柿葉總黃酮的分離及對油脂抗氧化的研究

林國榮 羅素麗

（莆田學院環(huán)境與生物工程學院，莆田 351100）

柿葉總黃酮的分離及對油脂抗氧化的研究

林國榮 羅素麗

（莆田學院環(huán)境與生物工程學院，莆田 351100）

以柿葉粗提物為原料，采用HZ816型大孔吸附樹脂分離純化柿葉的黃酮類化合物。大孔樹脂HZ816純化柿葉黃酮的適宜工藝參數(shù)為：常溫流速2 BV上柱吸附，上樣質(zhì)量濃度5.229mg／mL，pH為3.10，洗脫流速為3 BV／h，乙醇體積分數(shù)為50%洗脫。柿葉黃酮抗氧化試驗表明柿葉黃酮類化合物可有效延緩油脂脂質(zhì)過氧化反應，其抗氧化性明顯優(yōu)于抗壞血酸，表明柿葉黃酮類化合物是一種很有潛力的天然、安全、高效的抗氧化劑。

柿葉 黃酮類化合物 分離 大孔樹脂 抗氧化

柿屬植物有柿（Diospyros KakiLinn）、君遷子（D．lotusLion）、油柿（D．oleiefraCherg）等，但以柿（DiospyroskkaiL．f）最常見。柿葉，為柿屬（DiospyrosL.）植物柿（Diospyros kaki L．f或persimmon）的葉片，味苦、性寒，其入藥始載于明《滇南本草》曰“經(jīng)霜葉敷臃瘡”［1］。

研究表明，柿葉中含有豐富的維生素，蘆丁以及鐵，鋅，鈣等對人體健康有益的非藥性營養(yǎng)成分，柿葉具有清熱解毒、改善血管的通透性等多種醫(yī)療保健功能［2］。柿葉的主要有效成分——黃酮類化合物，具有抗癌、抗氧化、抗菌等生理活性，柿葉黃酮具有明顯的抗氧化作用，在食品工業(yè)上可用作抗氧化劑等，在一定使用量條件下可與茶多酚、橙皮甙這些新型的天然抗氧化物質(zhì)相媲美［3］。隨著柿子葉的利用價值不斷的被挖掘，市場上不斷的利用柿葉加工制成了柿葉茶、柿葉奶茶、柿葉飲料等保健品，但是有關(guān)柿葉的有效成分的分離及其在食品工業(yè)上應用研究較少。油脂容易被氧化而影響食品質(zhì)量，而植物中黃酮類化合物良好的天然抗氧化性引起了人們高度重視，基于此，本研究以油脂的過氧化值（POV值）為考察指標，采用烘箱法測定了柿葉總黃酮對動植物油的抗氧化效果，以期為柿葉功能產(chǎn)品的開發(fā)和綜合利用，提高柿葉的經(jīng)濟附加值提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

柿葉：柿樹科（Ebenaceae）柿樹屬（Persimmonl）柿樹，新鮮葉子經(jīng)干燥碾碎后備用；天然大豆油：市售；純豬油：自制。

1.2 主要化學試劑與儀器

蘆?。褐袊镏破酚邢薰?；大孔吸附樹脂：HZ－801、HZ－816、D－101、HPD－100、AB－8、NKA－9等；低壓玻璃層析柱（Φ1.0 cm×20 cm）、DBS－100自動分部收集器；上海滬西分析儀器廠有限公司；BT－100蠕動泵：保定蘭格衡流泵有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELA N－1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，EYELA SB－1000數(shù)顯水浴鍋）：EYELA公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的繪制

蘆丁標準液的配制：精密稱取干燥至恒重的蘆丁標準品0.010 0 g，加50%的乙醇溶解，裝入50 mL容量瓶中，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得0.20mg／mL的蘆丁標準溶液。

標準曲線的制作：分別量取蘆丁標準溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL于10 mL的容量瓶中，搖勻，備用。準確吸取1.0 mL稀釋后的蘆丁溶液，加入1%三氯化鋁溶液，搖勻。加入2.0 mL水，搖勻，放置10 min，參比對照時，將稀釋后的蘆丁溶液換成水作為參比，在波長420 nm處測定各自的吸光度［4］。蘆丁濃度與吸光度線性關(guān)系良好，線性回歸方程為：C＝0．933A－0.004 8（R2＝0.999 1），式中：C為黃酮質(zhì)量濃度／（mg／mL）；A為吸光值。

1.3.2 柿葉黃酮物質(zhì)的提取

稱取100.0 g的柿葉，采用水提，固液比1∶10，溫度70℃，提取時間2 h，提取后過濾，備用。所得提取液黃酮質(zhì)量濃度為4.92mg／mL，提取量35.15mg／g。

1.3.3 柿葉黃酮的分離純化

研究表明，大孔樹脂吸附法是一種比較適合黃酮類物質(zhì)純化的方法，大孔樹脂對柿葉中總黃酮進行分離純化，工藝簡單可行［5－7］。本試驗考察了HZ－801、HZ806、HZ－816、D－101、HPD－100、AB－8、NKA－9 7種大孔樹脂對柿葉黃酮的吸附和洗脫能力，選出最適的大孔吸附樹脂。

1.3.3.1 大孔樹脂靜態(tài)篩選

分別量取5.0 mL處理好的HZ801、HZ806、HZ816、D101、HP100、AB－8、NKA－9大孔吸附樹脂［8］，裝入250 mL的三角瓶中，分別加入50.0 mL柿葉提取液，用保鮮膜封口，置于恒溫振蕩器中振蕩，震蕩6 h充分吸附后，測定吸附后的液體OD420nm值，然后將各瓶中混合液進行過濾，去除吸附后的液體，加入體積分數(shù)為50%的乙醇50.0 mL，封口置振蕩器中振蕩2 h，測定各樹脂解吸液中的OD420nm值，計算出其吸附率和洗脫率，選出分離純化柿葉黃酮最佳的大孔吸附樹脂［9］。

1.3.3.2 HZ816樹脂對柿葉黃酮的分離工藝考察

量取15 mL處理好HZ816大孔吸附樹脂，濕法裝柱。每次量取300 mL一定pH的柿葉黃酮提取液上柱，控制一定的流速，用分部收集器收集流出液。通過改變上樣液流速（2、3、4 BV／h）；上樣液質(zhì)量濃度（5.229、6.694、9.530mg／mL）和上樣液pH（3.1、4.5、6.0）的試驗，確定其最適上樣流速，上樣液濃度和pH。

按相同上樣條件進行吸附，通過改變洗脫流速（2、3、4 BV／h）和乙醇體積分數(shù)（40%、50%、60%）的試驗，考察其最適洗脫流速和洗脫劑濃度。

1.3.4 柿葉黃酮對油脂抗氧化試驗

精確稱取2～3 g混勻的試樣于250 mL錐形瓶中，記錄其質(zhì)量。在各錐形瓶中分別加入30 mL三氯甲烷－冰乙酸混合液，再加入1 mL飽和碘化鉀溶液，立即用保鮮膜封住瓶口，輕輕振蕩，置于暗處3 min。然后加水100 mL，振蕩后立即用0.002 mol／L硫代硫酸鈉標準溶液滴定，至淡黃色時，加入1 mL淀粉指示劑，繼續(xù)滴定至藍色消失為終點。按照上述方法進行空白對照滴定［10］。

過氧化值POV＝（V1－V2）×C×1 000／2×m

式中：V1為試樣消耗硫代硫酸鈉標準溶液體積／mL；V2為空白試驗消耗硫代硫酸鈉標準溶液體積／mL；C為硫代硫酸鈉標準溶液的濃度／mol／L；m為試樣的質(zhì)量／g。

1.3.4.1 柿葉黃酮對動物油脂抗氧化試驗

在小燒杯中分別加入用少量的無水乙醇溶解不同用量的柿葉黃酮（4、8、12mg）和4.0mg的抗壞血酸（作為陽性對照），然后各自加入40 g豬油，攪拌均勻，放入（60±1）℃恒溫箱中保存，每隔一定時間測定其過氧化值（POV，mmol／kg）［11］，以此表示油脂的氧化速度，比較不同濃度黃酮對動物油脂抗氧化作用。

1.3.4.2 柿葉黃酮對植物油抗氧化試驗

在小燒杯中分別加入用少量的無水乙醇溶解后不同用量的柿葉黃酮（0.5、1.0、1.5、2.0mg）和2.0mg的抗壞血酸（作為陽性對照），然后各自加入50 mL大豆油，攪拌均勻，放入（60±1）℃恒溫箱中保存，每隔一定時間取樣測定大豆油的POV值。

2 結(jié)果與分析

2.1 柿葉黃酮分離純化工藝的確定

2.1.1 柿葉黃酮富集純化大孔樹脂的確定

大孔樹脂的吸附性能對黃酮的純化影響很大，樹脂的極性和空間結(jié)構(gòu)（主要指孔徑、比表面積及孔容等）是影響吸附性能的重要因素。試驗所用樣品液黃酮含量5.0mg／mL，結(jié)果如表1。

表1 不同大孔樹脂對柿葉黃酮吸附率及洗脫率的比較／%

從表1可以看出，HZ816型樹脂對柿葉黃酮類化合物的分離富集效果較其他6種樹脂好，且容易洗脫，得到的黃酮類化合物的回收率也較高。故選擇HZ816大孔吸附樹脂作為柿葉黃酮的富集純化的介質(zhì)。

2.1.2 吸附流速對HZ816樹脂吸附柿葉黃酮的影響

不同吸附流速下黃酮吸附曲線見圖1。圖1曲線說明在各種流速下黃酮的濃度值都隨著上樣量的遞增而增加。剛開始樹脂的吸附量最大，然后慢慢下降直至樹脂飽和，曲線趨于平衡。隨著上樣流速的增加，吸附率越來越小，流速影響溶質(zhì)向樹脂表面擴散，決定了吸附效果。在相同的吸附時間里流速越小樹脂的吸附量越大。因為溶質(zhì)與樹脂的接觸時間越長，樹脂對溶質(zhì)的吸附越多，流失的就越少。所以4 BV／h流速吸附效果較差，2 BV／h流速的吸附效果最好，故HZ816大孔樹脂富集純化柿葉黃酮物質(zhì)的吸附流速為2 BV／h。

圖1 不同流速對柿葉黃酮的吸附曲線

2.1.3 上樣液質(zhì)量濃度對HZ816樹脂吸附柿葉黃酮的影響

不同上樣濃度條件下黃酮吸附曲線見圖2。從圖2可看出，質(zhì)量濃度為5.229mg／mL的漏出曲線十分平緩，上樣濃度越大，曲線越陡直，黃酮漏出越多。上樣濃度越小則吸附率越高，上樣濃度的大小與吸附率成反比，濃度越小越有利于黃酮與樹脂的充分接觸，當濃度過大時，由于孔容的限制，過多的黃酮會流失，當上樣液柿葉黃酮為5.229mg／mL時，其吸附率為91.82%，吸附效果最佳。故HZ816大孔樹脂吸附柿葉黃酮物質(zhì)的適宜質(zhì)量濃度為5.229mg／mL。

圖2 不同上樣濃度對柿葉黃酮的吸附曲線

2.1.4 上樣液pH值對HZ816樹脂吸附柿葉黃酮的影響

不同上樣液pH條件下黃酮吸附曲線見圖3。從圖3可以看出，上樣液的pH對黃酮的濃度也有一定的影響，3條曲線變化趨勢都趨于平穩(wěn)，pH為6.0和4.5的曲線在pH為3.1之上，漏出量明顯比較大，pH越小，吸附率越高，吸附效果越好。這是因為在酸性較強時形成“佯氧”，偏堿性的時候分子中酚羥基H＋易失去，形成離子結(jié)構(gòu)，不易被吸附［12］。pH為6.0和4.5的吸附率較差，pH為3.1的吸附率較好，綜合考慮樹脂吸附效果，3.1為最適吸附上樣液pH。

圖3 不同上樣pH對柿葉黃酮的吸附曲線

2.1.5 不同解吸流速對柿葉黃酮洗脫的影響

考察不同洗脫流速對柿葉黃酮的洗脫效果如圖4。從圖4可知在3 BV／h洗脫速率下洗脫曲線峰高，且圖形面積大，洗脫量大，洗脫成分相對集中，有利于富集純化。2 BV／h和4 BV／h富集量相對來說比較少，這是因為在適當流速下，乙醇能夠充分溶解被樹脂吸附的黃酮，但流速過快時，乙醇洗脫出來的黃酮量較少。故選擇3 BV／h作為大孔樹脂富集純化柿葉黃酮物質(zhì)的適宜洗脫流速。

圖4 不同洗脫速度對柿葉黃酮的洗脫曲線

2.1.6 洗脫劑乙醇不同體積分數(shù)對柿葉黃酮洗脫的影響

選擇不同的乙醇濃度洗脫柿葉黃酮，洗脫效果如圖5，由圖5可知3種不同濃度乙醇的洗脫曲線都有一個最高點，后幾管的曲線趨于平穩(wěn)，洗脫出來的量越來越少，用50%乙醇體積分數(shù)洗脫的柿葉黃酮折線圖峰較高，洗脫相對集中，洗脫量較大，40%和60%乙醇體積分數(shù)洗脫的曲線洗脫量較少，所以選擇50%體積分數(shù)乙醇洗脫為佳。

圖5 不同體積分數(shù)乙醇對柿葉黃酮的洗脫曲線

2.2 柿葉黃酮對油脂抗氧化活性的影響

2.2.1 柿葉黃酮對動物油脂抗氧化的影響

不同柿葉黃酮的量和維生素C對豬油的抗氧化作用結(jié)果如表2所示。由表2可知，柿葉黃酮對豬油具有明顯的抗氧化作用，這種作用隨著它在豬油中使用量的增大而增強，尤其在試驗后期（第10天以后），說明柿葉中的黃酮類化合物對豬油的抗氧化作用十分明顯。

表2 不同柿葉黃酮量和抗壞血酸對豬油的抗氧化比較

2.2.2 柿葉黃酮對植物油抗氧化的影響

在大豆油中分別加入不同柿葉黃酮量，與加入抗壞血酸的大豆油的抗氧化作用結(jié)果如表3，隨著時間的變化，加入不同黃酮含量的提取液POV值慢慢變大，但比空白對照的都要小，說明柿葉黃酮對大豆油有一定的抗氧化作用，而且POV值隨著黃酮含量的增大而減小，說明黃酮含量越大，抗氧化作用越大，加入2.0mg的柿葉提取液其抗氧化作用比加抗壞血酸的還要好。

表3 不同柿葉黃酮量與抗壞血酸對大豆油的抗氧化比較

3 結(jié)論

以柿葉粗提物為原料，考察各種大孔樹脂對總黃酮的動態(tài)吸附效率，篩選出了對柿葉總黃酮純化效果較好的大孔樹脂為HZ816，其吸附率為93.31%，洗脫率為92.55%。HZ816樹脂動態(tài)純化的較適工藝參數(shù)為：上柱流速為2 BV，上樣柿葉黃酮質(zhì)量濃度為5.229mg／mL及上樣液pH為3.10；洗脫流速3 BV，洗脫劑的乙醇質(zhì)量分數(shù)50%為較佳的洗脫條件。

對柿葉黃酮的抗氧化研究結(jié)果表明，柿葉黃酮的抗氧化性較強，這種作用隨著它在油脂中使用量的增大而抗氧化性增強。通過對豬油和大豆油的抗氧化效果試驗發(fā)現(xiàn)，柿葉黃酮對豬油抗氧化性能比抗壞血酸強，對大豆油試驗表明柿葉黃酮有一定的抗氧化作用，加入2.0mg柿葉黃酮的抗氧化作用可與加入抗壞血酸的稍強。試驗表明柿葉黃酮是一種很有潛力的天然、安全、高效的新型抗氧化劑。

［1］陳灝珠.實用內(nèi)科學［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：210－237

［2］中國降壓治療預防卒中再發(fā)研究協(xié)作組.腦血管病患者脈壓水平與腦卒中再發(fā)的關(guān)系［J］.中國循環(huán)雜志，2003，18（6）：284－287

［3］辛寧，豐杰，姚波，等.柿葉黃酮類提取分離及藥理作用研究概況［J］.中醫(yī)藥學報，2007，352（2）：49－51

［4］上官小東，王黨社.AlCl3－分光光度法測定銀杏黃酮的含量［J］.寶雞文理學院學報：自然科學版，2004，4：274－276

［5］曹萬新，陳燕.吸附樹脂法提取精制油茶皂甙工藝技術(shù)研究［J］.中國油脂，1999，12（4）：10－14

［6］趙曉東.一種純化黃酮的方法［J］.西南石油學院學報，2001，23（3）：61－63

［7］朱英，羅永明.大孔樹脂分離油茶皂苷和黃酮的研究［J］.林產(chǎn)化學與工業(yè)，2003，19（1）：40－42

［8］盧錦花，胡小玲，岳紅，等.大孔吸附樹脂對銀杏葉黃酮類化合物吸附及解吸的研究［J］.化學研究與應用，2002，19（5）：486－488

［9］朱中貴，蔡光明，張卓勇，等.大孔樹脂純化艾葉總黃酮的研究［J］.解放軍藥學學報，2009，25（1）：10－13

［10］糧油食品品質(zhì)分析（第二版）［M］.中國輕工業(yè)出版社，2000：449

［11］劉崢，陸樺.黃連素對油脂抗氧化作用的研究［J］.中國糧油學報，2007，22（3）：88－93

［12］張玲，劉青梅，楊性民，等.杜仲葉綠原酸總黃酮的分離純化及檢測［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學，2009（12）：122－125.

Separation and Antioxidation Efficacy of Persimmon Leaf Flavonoid

Lin Guorong Luo Suli
（Putian University College of Environmental and Biological Engineering，Putian 351100）

The experiment has taken persimmon leaf crude extractas rawmaterials.The flavonoids from persimmon leaf was purified bymacroporous adsorptive resin HZ816.The results showed that the dynamic adsorption and elution ability optimized technological parameter was normal temperature 2 BV adsorption column，the concentration of the sample 5.229mg／mL，pH 3.10，elution flow rate of3 BV，and 50%ethanol elution.Anti－oxidative effect of flavonoids from leaves of diospyros kaki on lard has been studied.The results showed that the flavonoids could delay the lipid peroxidation reaction of flavonoid extracted from leaves of diospyros kaki significantly.The antioxidative effect of flavonoid on lard was better than thatof VC，and the flavonoid should be a potential safe and effective antioxidant natural product.

persimmon leaf，flavonoid，isolation，macroporous resin，antioxidation

R284.2

A

1003－0174（2015）03－0062－05

福建省高校服務(wù)海西建設(shè)重點項目（2008HX01）

2013－12－08

林國榮，男，1969年出生，副教授，營養(yǎng)與生物制藥