yī)科大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，太原030001）

綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein， EGFP），是1962年由Shimomura等從美國(guó)西海岸的一種水母中分離純化出的蛋白質(zhì)，在體外可以經(jīng)適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光激發(fā)后發(fā)出綠色熒光［1］。Shimomura、Marin Chalfie和Roger Y.Tsien于2008年因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)并發(fā)展了EGFP而獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。EGFP蛋白用途廣泛，可以用于分子標(biāo)記［2］、藥物篩選、融合抗體、蛋白標(biāo)記等，尤其用來(lái)觀察細(xì)胞的位置及動(dòng)態(tài)的變化［3－6］，在實(shí)驗(yàn)前不需要固定染色，可以在幾乎不影響細(xì)胞的正常生理作用下進(jìn)行觀察分析。由于EGFP標(biāo)記過(guò)程無(wú)創(chuàng)，分子量很小，并可以在多種生物體內(nèi)表達(dá)，不擾亂生物正常生長(zhǎng)和功能，已廣泛應(yīng)用與轉(zhuǎn)基因生物的建立。

eEGFP是EGFP的突變型，發(fā)生了雙氨基酸取代，熒光強(qiáng)度為EGFP的35倍［7］，可以更好的觀察及應(yīng)用。我們希望構(gòu)建一種可以穩(wěn)定表達(dá)eEGFP的轉(zhuǎn)基因小鼠，在清潔級(jí)環(huán)境下培養(yǎng)并繁殖建系，為之后的小鼠細(xì)胞標(biāo)記提供各組織器官的EGFP細(xì)胞來(lái)源。

材料和方法

1.試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)中所需的c57／bl6小鼠購(gòu)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，所有操作均符合倫理學(xué)要求。

Gateway?BPClonaseTMII Enzyme Mix，Gateway?LR ClonaseTMII Plus Enzyme Mix（invitrogen），QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN），TIANprep Mini（TIANGEN），Taq DNA Polymerase，dNTP Mix，GeneRulerTM100bp DNA Ladder（Fermentas），PrimeSTARTMHS DNA Polymerase（Takara），BIO－RAD PCR 儀 （PTC－220／ALS－1296G／ALD1244G）；電泳儀 DYY－12，水平電泳槽DYCP－31DN（北京市六一儀器廠）；UV transilluminator（UVP）；小型離心機(jī)（Eppendorf）；；風(fēng)熱式電熱恒溫干燥箱（廣州東方電熱干燥設(shè)備廠）；恒溫水浴鍋（HENGAO）；全溫空氣搖床（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

2.載體的構(gòu)建

首先利用重疊PCR擴(kuò)增得到attB1－eEGFP－attB2，反應(yīng)終止后，在1%的瓊脂糖凝膠中電泳。紫外下切出所需條帶，參照QIAquick的瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒進(jìn)行回收。然后，將回收的attB1－eEGFP－attB2利用 Gateway clone技術(shù)，BP反應(yīng)3h得到pDown－eEGFP，并將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Stb13中。將轉(zhuǎn)化物涂到含有50μg／ml Kan的LB平板上，37℃孵育過(guò)夜后，挑取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，并使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否有相應(yīng)條帶出現(xiàn)。最后，將所得到的pDown－EGFP和母載體PRP.Des2dLR反應(yīng)3h，得到最終的表達(dá)載體PRP.Ex2d－EF1A＞eEGFP。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到Stb13。篩選并挑取出陽(yáng)性克隆，提取DNA，PCR后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否有相應(yīng)條帶出現(xiàn)。

3.轉(zhuǎn)基因小鼠的制作

首先取多只雄性小鼠實(shí)施輸精管切除手術(shù)，飼養(yǎng)兩周確定手術(shù)成功后取一只與1－2只雌鼠合籠飼養(yǎng)，制作假孕母鼠。同時(shí)將正常小鼠交配，獲得正常受孕的母鼠，從受孕母鼠體內(nèi)取出受精卵，使用DNA顯微注射法，將之前構(gòu)建的EGFP表達(dá)載體注入受精卵原核，然后移植入假孕的母鼠輸卵管，待其自然產(chǎn)下小鼠。

4.轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定

建立轉(zhuǎn)基因小鼠期間通過(guò)熒光定量PCR方法鑒定其基因型，將離乳期小鼠剪下約1cm鼠尾，提取DNA，PCR后采取瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。建系期間采取雙向鑒定的方法，熒光定量PCR檢測(cè)后觀察陽(yáng)性小鼠紫外照射是否會(huì)發(fā)出綠色熒光，及紫外照射發(fā)出熒光后熒光定量PCR鑒定其基因型是否符合。鑒定引物 F：ACGTAAACGGCCACAAGTTC，R： GATCTTGAAGTTCACCTTGATGC。

取一只陽(yáng)性EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠麻醉，心臟灌注后取心、腦、肺、腎、肝、脾、骨骼肌、脊髓，修剪成合適大小，常規(guī)脫水后石蠟包埋。石蠟切片機(jī)5μm連續(xù)組織切片，脫蠟后不加處理直接放于熒光顯微鏡下，觀察陽(yáng)性小鼠的組織是否可以發(fā)出綠色熒光。

5.轉(zhuǎn)基因小鼠的建系

通過(guò)PCR將建立的4只原代轉(zhuǎn)基因小鼠間及與野生型小鼠間進(jìn)行配種繁殖，得到的陽(yáng)性子代間繼續(xù)交叉配種繁殖。全部過(guò)程于屏障環(huán)境中進(jìn)行，期間送檢微生物與寄生蟲(chóng)。

6.轉(zhuǎn)基因小鼠身長(zhǎng)及體重的測(cè)定

待小鼠長(zhǎng)至兩個(gè)月時(shí)，隨機(jī)挑取10只轉(zhuǎn)基因小鼠及相同環(huán)境飼養(yǎng)的10只野生型c57小鼠，測(cè)量身長(zhǎng)和體重。數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

7.建系后轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)

取一孕齡為13－14d的轉(zhuǎn)基因小鼠，麻醉后常規(guī)消毒母鼠腹部。開(kāi)腹后取出子宮，轉(zhuǎn)移至平皿中，D－Hanks液沖洗。剪開(kāi)子宮外膜取出胎鼠，剝離胎鼠脊髓，并剝?nèi)ゼ顾柰饽?，放入D－Hanks中吹打至脊髓消失液體渾濁。將渾濁液體1500r／min離心5min，棄上清，加入含EGF、FGF各20ng／ml的DMEM／F－12培養(yǎng)基后充分混勻后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，放于37℃5%的CO2孵箱中培養(yǎng)，每3d半量換液。將培養(yǎng)三代的神經(jīng)干細(xì)胞吹打混勻后吸出200 μl涂于載玻片上，不加處理，于熒光顯微鏡下觀察。

結(jié) 果

1.載體的構(gòu)建

圖1A為PCR擴(kuò)增attB1－EGFP－attB2，該P(yáng)CR產(chǎn)物條帶理論大小約為722bp，對(duì)圖譜中相應(yīng)大小的條帶進(jìn)行切膠回收。圖1B為菌落PCR篩選pDown－eEGFP，產(chǎn)物條帶理論大小為956bp，與目的條帶大小相符的克隆即為陽(yáng)性克隆。圖1C為菌落PCR篩選PRP.Ex2d－EF1A＞EEGFP，產(chǎn)物條帶理論大小為720bp，與目的條帶大小相符的克隆即為陽(yáng)性克隆，說(shuō)明載體構(gòu)建成功?？蓪⑻崛〉降腄NA用于顯微注射。

圖1 A PCR鑒定attB1－EGFP－attB2凝膠電泳分析結(jié)果。圖1B PCR鑒定pDown－eEGFP凝膠電泳分析結(jié)果。圖1C PCR鑒定PRP.Ex2d－EF1A＞EEGFP凝膠分析結(jié)果Fig.1AThe electrophoresis analysis of attB1－EGFP－attB2.Fig.1BThe electrophoresis analysis of pDown－eEGFP.Fig.1CThe electrophoresis analysis of PRP.Ex2d－EF1A＞EEGFP.

2.轉(zhuǎn)基因小鼠的制作及鑒定

轉(zhuǎn)基因小鼠共制作成功4只，兩雌兩雄。

圖2為傳代轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶為440bp。此圖中Mark－er為DL500，最亮處為200bp，可見(jiàn)400bp與500bp間有相應(yīng)條帶出現(xiàn)。如圖所示，紫外照射發(fā)出綠色熒光的小鼠PCR檢測(cè)全部為陽(yáng)性。

。

圖2 PCR鑒定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠凝膠電泳分析結(jié)果。Fig.2The electrophoresis analysis of transgene positive mice.

將EGFP轉(zhuǎn)基因新生小鼠直接放于紫外下照射，可發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性小鼠皮膚會(huì)發(fā)出綠色熒光，而陰性小鼠不發(fā)熒光顯黑色。成年小鼠毛發(fā)無(wú)活細(xì)胞不分泌蛋白不發(fā)熒光，耳、爪、尾等裸露皮膚的部位有綠色熒光。

圖3 A 新生小鼠陰性與陽(yáng)性在紫外燈下的對(duì)比。圖3B 成年陽(yáng)性小鼠與陰性小鼠在紫外下的對(duì)比。Fig.3AComparison of negative and positive new born mouse by ultraviolet lightFig.3BComparison of negative and positive adult mouse by ultraviolet light

由熒光照片觀察可知，EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠的各組織切片中細(xì)胞所在部位在藍(lán)色激發(fā)光下均可觀察到綠色熒光，不同細(xì)胞之間熒光強(qiáng)度會(huì)有不同，結(jié)締組織等不分泌蛋白部位不發(fā)光。說(shuō)明固定包埋等常規(guī)處理后不會(huì)影響熒光的發(fā)生。

圖4 A肺組織熒光照片100×圖4B肝臟組織熒光照片100×圖4C腦組織熒光照片100×圖4D脾臟組織熒光照片100×圖4E腎臟組織熒光照片100×圖4F心肌組織熒光照片400×圖4G骨骼肌熒光照片400×圖4H脊髓組織熒光照片100×Fig.4AFluorescent photographs of lung 100×Fig.4BFluorescent photographs of kidney 100×Fig.4CFluorescent photographs of brain 100×Fig.4DFluorescent photographs of spleen 100×Fig.4EFluorescent photographs of liver 100×Fig.4FFluorescent photographs of myocardial 400×Fig.4GFluorescent photographs of Skeletal Muscle 400×Fig.4HFluorescent photographs of spinal cord 100×

圖4A為肺組織熒光照片?？梢?jiàn)有大量肺泡，氣管壁細(xì)胞發(fā)出較強(qiáng)熒光。圖4B為肝臟組織熒光照片，可見(jiàn)肝組織呈條索狀。圖4C為腦組織熒光照片，可見(jiàn)較為明顯的3層結(jié)構(gòu)。圖4D為脾臟組織熒光照片。圖4E為腎臟組織熒光照片?？梢?jiàn)近端小管、遠(yuǎn)端小管、集合管，并可見(jiàn)腎小球。圖4F為心臟組織熒光照片。圖4G為骨骼肌橫切面熒光照片。圖4H為脊髓橫切面熒光照片，看見(jiàn)白質(zhì)與灰質(zhì)發(fā)出不同強(qiáng)度熒光，有較為明顯的界限。在灰質(zhì)中可觀察到較亮的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。

3.轉(zhuǎn)基因小鼠的建系

轉(zhuǎn)基因小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定，和野生型小鼠無(wú)明顯行為學(xué)區(qū)別。經(jīng)過(guò)兩年的繁殖，現(xiàn)已有400余只小鼠，其中陽(yáng)性有274只。繁殖過(guò)程中發(fā)現(xiàn)4代后小鼠已有一窩全部都為陽(yáng)性的現(xiàn)象，目前新生小鼠陽(yáng)性率已經(jīng)大于80%。轉(zhuǎn)基因小鼠飼養(yǎng)在隔離環(huán)境下，經(jīng)微生物與寄生蟲(chóng)檢測(cè)符合清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要求。

圖5 A為1號(hào)雌鼠所繁殖后代的家系譜圖。圖5B為3號(hào)雌鼠家系譜圖。Fig.5APedigree trees of transgenic mouse.5BPedigree trees of No3transgenic mouse

4.身長(zhǎng)及體重的測(cè)定

如表所示，可見(jiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠相比，體重之間與身長(zhǎng)之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以說(shuō)明轉(zhuǎn)基因小鼠基本生理數(shù)據(jù)與野生型小鼠無(wú)明顯差異，EGFP基因不會(huì)干擾小鼠的正常生長(zhǎng)。

表1 EGFP小鼠與野生型小鼠身長(zhǎng)體重的對(duì)比Table 1 Comparison of length and weight in EGFP mouse and wild mouse

5.建系后轉(zhuǎn)基因小鼠培養(yǎng)脊髓源神經(jīng)干細(xì)胞的觀察

所培養(yǎng)細(xì)胞使用神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記蛋白Nestin免疫組織細(xì)胞染色，圖6A可以發(fā)現(xiàn)視野中細(xì)胞球呈綠色熒光，說(shuō)明所培養(yǎng)出的細(xì)胞球呈Nestin抗原陽(yáng)性，即為神經(jīng)干細(xì)胞。圖6B為Hochest對(duì)細(xì)胞核的染色，藍(lán)色熒光部位說(shuō)明有細(xì)胞核的存在。

將培養(yǎng)的3代神經(jīng)干細(xì)胞涂于載玻片上置于熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)視野內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞散在分布，由于未貼壁，細(xì)胞呈較為規(guī)則的圓形。所見(jiàn)細(xì)胞在激發(fā)光下均發(fā)出綠色熒光，其中大塊綠色為神經(jīng)干細(xì)胞球。

圖6 A 神經(jīng)干細(xì)胞的Nestin鑒定細(xì)胞漿呈陽(yáng)性40×。圖6B 神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞核的Hochest染色40×。Fig.6AFluorescent images of NSCs was showed the cytoplasm immunopositive for Nestin 40×.Fig.6BFluorescent images of NSCs was showed the nucleus immunopositive for Hochest40×.

圖7 三代神經(jīng)干細(xì)胞熒光照片40×。Fig.7 Fluorescent photographs of three generation neural stem cells 40×

圖7 A為第一代的神經(jīng)干細(xì)胞，鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞較為分散，單個(gè)細(xì)胞體積較小，神經(jīng)球數(shù)目不多。圖7B為第二代體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞，可見(jiàn)細(xì)胞體積增大，并有較小的神經(jīng)球產(chǎn)生。圖7C為第三代細(xì)胞，可見(jiàn)有大量神經(jīng)球產(chǎn)生。觀察三代神經(jīng)干細(xì)胞的熒光照片，發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化，不會(huì)因體外培養(yǎng)傳代而衰減。

討 論

細(xì)胞標(biāo)記是細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)中常用的方法之一，是為了追蹤多細(xì)胞系統(tǒng)中某種特定細(xì)胞的作用和行為，使用前將該特定細(xì)胞通過(guò)特殊手段處理，觀察時(shí)使用一定方法處理可以與未標(biāo)記細(xì)胞區(qū)分。實(shí)驗(yàn)室目前將細(xì)胞標(biāo)記多用于細(xì)胞移植治療［8－9］，可監(jiān)測(cè)其在體內(nèi)的生長(zhǎng)狀態(tài)，增殖分化情況等。

EGFP標(biāo)記是目前實(shí)驗(yàn)室中最為常用的一種活體細(xì)胞標(biāo)記手段，而且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，多聚甲醛固定及石蠟包埋處理后不會(huì)影響熒光的檢測(cè)?？梢栽谒{(lán)色激發(fā)光下不做任何處理直接觀察，不會(huì)影響細(xì)胞的完整性和活性，觀察后可繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。因此是一種理想的細(xì)胞標(biāo)記物。但熒光蛋白標(biāo)記法操作復(fù)雜，過(guò)程繁瑣，病毒載體構(gòu)建困難，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員要求較高，不利于實(shí)驗(yàn)過(guò)程的順利進(jìn)行。由于EGFP本身是從動(dòng)物體內(nèi)提取的一種蛋白，對(duì)細(xì)胞及生物體毒性弱，這就為EGFP轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提供了基礎(chǔ)。c57是實(shí)驗(yàn)室中常用的一種近交系實(shí)驗(yàn)小鼠，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的取材及多種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均會(huì)用到該品系，因此我們構(gòu)建了c57EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠。當(dāng)需要某種細(xì)胞時(shí)，可直接從轉(zhuǎn)基因小鼠提取，提取及培養(yǎng)方法與普通細(xì)胞一致，不需任何額外操作，即可獲得已標(biāo)記EGFP的細(xì)胞，省去了細(xì)胞培養(yǎng)后標(biāo)記的復(fù)雜操作，同時(shí)降低了轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞的額外影響，并保證了轉(zhuǎn)染效率。

根據(jù)文獻(xiàn)其他實(shí)驗(yàn)室也有EGFP小鼠的制作，但未見(jiàn)建系的報(bào)道［10］。近交系小鼠擁有純正的譜系，是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化的一部分，并具有遺傳基因位點(diǎn)純合型、遺傳組成的同源性、長(zhǎng)期遺傳的穩(wěn)定性、遺傳特征的穩(wěn)定性、表型一致性、背景資料清楚等特點(diǎn)，不同國(guó)家和實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家可重復(fù)和驗(yàn)證以取得的數(shù)據(jù)，提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性。轉(zhuǎn)基因小鼠制作過(guò)程中產(chǎn)生的第一代子鼠為嵌合體小鼠，在繁殖過(guò)程中會(huì)有野生型小鼠出生，因此我們將陽(yáng)性小鼠互交，希望可以培育出EGFP的近交系轉(zhuǎn)基因小鼠，完善轉(zhuǎn)基因動(dòng)物建設(shè)平臺(tái)。在此過(guò)程中，我們希望通過(guò)對(duì)多代數(shù)進(jìn)行觀察，確定轉(zhuǎn)入EGFP后對(duì)生物的后續(xù)影響。

通過(guò)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠的各組織在多聚甲醛固定及石蠟包埋處理后，均可觀察到所有細(xì)胞發(fā)出綠色熒光。說(shuō)明轉(zhuǎn)基因小鼠常見(jiàn)組織細(xì)胞可在藍(lán)色激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光，并且不受常規(guī)處理的干擾。但在觀察中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞熒光強(qiáng)度會(huì)有不同，我們認(rèn)為熒光強(qiáng)度與細(xì)胞分泌蛋白的強(qiáng)度有關(guān)，下一步將會(huì)對(duì)不同組織的熒光蛋白做定量檢測(cè)，分析產(chǎn)生的原因。因此，現(xiàn)已可將EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠作為實(shí)驗(yàn)室中所使用的一種工具鼠，用于細(xì)胞移植和細(xì)胞共培養(yǎng)等需要細(xì)胞標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)。

脊髓損傷是脊柱損傷的嚴(yán)重并發(fā)癥，造成損傷平面以下感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)功能的喪失，不僅給病人帶來(lái)極大的痛苦，也給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)，其治療一直是困擾人們的難題。目前的多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)神經(jīng)干細(xì)胞的移植為脊髓損傷的治療提供了新的途徑，已經(jīng)成為目前研究脊髓損傷修復(fù)的一個(gè)熱點(diǎn)。Cusimano M的研究表明，神經(jīng)干細(xì)胞的注射治療可以改變脊髓損傷后的微環(huán)境，可以修復(fù)損傷的軸突或使其再生［11］。移植入損傷部位的神經(jīng)干細(xì)胞可以分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，連接損傷部位脊髓并重建神經(jīng)傳導(dǎo)通路，部分恢復(fù)損傷平面以下的運(yùn)動(dòng)及感覺(jué)功能［12，13］。本課題組之前的研究已經(jīng)證實(shí)神經(jīng)干細(xì)胞在脊髓損傷后具有修復(fù)作用，與對(duì)照組相比，神經(jīng)干細(xì)胞注射組BBB評(píng)分更高，組織切片也說(shuō)明細(xì)胞有更多的分裂分化［14］，但其在治療過(guò)程中所產(chǎn)生作用的具體機(jī)制尚不清楚。因此需要了解神經(jīng)干細(xì)胞注射入脊髓損傷部位后的生存狀態(tài)，是自體分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，還是誘導(dǎo)體內(nèi)細(xì)胞的自我分化。我們的研究已經(jīng)證實(shí)，EGFP小鼠所培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞在體外多次傳代后仍可在激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光。因此，在后續(xù)的研究中，我們將從轉(zhuǎn)基因小鼠的脊髓中培養(yǎng)獲得的神經(jīng)干細(xì)胞注射入脊髓損傷模型小鼠損傷部位后，在時(shí)間節(jié)點(diǎn)處死模型小鼠，常規(guī)處理后在熒光顯微鏡下觀察注射細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生存情況，并通過(guò)免疫組織化學(xué)確定注射細(xì)胞所處狀態(tài)及分化情況，分析神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)揮的作用，為神經(jīng)干細(xì)胞在脊髓損傷修復(fù)中提供更加直觀的理論依據(jù)。

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