復(fù)合酶法提取蕨麻多糖及其抗氧化活性研究

陳煉紅，張夢苑，伍 紅，孫 青，李 鍵

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué)外國語學(xué)院，四川 成都 610041；

3.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610041)

摘 要:確定了復(fù)合酶(纖維素酶、果膠酶、中性蛋白酶)提取蕨麻多糖的最佳工藝，并對其體外抗氧化活性進(jìn)行初步研究.在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9(33)正交實(shí)驗(yàn)和L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，分別得出復(fù)合酶的最佳配比和復(fù)合酶法提取蕨麻多糖的最佳提取工藝條件；采用清除·OH(羥基)自由基模型和O2一·(超氧陰離子)自由基模型評價(jià)了蕨麻多糖的抗氧化能力.結(jié)果表明:復(fù)合酶的最佳配比為:纖維素酶2.0%，木瓜蛋白酶1.0%，果膠酶2.0%；最佳工藝條件為:料液比為1:30、pH值為4.5，溫度為45℃，酶解時(shí)間為60min，此時(shí)蕨麻多糖的提取率最大為8.12%，同時(shí)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)也表明優(yōu)化得到的提取工藝穩(wěn)定可靠；蕨麻多糖對羥基自由基和超氧陰離子都具有較強(qiáng)的清除作用，并與濃度呈一定依賴關(guān)系，且對羥自由基的清除能力要比超氧陰離子自由基的清除能力強(qiáng).

關(guān)鍵詞:復(fù)合酶；蕨麻多糖；抗氧化

中圖分類號(hào):TS201.2；TS218 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):2095-4271(2015)04-0407-05

復(fù)合酶法提取蕨麻多糖及其抗氧化活性研究

陳煉紅1，張夢苑1，伍 紅1，孫 青2，李 鍵3

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué)外國語學(xué)院，四川 成都 610041；

3.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610041)

摘 要:確定了復(fù)合酶(纖維素酶、果膠酶、中性蛋白酶)提取蕨麻多糖的最佳工藝，并對其體外抗氧化活性進(jìn)行初步研究.在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9(33)正交實(shí)驗(yàn)和L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，分別得出復(fù)合酶的最佳配比和復(fù)合酶法提取蕨麻多糖的最佳提取工藝條件；采用清除·OH(羥基)自由基模型和O2一·(超氧陰離子)自由基模型評價(jià)了蕨麻多糖的抗氧化能力.結(jié)果表明:復(fù)合酶的最佳配比為:纖維素酶2.0%，木瓜蛋白酶1.0%，果膠酶2.0%；最佳工藝條件為:料液比為1:30、pH值為4.5，溫度為45℃，酶解時(shí)間為60min，此時(shí)蕨麻多糖的提取率最大為8.12%，同時(shí)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)也表明優(yōu)化得到的提取工藝穩(wěn)定可靠；蕨麻多糖對羥基自由基和超氧陰離子都具有較強(qiáng)的清除作用，并與濃度呈一定依賴關(guān)系，且對羥自由基的清除能力要比超氧陰離子自由基的清除能力強(qiáng).

關(guān)鍵詞:復(fù)合酶；蕨麻多糖；抗氧化

中圖分類號(hào):TS201.2；TS218 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):2095-4271(2015)04-0407-05

多糖(Polysaccharide)具有免疫調(diào)節(jié)、止血抑菌、抗疲勞等多種生理藥理作用[1-2]，有著廣闊的應(yīng)用前景.蕨麻又名人參果，屬于高原高寒地區(qū)生長的植物，藏醫(yī)稱“卓老沙僧”[3]，是一種理想的食藥兩用品[4].蕨麻多糖作為一種具有生物活性的食品功能因子，近年來已引起研究人員的關(guān)注.目前，對蕨麻多糖提取工藝的研究主要集中在水提法以及醇提法[5-7]，并未見復(fù)合酶法提取工藝優(yōu)化的系統(tǒng)報(bào)道.本試驗(yàn)采用復(fù)合酶法提取[8-10]，優(yōu)化提取工藝，并對其體外抗氧化活性進(jìn)行初步研究，從而為進(jìn)一步研究蕨麻多糖的生物活性及在食品中的應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕨麻(Potentilla anserina):秋季，采自四川巴塘草原.

纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶(均購于成都成華區(qū)怡語化學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)備經(jīng)營部).

無水乙醇、磷酸氫二鈉、檸檬酸、葡萄糖、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、水楊酸、硫酸亞鐵(均為分析純，購于成都迪康生物技術(shù)有限公司).

1.2 儀器

Delta320型pH計(jì)(Mettler-Toledo Group)；WFZ UV-2102PSC型紫外可見分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司)；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；Centrifuge 5804型離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；RE-85Z旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海青浦滬西儀器廠)；PL303分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；AKHL-III-24超純水機(jī)(成都康寧試驗(yàn)專用純水設(shè)備廠).

1.3 試驗(yàn)步驟

1.3.1 復(fù)合酶法提取蕨麻多糖的工藝流程

蕨麻→烘干→粉碎(過100目篩)→復(fù)合酶水解→離心(4000r/min、15min)→取上清液→真空濃縮→醇沉→離心→洗滌→干燥→稱重[11-12]

1.3.2 蕨麻多糖含量的測定

采用苯酚硫酸法對蕨麻多糖含量進(jìn)行測定[13]. 1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

依據(jù)參考文獻(xiàn)確定復(fù)合酶為纖維素酶2.0%、果膠酶1.5%和木瓜蛋白酶1.5%[14]，在復(fù)合酶的配比一定的條件下，分別考察不同料液比(g/ml)、pH值、酶解溫度和提取時(shí)間對蕨麻多糖提取率的影響.

1.3.4 蕨麻多糖的復(fù)合酶配比及提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)

1)復(fù)合酶配比對蕨麻多糖的影響

設(shè)計(jì)L9(33)正交實(shí)驗(yàn)，見表1，確定復(fù)合酶的最佳配比.

表1 蕨麻多糖復(fù)合酶配比正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Complex enzyme factors level table of orthogonal test

2)提取工藝優(yōu)化

設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，見表2，確定最佳提取工藝[15-16].

表2 提取工藝正交因素水平表Table 2 The orthogonal factor level table of extraction process

1.3.5 蕨麻多糖體外抗氧化活性研究

1)測定超氧陰離子自由基清除率

取4.5ml 50mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH8.2)和2ml蕨麻多糖提取液于試管中，混勻后于室溫條件下靜置4min，然后于325nm處測定吸光度，記作A0；取4.5ml 50mmol/L Tris-HCl緩沖溶液，立即加入1ml 3mmol/L鄰苯三酚并開始計(jì)時(shí)，在紫外分光光度計(jì)325nm處記錄第100s時(shí)的吸光值，記作A2；按照上述方法，取4.5ml 50mmol/L Tris-HCl緩沖溶液和1ml蕨麻多糖提取液，放置4min后加入1ml鄰苯三酚(3mmol/L)，計(jì)時(shí)，以10mmol/L HCl作為對照，在紫外分光光度計(jì)325nm處記錄第100s時(shí)的吸光度[17-18]，記作A1.

按式(1)計(jì)算蕨麻多糖清除超氧陰離子自由基清除率:

清除率(%)＝[1-(A1-A0)/A2]×100%(1)

2)測定羥自由基清除率

將蕨麻多糖用蒸餾水配成濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/ml的溶液，取2ml不同濃度的蕨麻多糖溶液，依次加入2ml 6mmol/L的FeSO4溶液、2ml 6mmol/L的H2O2，靜置10min，再加入6mmol/L的水楊酸溶液2ml，混勻后在室溫下靜置30min，于510nm處測其吸光值A(chǔ)1，然后用雙蒸水代替水楊酸測定吸光值記作A2，其中空白組用超純水代替多糖溶液，測定吸光值[19-20]，記作A0.

按下列式(2)計(jì)算蕨麻多糖清除羥自由基清除率:

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 不同料液比對蕨麻多糖得率的影響

圖1 料液比對蕨麻多糖得率的影響Fig.1 The effect of the material-water ratio onthe extraction efficiency of Potentilla anserina polysaccharide

由圖1可知，當(dāng)料液比小于1:20時(shí)，隨著料液比的增加，蕨麻多糖的得率逐漸增加；當(dāng)料液比大于1: 20時(shí)，隨著料液比的增加，蕨麻多糖的得率反而減少；料液比為1:20時(shí)，蕨麻多糖的得率最大，說明此時(shí)的料液比使蕨麻的溶解性達(dá)到最大.因此，通過試驗(yàn)結(jié)果可知當(dāng)料液比為1:20時(shí)，最有助于蕨麻多糖溶液的提取，所以最佳料液比為1:20.

圖2 不同pH對蕨麻多糖得率的影響Fig.2 The effect of pH on the extraction efficiency of Potentilla anserina polysaccharide

2.1.2 不同pH值對蕨麻多糖得率的影響pH的增加，蕨麻多糖的得率也呈增加的趨勢，但當(dāng)pH值大于4.5時(shí)，多糖得率呈減少的趨勢，說明pH值超出一定范圍后，酶的活性受到了影響，而pH值為4.5時(shí)蕨麻多糖的得率最大.pH值對酶活性的影響可通過改變酶的空間結(jié)構(gòu)，使酶失活，從而影響復(fù)合酶法蕨麻多糖的得率.

2.1.3 不同酶解時(shí)間對蕨麻多糖得率的影響

圖3 酶解時(shí)間對蕨麻多糖得率的影響Fig.3 The effect of hydrolysis time on the extraction efficiency of Potentilla anserina polysaccharide

酶解時(shí)間對蕨麻多糖得率的影響呈倒“U”形，當(dāng)酶解時(shí)間為80min時(shí)，蕨麻多糖的得率達(dá)到最大值，說明酶發(fā)揮了最大的作用，且蕨麻中多糖的得率最大.當(dāng)酶解時(shí)間少于80min時(shí)，三種酶各自發(fā)揮作用，

互相影響少，當(dāng)時(shí)間超過80min時(shí)，三種酶會(huì)相互作用，相互影響，反而對蕨麻中多糖的得率起反作用，使得蕨麻多糖得率降低.

2.1.4 不同酶解溫度對蕨麻多糖得率的影響

圖4 酶解溫度對蕨麻多糖得率的影響Fig.4 The effect of hydrolysis temperature on the extraction efficiency of Potentilla anserina polysaccharide

實(shí)驗(yàn)表明:當(dāng)酶解溫度為45℃時(shí)效果最好.當(dāng)溫度低于45℃時(shí)，得率隨溫度的升高呈逐漸增大的趨勢；當(dāng)溫度高于45℃，得率隨溫度的升高反而逐漸降低.在一定溫度范圍內(nèi)，酶的活性隨著溫度升高而升高，反應(yīng)速度加快，當(dāng)溫度升高超出閾值時(shí)，酶蛋白變性失活，從而使酶的活力降低.

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

2.2.1 蕨麻多糖復(fù)合酶最佳配比的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

通過對蕨麻多糖復(fù)合酶的配比進(jìn)行正交試驗(yàn)，得出結(jié)果見表3.

表3 L9(33)正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 3 Results and analysis of L9(33)orthogonal test on polysaccharides extraction conditions

由表3可以看出，影響蕨麻多糖得率的復(fù)合酶因素中:復(fù)合酶的配比為A＞C＞B，即纖維素酶＞木瓜蛋白酶＞果膠酶，即在這三種酶中，對蕨麻多糖得率影響最大的是纖維素酶，分析原因可能是因?yàn)橹参锛?xì)胞的細(xì)胞壁主要成分是纖維素，通過對細(xì)胞壁的破壞從而更有利于多糖的溶解.通過正交試驗(yàn)極差分析得出的最佳酶配比為A3B2C1，但是從9個(gè)處理中直觀的找出最優(yōu)水平為9號(hào)處理，即A3B3C2，試驗(yàn)指標(biāo)值為6.12.所以最佳酶配比為纖維素酶為2.0%，木瓜蛋白酶為1.0%，果膠酶為2.0%.

2.2.2 提取條件的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

蕨麻多糖的正交實(shí)驗(yàn)是在單因素試驗(yàn)和復(fù)合酶配比的正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取四因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，得到的結(jié)果見表4.

為確定復(fù)合酶的最佳配比，設(shè)計(jì)了復(fù)合酶最佳配比的正交試驗(yàn)，得到了三種復(fù)合酶的最佳配比，然后在此基礎(chǔ)上對酶解的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化.通過單因素試驗(yàn)，設(shè)計(jì)四個(gè)單因素且每個(gè)因素選取3個(gè)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)，由表4可知，對蕨麻多糖得率影響由大到小依次為:料液比、溫度、pH值和酶解時(shí)間，通過極差分析得出的最佳提取工藝條件為A3B2C2D1，即最佳料液比為1:30，pH值為4.5，溫度為45℃，酶解時(shí)間為60min.

表4 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 4 Results and analysis of L9(34)orthogonal test on polysaccharides extraction conditions

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在極差分析得到的最佳理論條件(即料液比1:30、pH4.5、酶解溫度45℃、酶解時(shí)間60min)下進(jìn)行三次平行試驗(yàn)，結(jié)果表明:最佳理論條件A3B2C2D1的多糖得率平均為8.12%，比正交試驗(yàn)結(jié)果A3B3C2D1的得率(8.03%)高，說明提取的最佳工藝為A3B2C2D1.

2.3 蕨麻多糖的抗氧化活性

圖5 對超氧陰離子自由基的清除率的影響Fig.5 Effect of superoxide anion free radical scavenging

2.3.1 采用超氧陰離子自由基清除率的測定確定抗氧化性能由圖5可以看出，在蕨麻多糖的質(zhì)量濃度為0.1 -0.4mg/ml之間時(shí)，清除超氧陰離子自由基的能力隨著濃度的增加而增加；而當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5mg/ml時(shí)，清除率明顯下降，因此，蕨麻多糖對超氧陰離子自由基有較好的清除能力即有一定的抗氧化性能.

圖6 對羥自由基的清除作用的影響Fig.6 Effect of hydroxyl free radical scavenging

2.3.2 采用羥自由基清除率的測定確定抗氧化性能隨著蕨麻多糖濃度的增大，對羥自由基的清除作用逐漸增強(qiáng)，說明蕨麻多糖具有良好的抗氧化性能，且由圖可知，對羥自由基的清除能力與其濃度具有明顯的量效關(guān)系，因此，對羥自由基有一定的清除作用即具有較好的抗氧化性能.

3 結(jié)論

使用復(fù)合酶法提取蕨麻多糖，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別對復(fù)合酶配比和蕨麻多糖提取工藝進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化多糖得率，我們得出:酶的最佳配比為纖維素酶2.0%，木瓜蛋白酶1.0%，果膠酶2.0%；復(fù)合酶法提取蕨麻多糖的優(yōu)化工藝條件為:最佳料液比為1:30，最佳pH值為4.5，最佳溫度為45℃，最佳酶解時(shí)間為60min，在這種條件下，蕨麻多糖得率為8.12%，與一般的水浸提法多糖得率的2.54%[25]相比，多糖含量近乎提高了3倍，說明使用復(fù)合酶法可大大提高蕨麻多糖的提取率.蕨麻多糖的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，蕨麻多糖具有抗氧化活性，且對不同自由基的清除能力不同，其中對羥自由基的清除能力要比超氧陰離子自由基強(qiáng).

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(責(zé)任編輯:李建忠，付強(qiáng)，張陽，羅敏；英文編輯:周序林，鄭玉才)

Extraction and antioxidant activities of polysaccharides from Potentilla anserina with combined-enzyme method

CHEN Lian-hong1，ZHANG Meng-yuan1，WU Hong1，SUN Qing2，LI Jian3
(1.School of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.；2.School of Foreign Languages，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.；
3.Institute of Qinghai-Tibetan Plateau，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.)

The extraction and antioxidant activities of polysaccharides from Potentilla anserina with combined-enzyme(cellulase，Pectinase，papain)method were studied.Single factor experiments were conduced to examine the ratio of the solid-liquid，pH value，temperature by enzymatic hydrolysis，extracting time，which provided optimum reaction conditions for extraction of polysaccharides in Potentilla anserina.The best ratio of combined enzymes and the effects of extraction temperature，extraction time，pH value，the ratio of solid-liquid on yield rate of polysaccharides were determined through orthogonal test and its antioxidant activities were tested by·OH and O2-·radical scavenging experiments.The best ratio of combined enzymes was cellulase of 2.0%，papain of 1.0%，and pectinase of 2.0%.The optimum reaction condition was temperature of 45℃，pH value of 4.5，time of 60 min，the solid-liquid ratio of 1:30，the extraction rate reached 8.12%.This study developed the best extraction process of polysaccharides from Potentilla anserina with combined-enzyme method.The result shows that polysaccharides has good scavenging effect on·OH and O2-·，and the scavenging effect of·OH is better than that of O2-·.

complex enzyme；Potentilla anserina；polysaccharide；antioxidantion

10.11920/xnmdzk.2015.04.003

2015-05-21

陳煉紅(1967-)，女，藏族，成都人，副教授，研究方向?yàn)槊褡迨称焚Y源開發(fā)與研究；E-mail:lianhong_chen＠163.com

李鍵(1967-)，男，教授，研究方向?yàn)槊褡迨称焚Y源開發(fā)與研究；E-mail:lijiangracy＠yahoo.com

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)項(xiàng)目(201203009)