腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)帕金森病大鼠多巴胺能神經(jīng)元的影響

趙淑杰 朱雨嵐

1）北京民航總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 北京 100025 2）哈爾濱醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)內(nèi)科 哈爾濱 150080

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)變性病，雖然目前有許多治療藥物，但都不能改善其自然病程。尋找一種能延緩或逆轉(zhuǎn)病情發(fā)展的保護(hù)性治療措施是帕金森病治療所追求的重要目標(biāo)，國(guó)內(nèi)外研究表明，神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)體外培養(yǎng)的多巴胺能神經(jīng)元的存活和分化均有一定影響，不僅可促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元的存活，還能夠顯著降低6-OHDA對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的毒性作用，本文就BDNF對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的多巴胺能神經(jīng)元的影響進(jìn)行報(bào)告。

1 資料與方法

1.1 行為學(xué)觀察 所有大鼠術(shù)前常規(guī)進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，確認(rèn)無(wú)異常旋轉(zhuǎn)行為，生理鹽水對(duì)照組術(shù)后14d，基本上無(wú)旋轉(zhuǎn)行為。6-OHDA組在注射6-OHDA后24h旋轉(zhuǎn)行為＞10 r／min，術(shù)后14d，旋轉(zhuǎn)行為＞10r／min，6-OHDA＋BDNF組經(jīng)過(guò)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子注射術(shù)后14d，旋轉(zhuǎn)能力減慢，10只大鼠基本上旋轉(zhuǎn)5～8r／min，術(shù)后21d，10只大鼠旋轉(zhuǎn)能力仍為5～8r／min。見(jiàn)表1。

表1 大鼠注射術(shù)后旋轉(zhuǎn)行為變化表 （時(shí)間，r／min）

1.2 大鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)元數(shù)目的變化 鏡下觀察TH陽(yáng)性神經(jīng)元，TH陽(yáng)性神經(jīng)元主要見(jiàn)于生理鹽水組的黑質(zhì)，數(shù)量較多，胞體較大，呈錐體型或橢圓型，神經(jīng)元軸突明顯，（42.3±7.56）個(gè)／μm2（見(jiàn)圖1）。6-OHDA組大鼠黑質(zhì)的TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)明顯減少，（2.41±1.07）個(gè)／μm2；神經(jīng)元胞體腫脹，軸突少，細(xì)胞輪廓不清（見(jiàn)圖2）。2組差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且神經(jīng)元胞體輪廓及突起也不清晰。6-OHDA＋BDNF組神經(jīng)元數(shù)為（15.36±3.04）個(gè)／μm2，神經(jīng)元胞體比6-OHDA組明顯好轉(zhuǎn)，損傷恢復(fù)明顯（見(jiàn)圖3）。各組結(jié)果見(jiàn)表2，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異明顯。

1.3 紋狀體多巴胺含量變化 6-OHDA對(duì)黑質(zhì)紋狀體的損害還體現(xiàn)在使紋狀體多巴胺含量減少，6-OHDA＋BDNF組紋狀體內(nèi)多巴胺含量較6-OHDA組增高，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

圖1 生理鹽水組黑質(zhì)部TH陽(yáng)性神經(jīng)元（×200）

圖2 6-OHDA組黑質(zhì)部TH陽(yáng)性神經(jīng)元（×400）

圖3 6OHDA＋BDNF組黑質(zhì)部TH陽(yáng)性神經(jīng)元（×200）

表2 大鼠黑質(zhì)TH神經(jīng)元的變化 （個(gè)／μm2）

表3 大鼠紋狀體部多巴胺含量變化 （按濕重，μg／g）

2 討論

近年來(lái)不少研究揭示了PD的細(xì)胞凋亡證據(jù)［1-3］。將純的NTFs培養(yǎng)基體外培養(yǎng)胚胎多巴胺能神經(jīng)元，能明顯提高其存活率，減少細(xì)胞凋亡［4-6］。目前國(guó)外已經(jīng)開(kāi)始研究神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)體內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用［7］，并把其基因同酪氨酸羥化酶基因聯(lián)合起來(lái)，一方面既可促進(jìn)多巴胺合成，另一方面又能保護(hù)多巴胺能細(xì)胞免受損傷，取得了一定成果。Frim等［8］將BDNF基因介入到成纖維細(xì)胞，再將成纖維細(xì)胞提前移植于1-甲基-4-苯-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）毀損紋狀體的PD大鼠模型，可防止1-甲基-4苯基吡啶（MPTP）對(duì)大鼠的毒性作用，說(shuō)明其具有保護(hù)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的作用，這可能是通過(guò)逆軸突轉(zhuǎn)運(yùn)誘導(dǎo)細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制或增加線立體的功能發(fā)揮作用的。在用藥途徑上本研究避開(kāi)血腦屏障（blood brain barrier，BBB）將BDNF通過(guò)立體定向注入黑質(zhì)，與David的研究比較，藥物作用更直接，起效更快，而David等的方法是等移植細(xì)胞成活后，通過(guò)已經(jīng)介導(dǎo)了BDNF基因的成纖維細(xì)胞的自分泌和旁分泌，產(chǎn)生BDNF發(fā)揮作用。旋轉(zhuǎn)行為觀察方面，本實(shí)驗(yàn)與David等的研究相吻合，并且旋轉(zhuǎn)行為減少持續(xù)存在。且TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量、紋狀體多巴胺含量BDNF組比模型組也有顯著增加，因其能特異性保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受損傷，清除致病因子，因此神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可用于PD的治療［9］。

Rosenblad等［10］通過(guò)紋狀體和側(cè)腦室兩種途徑注入膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（NTFs），探討它們的神經(jīng)保護(hù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GDNF可提供幾乎92%的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)也采用藥物直接作用方式，將BDNF通過(guò)立體定向注射于黑質(zhì)致密部，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BDNF減輕6-OHDA對(duì)紋狀體多巴胺含量下降（6-OHDA＋BDNF組與6-OHDA組比較減輕20%），減輕6-OHDA對(duì)多巴胺能神經(jīng)元損傷（見(jiàn)表2）；治療前后行為學(xué)觀察對(duì)比，治療后癥狀明顯改善；大鼠黑質(zhì)致密部TH神經(jīng)元的變化說(shuō)明本課題治療組與PD模型組差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；紋狀體多巴胺含量觀察治療后與PD模型組差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)與Rosenblad等結(jié)果一致，即神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)多巴胺能神經(jīng)元有顯著的保護(hù)作用。我們分析BDNF主要通過(guò)以下幾種途徑保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元：（1）BDNF通過(guò)與受體結(jié)合使細(xì)胞內(nèi)鈣結(jié)合蛋白（Calbindin）及其mRNA含量增加［11］，與細(xì)胞內(nèi)超載鈣離子結(jié)合，并促進(jìn)其排出，保持細(xì)胞內(nèi)鈣的穩(wěn)定性，從而保護(hù)神經(jīng)元免受損傷。（2）BDNF、GDNF能促進(jìn)超氧化物歧化酶（SOD）及谷光甘肽過(guò)氧化物酶的生成并增強(qiáng)其活性，使自由基減少，從而減輕了自由基對(duì)神經(jīng)元的損傷。（3）研究表明，神經(jīng)元損傷與興奮性氨基酸——谷氨酸的過(guò)量釋放導(dǎo)致的谷氨酸興奮性毒性有直接關(guān)系。而神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)，分別受谷氨酸和GABA所介導(dǎo)，而B(niǎo)DNF可抑制興奮性遞質(zhì)特別是谷氨酸的釋放，減少細(xì)胞損傷。（4）NTFs還可通過(guò)阻止細(xì)胞色素C的釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)。因此，NTFs對(duì)PD患者多巴胺能細(xì)胞具有保護(hù)作用。

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