不同輻照劑量對(duì)紅豆分離蛋白結(jié)構(gòu)及特性的影響

陳 勇 王 晶 江連洲，2 李 楊，2 王 曉 王中江

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，哈爾濱 150030）（國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心2，哈爾濱 150030）

不同輻照劑量對(duì)紅豆分離蛋白結(jié)構(gòu)及特性的影響

陳 勇1王 晶1江連洲1，2李 楊1，2王 曉1王中江1

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，哈爾濱 150030）（國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心2，哈爾濱 150030）

采用Lowery法、ANS熒光探針?lè)?、圓二色光譜、熒光光譜等方法分別對(duì)不同輻照處理的紅豆分離蛋白溶解度、表面疏水性、蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、流體動(dòng)力學(xué)半徑進(jìn)行分析。結(jié)果表明：隨著輻照劑量的增加，紅豆分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α－螺旋結(jié)構(gòu)向無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，Trp殘基所處微環(huán)境極性先增強(qiáng)后減弱，這與其表面疏水性呈現(xiàn)正相關(guān)，蛋白顆粒大小隨著輻照劑量的增加先減小后增大，在5 kGy輻照劑量處理時(shí)達(dá)到最小，這與其溶解性呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

輻照 紅豆分離蛋白 蛋白結(jié)構(gòu) 功能特性 圓二色譜

紅豆（Phaseolus angularis）菜豆屬，豆科，俗稱“赤小豆”、“紅小豆”［1］。紅豆原產(chǎn)于中國(guó)，在我國(guó)的栽培和利用技術(shù)已有2000多年的歷史。紅豆種子中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，每100 g紅豆中約含蛋白質(zhì)20.79 g、脂肪 0.79 g、糖類 58.59 g、粗纖維 4.39 g、總膳食纖維23.49 g及微量維生素［2］。由于紅豆具有獨(dú)特的中藥屬性，對(duì)紅豆蛋白資源開(kāi)發(fā)和綜合利用研究已逐步發(fā)展起來(lái)，這對(duì)于改善人們的膳食結(jié)構(gòu)具有重要意義［3］。

輻照技術(shù)是借助鈷－60所產(chǎn)生的高能量、強(qiáng)穿透性的伽馬射線，電離和激發(fā)物質(zhì)產(chǎn)生的活化分子與活化原子，并發(fā)生一系列物理、化學(xué)、與生物化學(xué)變化，使物質(zhì)發(fā)生聚合、交聯(lián)、降解、并發(fā)生改性［4］。FAO、WHO和IAEA輻照食品聯(lián)合專家委員會(huì)早在1980年10月就根據(jù)總結(jié)的世界各國(guó)輻照食品的研究成果制定了國(guó)際安全線，即任何食品當(dāng)總體平均吸收劑量不超過(guò)10 kGy時(shí)，不存在毒理學(xué)的危險(xiǎn)，也不會(huì)產(chǎn)生特別的微生物學(xué)和營(yíng)養(yǎng)的問(wèn)題［5］。國(guó)外對(duì)輻照技術(shù)的研究相比國(guó)內(nèi)起步較早，Vaz等［6］研究了低劑量輻照處理對(duì)過(guò)敏原蛋白抗原決定簇影響；Ramkrashan Kasera等［7］研究了加熱處理與輻照處理對(duì)豆類變應(yīng)原性的影響。近年來(lái)，我國(guó)逐步加快了輻照技術(shù)在食品中的應(yīng)用研究，朱佳廷等［8］進(jìn)行了大豆蛋白粉的輻照滅菌研究，然而，在這些的研究中，目前鮮有研究低劑量輻照處理紅豆蛋白對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能特性的影響。本試驗(yàn)主要研究了利用60Coγ射線研究不同輻照劑量對(duì)紅豆分離蛋白的結(jié)構(gòu)和功能性的影響，為輻照技術(shù)對(duì)紅豆蛋白改性應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅豆：市售產(chǎn)地為黑龍江省海林；九三大豆油：市售Lowry法蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒：上海荔達(dá)生物科技有限公司；1－苯胺基－8－萘磺酸（ANS）：Sigma公司。

1.2 儀器

FD5－3型冷凍干燥機(jī)：美國(guó)SIM公司；F－4500熒光分光光度計(jì)：日本HITACHI公司；J－810圓二色譜儀：日本JASCO公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紅豆分離蛋白提取

紅豆去皮后，粉碎過(guò)60目篩子，正己烷脫脂3次，風(fēng)干后堿溶酸沉法提取，冷凍干燥，得到的紅豆分離蛋白在－20℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 紅豆蛋白輻照處理

采用透明聚乙烯（PE）塑料袋包裝，50 g／袋，輻照處理在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所進(jìn)行輻照裝置為60Coγ輻射源，輻照劑量分別為1、3、5和10 kGy。輻照后樣品室溫（15～30℃）下貯存，用重鉻酸鹽劑量計(jì)作為輻照劑量跟蹤。

1.3.3 圓二色譜分析

采用遠(yuǎn)紫外區(qū)域圓二色光譜研究紅豆蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)［9－10］，圓二色譜（CD）掃描波長(zhǎng)范圍為 250～200 nm，常溫下（25±1）℃，掃描速度為100 nm／min，樣品池光程為0.1 nm，靈敏度為100 mdeg／cm。紅豆分離蛋白濃度為 0.4 mg／mL，用 pH 7.0，0.01 mol／L的磷酸緩沖液配制。用平均摩爾橢圓率［θ］來(lái)表示CD數(shù)據(jù)，單位為 deg·cm2·dmol－1。通過(guò) CDPRO軟件分析CD色譜圖數(shù)據(jù)，使用的算法為CONTIN／LL，使用的參考蛋白為 SMP56（Optimized for 190－240 nm＃Less nm required），取蛋白平均殘基濃度MRW為115 g／mol，計(jì)算波長(zhǎng)范圍為 200～240 nm，計(jì)算α－螺旋，β－折疊，β－轉(zhuǎn)角與無(wú)規(guī)則卷曲的含量［11］。每個(gè)樣品重復(fù)3次測(cè)定。

1.3.4 流體動(dòng)力學(xué)半徑及其分布測(cè)試

采用ZetaPlus粒度分析儀測(cè)定紅豆分離蛋白的流體動(dòng)力學(xué)半徑及其分布徑。將紅豆分離蛋白樣品用50 mmol／L的磷酸緩沖液（pH 7.0）稀釋至蛋白濃度為0.2%的溶液。過(guò)0.45μm醋酸纖維膜（水系），于室溫下進(jìn)行測(cè)量，取3次測(cè)量的平均值。

1.3.5 熒光光譜測(cè)試

采用F－4500熒光分光光度計(jì)測(cè)定紅豆分離蛋白的內(nèi)源性熒光光譜（色氨酸熒光光譜）。將自制紅豆分離蛋白樣品分散于0.01 mol／L磷酸緩沖液（pH 7.0）中，配制成0.15 mg／mL的蛋白溶液。熒光發(fā)散光譜分析以蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的色氨酸熒光基團(tuán)為探針，為了降低酪氨酸的貢獻(xiàn)，熒光光譜激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm，發(fā)散光譜掃描范圍為300～400 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬均為5 nm［12］。

1.3.6 表面疏水性測(cè)定

表面疏水性測(cè)定采用ANS熒光探針?lè)?。分別稱取0.025 g不同品種蛋白樣品溶于50 mL磷酸鹽緩沖液（0.01 mol／L，pH 7.0）中，在室溫條件下攪拌1.0 h，然后在10 000×g離心30 min，取上清液用Lowry法測(cè)定蛋白濃度，并用磷酸鹽緩沖液依次稀釋（濃度為0.005～0.5 mol／mL）后，取不同濃度梯度的樣品溶液4 mL，分別加入40μL濃度為8 mmol／L的ANS溶液（用0.01 mol／L，pH 7.0的磷酸鹽緩沖液配制），經(jīng)振蕩后靜置3 min，再測(cè)定樣品熒光強(qiáng)度（FI）。試驗(yàn)中激發(fā)波長(zhǎng) λex＝370 nm，發(fā)射波長(zhǎng)λem＝490 nm，夾縫為5 nm。以熒光強(qiáng)度比蛋白質(zhì)濃度作圖，初始段斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水值（H0）［13］。

1.3.7 溶解性測(cè)定

稱取100 mg紅豆蛋白樣品分散于10 mL的去離子水中，磁力攪拌30 min，20℃、12 000×g離心20 min。上清液經(jīng)適度稀釋，采用Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白質(zhì)的溶解度表示為上清液蛋白質(zhì)量占總蛋白質(zhì)量的百分比［14］。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

單項(xiàng)試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果均為平均值，以x±s（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤）表示，數(shù)據(jù)處理采用SAS 8.12軟件進(jìn)行單因素方差分析（One－WayANOVA）和差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 圓二色光譜分析

通過(guò)曲線擬合軟件CDPro計(jì)算得到紅豆分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)如表1所示。對(duì)照樣品螺旋結(jié)構(gòu)總量為7.4%，β－折疊結(jié)構(gòu)總量為41.9%，β－轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)為21.1%，無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為29.6%。由以上數(shù)據(jù)可知β－折疊和無(wú)規(guī)則卷曲是其主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元，這與Meng等［15］采用拉曼光譜研究紅豆球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成得到的結(jié)果相似。從表1可知，隨著輻照劑量的增加，α－螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，這是由于維持大豆蛋白分子螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵（一個(gè)肽鍵的C==O和其前第3個(gè)肽鍵的N—H之間的氫鍵）斷裂導(dǎo)致α－螺旋結(jié)構(gòu)受到破壞，使α－螺旋結(jié)構(gòu)含量下降，無(wú)規(guī)則卷曲含量升高。以上結(jié)果表明輻照誘導(dǎo)了維持蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力改變，從而使4種結(jié)構(gòu)的含量發(fā)生了變化。

表1 對(duì)照樣品和不同劑量輻照處理紅豆分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量／%

2.2 熒光光譜

不同輻照劑量處理紅豆分離蛋白熒光光譜的影響如圖1和表2所示。紅豆分離蛋白在290 nm處激發(fā)所得到的主要是色氨酸為發(fā)射基團(tuán)的熒光光譜，可反映色氨酸殘基的變化程度及其微環(huán)境的變化情況［16］。從圖1可以看出低劑量輻照條件下，熒光強(qiáng)度有所降低，輻照劑量為5 kGy的條件，熒光強(qiáng)度最大，然后隨著輻照劑量增大，熒光強(qiáng)度又呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。原因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子經(jīng)過(guò)輻照處理后，其分子伸展，暴露出不同的生色基團(tuán)，從而改變了熒光強(qiáng)度的大小，然而當(dāng)輻照劑量持續(xù)增加，則蛋白會(huì)發(fā)生卷曲、折疊，又會(huì)使原本已經(jīng)外露的生色基團(tuán)內(nèi)包于蛋白分子內(nèi)部，發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象。從表2可以看出，經(jīng)過(guò)輻照處理后的樣品與對(duì)照組熒光發(fā)射峰位（332.5 nm）比較，輻照處理后的最大吸收值都變大了，即熒光光譜發(fā)生了紅移現(xiàn)象。λmax的紅移表明輻照使紅豆分離蛋白的結(jié)構(gòu)展開(kāi)，分子內(nèi)部的色氨酸殘基逐漸暴露，其最大吸收波長(zhǎng)λmax的分析結(jié)果與表面疏水性的分析結(jié)果相一致，進(jìn)一步表明輻照會(huì)導(dǎo)致紅豆分離蛋白結(jié)構(gòu)的變化。

圖1 對(duì)照樣品和不同劑量輻照處理紅豆分離蛋白的熒光光譜圖

表2 不同輻照劑量處理紅豆分離蛋白熒光光譜最大吸收值

由熒光光譜測(cè)試結(jié)果可知，輻照處理紅豆分離蛋白，使得蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。此外，紅豆分離蛋白分子整體結(jié)構(gòu)復(fù)雜、芳香族氨基酸和熒光生色基團(tuán)分布不均、蛋白分子伸展或折疊方式不同，在輻照處理下都會(huì)引起蛋白熒光強(qiáng)度的差異［17］。

2.3 粒徑分布

不同輻照條件下紅豆分離蛋白的粒徑分布如圖2所示，與對(duì)照樣品相比，輻照劑量在1 kGy和3 kGy條件下，樣品的粒徑分布相似，都向粒度小的方向偏移。當(dāng)輻照劑量增加到5 kGy時(shí)，樣品粒徑分布向粒度小的方向偏移更加明顯［18］，然而隨著輻照劑量的進(jìn)一步增加，樣品的粒徑分布卻向粒度大的方向偏移，并且可以看出輻照劑量為10 kGy的樣品，其粒徑分布明顯在對(duì)照樣品粒徑分布的右側(cè)。上述現(xiàn)象可能是由于輻照處理引起紅豆分離蛋白的分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)，蛋白分子發(fā)生解聚，導(dǎo)致平均粒徑變小；然后隨著輻照劑量持續(xù)增加，暴露的疏水基團(tuán)的相互作用生成可溶性聚集體，從而平均粒徑變大。粒徑分布的分析結(jié)果與溶解性的分析結(jié)果相一致，進(jìn)一步說(shuō)明了低劑量輻照處理有助于紅豆分離蛋白溶解度的改善。

圖2 對(duì)照樣品和不同劑量輻照處理紅豆分離蛋白的粒徑分布圖

2.4 表面疏水性

疏水相互作用對(duì)紅豆分離蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和其功能性質(zhì)具有重要的作用，是維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力。圖3結(jié)果表明，與未處理的對(duì)照樣品相比，經(jīng)過(guò)不同劑量輻照處理的紅豆分離蛋白表面疏水性都有顯著增加，其中經(jīng)5 kGy輻照處理的紅豆蛋白表面疏水性最大。這是由于低劑量輻照條件破壞了蛋白質(zhì)分子內(nèi)部間的疏水相互作用，從而有利于聚集體內(nèi)部二硫鍵形成，同時(shí)降低巰基團(tuán)濃度，造成蛋白分子內(nèi)部發(fā)生聚集［19］，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水相互作用受到破壞，疏水性區(qū)域暴露到蛋白分子表面，導(dǎo)致蛋白的表面疏水性增加。當(dāng)輻照劑量升高到10 kGy時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間通過(guò)疏水相互作用，形成蛋白分子聚集體，疏水基團(tuán)包埋在聚集體內(nèi)部，因此表面疏水性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖3 對(duì)照樣品和不同劑量輻照處理紅豆分離蛋白的表面疏水性

2.5 溶解度測(cè)定

由圖4可以看出，對(duì)照樣品和不同劑量輻照處理紅豆蛋白的溶解度變化，未處理的紅豆分離蛋白的溶解度約為60%，通過(guò)輻照處理后，其溶解性得到了明顯改善，當(dāng)輻照劑量達(dá)到5 kGy時(shí)，溶解度得到最大上升，達(dá)到80%。但隨著輻照劑量的進(jìn)一步增加其溶解度有下降趨勢(shì)。原因可能由于輻照處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的原有結(jié)構(gòu)破壞，使得多肽鏈裂解［20］，從而體現(xiàn)在紅豆分離蛋白溶解性的提高。但是隨著輻照劑量的增加，蛋白分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)，使埋藏分子內(nèi)部的巰基和疏水基團(tuán)進(jìn)一步暴露，伸展的蛋白分子之間通過(guò)非共價(jià)鍵作用重新形成大分子聚集體，造成溶解度的下降［21］。

圖4 對(duì)照樣品和不同劑量輻照處理紅豆分離蛋白的溶解度

3 結(jié)論

不同劑量輻照處理紅豆分離蛋白，隨著輻照劑量的增加，紅豆分離蛋白的分子結(jié)構(gòu)和功能都發(fā)生不同程度的變化。圓二色光譜分析表明，隨著輻照劑量的增加，紅豆分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)各部分含量發(fā)生變化，主要呈現(xiàn)α－螺旋結(jié)構(gòu)向無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。熒光光譜分析表明，最大吸收波長(zhǎng)λmax的紅移程度隨著輻照劑量的增加表現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，表明紅豆分離蛋白中Trp殘基所處微環(huán)境極性先增強(qiáng)后減弱，這與其表面疏水性呈現(xiàn)正相關(guān)。流體粒徑分析表明，隨著輻照劑量的增加，蛋白顆粒體積呈現(xiàn)的是先減小后增大趨勢(shì)，在5 kGy輻照劑量處理時(shí)達(dá)到最小，與其溶解性呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

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Different Iradiation Dose on the Structure and Functional Effects of Red Bean Protein Isolates

Chen Yong1Wang Jing1Jiang Lianzhou1，2Li Yang1，2Wang Xiao1Wang Zhongjiang1

（College of Food Science，Northeast Agricultural University1，Haerbin 150030）（National Research Centre of Soybean Engineering And Technology2，Haerbin 150030）

Different irradiation dose had been researched by Lowery，ANSfluorescence probe method，circular dichroism and fluorescence spectrum.The results showed that the alpha helix structure was changed into random coil，with the increase of irradiation dose.The micro environment polarity of Trp residue increased first and then decreased，which indicated the positive correlation with surface hydrophobicity.Protein particle size decreased first and then increased with the increasing of irradiationdose.When the irradiation dose was 5 kGy，the size of protein particle reduced to the minimum.The protein particle size had negative correlation with the solubility of red bean protein isolates.

irradiation，red bean（Phaseolus angularis）protein isolates，proteins structure，functional property，circular dichroism

TS214.9

A

1003－0174（2015）04－0039－05

黑龍江省青年基金（QC2013C014）

2013－12－17

陳勇，男，1988年出生，碩士，食品工程

江連洲，男，1960年出生，教授，博士生導(dǎo)師，糧食、油脂與植物蛋白工程