神經(jīng)干細(xì)胞移植減輕ICH模型大鼠的神經(jīng)功能障礙

祁 景 劉小軍 周明鍇

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院ICU 鄭州 450014

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一種嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病［1］。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞替代、旁分泌腦源性生長(zhǎng)因子和促進(jìn)突觸再生的角度，探討神經(jīng)干細(xì)胞（neural sfem celle，NSCS）移植改善腦出血大鼠神經(jīng)功能的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制作 動(dòng)物的飼養(yǎng)和后續(xù)所有相關(guān)實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)鄭州大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。SD大鼠由河南省動(dòng)物中心提供。隨機(jī)選取雄性SD大鼠30只，分為3組：sham組（采用立體定位儀定位穿刺但不打入膠原酶）10只，ICH模型組（模型組，采用立體定位儀定位穿刺并打入膠原酶并鑒定合格）10只，NSCS細(xì)胞干預(yù)組（NSCS組，采用立體定位儀定位穿刺并鑒定合格后注射NSCS 1×106）10只，參照文獻(xiàn)［2］及George Paxinos大鼠腦立體定位圖譜，將大鼠取俯臥位，采用固定器，固定在大鼠腦立體定位儀上，以左側(cè)紋狀體為穿刺點(diǎn)（前囟后0.2mm，左側(cè)旁3mm，垂直6 mm）。采用10μL微量進(jìn)樣器，在該穿刺點(diǎn)緩慢注入0.5μLⅦ型膠原酶溶液（sigma公司），留針約10min后緩慢退出穿刺針。術(shù)后清潔創(chuàng)面，縫合頭皮。術(shù)后24h內(nèi)進(jìn)行mNSS評(píng)分［3］，選取8～12分為符合標(biāo)準(zhǔn)納入分組內(nèi)。

1.2 NSCS的培養(yǎng) 復(fù)蘇NSCS（本實(shí)驗(yàn)室保存），給復(fù)蘇的NSCS每天更換細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM／F12，20%KSR，1mM L-谷氨酰胺，0.1mMβ巰基乙醇，0.1mM NEAA，10ng／mL bFGF），長(zhǎng)至可以傳代。

1.3 神經(jīng)功能評(píng)分 采用mNSS評(píng)分（包括運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、平衡、反射）評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能缺損和恢復(fù)情況，各組均在術(shù)后1、3、7、14、28d評(píng)分。

1.4 腦組織取材 造模后28d提取各組大鼠腦組織標(biāo)本，3～5只多聚甲醛灌注固定法固定腦組織，梯度蔗糖脫水后冰凍冠狀切片（厚12μm）。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 各組切片做brdu（抗體均購(gòu)自santa，一抗為鼠抗人，二抗為兔抗鼠）的免疫熒光染色，和BDNF和GAP-43（抗體均購(gòu)自santa，一抗為兔抗鼠，二抗為山羊抗兔）的免疫組織化學(xué)染色。免疫組化采用imageJ進(jìn)行陽(yáng)性信號(hào)灰度值的測(cè)定分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，其中mNSS數(shù)據(jù)行重復(fù)測(cè)量分析，其余資料行單因素方差分析并行組間兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 各組各時(shí)間點(diǎn)mNSS評(píng)分結(jié)果，第14天起，各時(shí)間點(diǎn)NSCS組的評(píng)分明顯優(yōu)于模型組、假手術(shù)組（P＜0.05）

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較 立體定向注射膠原酶誘導(dǎo)大鼠腦出血后，大鼠迅速出現(xiàn)出血、對(duì)側(cè)偏癱等神經(jīng)功能缺損的表現(xiàn)，癥狀體征于術(shù)后1～3d達(dá)高峰，隨后逐漸恢復(fù)。NSCS組較模型組后14d及28d的mNSS評(píng)分且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 Brdu免疫熒光染色 熒光顯微鏡下可見(jiàn)Brdu免疫熒光染色陽(yáng)性的細(xì)胞明顯聚集分布于血腫周圍，血腫對(duì)側(cè)僅可見(jiàn)少量陽(yáng)性細(xì)胞散在分布。見(jiàn)圖2。

圖2 綠色免疫染色為陽(yáng)性，A為血腫周圍，B為血腫對(duì)側(cè)腦區(qū)（200×）

2.3 BDNF表達(dá)上升 BDNF在3組中均有表達(dá)，且在血腫周圍的表達(dá)量較高。免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞胞漿被染為棕褐色或棕黃色顆粒狀，陰性者除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，無(wú)棕黃色反應(yīng)物。BDNF在假手術(shù)組，模型組僅可見(jiàn)少量陽(yáng)性細(xì)胞，NSCS組較兩者增多。結(jié)果顯示，NSCS組高于組模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

2.4 GAP-43表達(dá)上升 GAP-43在各組中也均有表達(dá)，GAP-43在NSCS組較假手術(shù)組與模型組表達(dá)增多見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示NSCS組與假手術(shù)組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

3 討論

腦出血引起的神經(jīng)功能障礙，嚴(yán)重威脅人類健康和影響生活質(zhì)量。隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，干細(xì)胞其衍生物成為人類神經(jīng)系統(tǒng)難治性疾病——腦出血富有應(yīng)用前景的治療選擇之一［4］。

本實(shí)驗(yàn)NSCS干預(yù)組第14天及第28天其神經(jīng)功能評(píng)分顯著優(yōu)于模型組。從行為學(xué)上表明NSCS移植在腦出血模型中具有確實(shí)的治療作用。

BDNF是一類多功能的多肽生長(zhǎng)因子，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活、分化，以及軸突導(dǎo)向和突觸的功能［5］。BDNF激活高親和力受體TrkB后有助于神經(jīng)存活，還具有調(diào)節(jié)突觸的結(jié)構(gòu)和數(shù)量、促進(jìn)新形成突觸的發(fā)育和成熟、促進(jìn)樹(shù)突棘和軸突的生長(zhǎng)等作用。我們通過(guò)免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)到BDNF分泌增多，證實(shí)了NSCS分化的細(xì)胞具有促進(jìn)旁分泌的功能。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)立體定位向ICH大鼠移植NSCS，NSCS可促進(jìn)BDNF的表達(dá)增多。

GAP-43是一種廣泛分布在神經(jīng)系統(tǒng)中的胞膜磷酸蛋白質(zhì)［6］。GAP-43是可以促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育和再生的一個(gè)重要的內(nèi)在決定因子，它是由神經(jīng)元包體合成，與神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)密切相關(guān)，在神經(jīng)元發(fā)育和再生過(guò)程中，作為神經(jīng)元的損傷、修復(fù)及再生的重要分子標(biāo)志物，隨著神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)大量合成［7］。BDNF能夠促進(jìn)軸突生長(zhǎng)錐表面GAP-43和軸突骨架蛋白β-tublin表達(dá)的上調(diào)從而促進(jìn)軸突的延伸［8］。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，NSCS的移植能夠改善局部的微環(huán)境、上調(diào)BDNF并啟動(dòng)再生相關(guān)GAP-43的表達(dá)增多，進(jìn)而促進(jìn)腦出血后神經(jīng)功能的恢復(fù)。總之，我們以腦出血模型大鼠為研究對(duì)象，采用ICH患者來(lái)源的NSCS進(jìn)行移植治療。結(jié)果表明NSCS移植能有效改善ICH模型大鼠的神經(jīng)功能障礙，其機(jī)制為細(xì)胞替代、旁分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和促進(jìn)軸突再生等多個(gè)方面。

圖3 BDNF免疫組化染色，A假手術(shù)組，B模型組，NSCS組（400×）

圖4 GAP-43免疫組化染色，A假手術(shù)組，B模型組，NSCS組（400×）

圖5 BDNF及GAP-43免疫組化的灰度值，各組均為陽(yáng)性，但NSCS組較假手術(shù)組、模型組灰度值均增多（P＜0.05）

［1］Lindvall O，Kokaia Z.Stem cells for the treatment of neurological disorders［J］.Nature，2006，441（5）：1 094-1 096.

［2］Dénes A，F(xiàn)erenczi S，kovács kJ.Systemic inflammatory challen ges compromise survival after experimental stroke via augmenting brain inflammation，blood-brai barrier damage and brain oedema independently of infarct size［J］.J Neuroinflamm，2011，8（3）：164.

［3］Chen J，Li Y，Wang L，et al.Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats［J］.Stroke，2001，32（4）：1 005-1 011.

［4］Lindvall O，Kokaia Z.Stem cell research in stroke：How far from the clinic［J］Stroke，2011，42（8）：2 369-2 375.

［5］Cowansage KK，LeDoux JE，Monfils MH，et al.Brain-derived neurotrophic factor：a dynamic gatekeeper of neural plasticity［J］.Curr Mol Pharmacol，2010，3（1）：12-29.

［6］Paul DS，John DH.betall-tubulin and GAP 243mRNA expression in chro2nically injured neuronsof the red nucleusafter a second spinal cordinjury［J］.ExperimentalNeurology，2003，182（2）：537-547.

［7］Andrews EM，Tsai SY，Johnson SC，et al.Human adult bone marrow-derived somatic cell therapy results in functional recovery and axonal plasticity following stroke in the rat［J］.Exp Neurol，2008，211（23）：588-592.

［8］Husson I，Rangon CM，Lelievre V，et al.Gressens BDNF-induced white matter neuroprotection and stage-dependent neuronal survival following a neonatal excitotoxic challenge Cereb［J］.Cortex，2005，15（12）：250-261.