三個(gè)牦牛品種(類群)尿苷一磷酸合成酶缺乏癥的檢測(cè)

于 淼，金素鈺，黃 林，蔣忠榮，劉 曦，鄭玉才

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川省甘孜州畜牧科學(xué)研究所，四川 康定 626000)

三個(gè)牦牛品種(類群)尿苷一磷酸合成酶缺乏癥的檢測(cè)

于 淼1，金素鈺1，黃 林1，蔣忠榮2，劉 曦2，鄭玉才1

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川省甘孜州畜牧科學(xué)研究所，四川 康定 626000)

檢測(cè)牦牛中是否存在尿苷一磷酸合成酶缺乏癥(DUMPS).實(shí)驗(yàn)選取分布于四川省的昌臺(tái)牦牛、九龍牦牛、麥洼牦牛三個(gè)品種(類群)共100頭，從血液中提取基因組DNA，采用常規(guī)PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行DUMPS的遺傳缺陷檢測(cè).首先擴(kuò)增牦牛尿苷一磷酸合成酶基因部分片段，再用限制性內(nèi)切酶AvaⅠ酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，通過(guò)酶切條帶數(shù)確定牦牛群體中是否存在DUMPS攜帶者.結(jié)果顯示，所檢測(cè)的100頭牦牛PCR產(chǎn)物的酶切條帶均為3條，為正常純合子，未發(fā)現(xiàn)DUMPS攜帶者.

牦牛；尿苷一磷酸合成酶缺乏癥；PCR-RFLP

尿苷一磷酸合成酶缺乏癥(Deficiency of uridine monophosphate synthase，DUMPS)是牛中的一種常染色體遺傳缺陷病，為單基因隱性遺傳疾病.Schwenger等發(fā)現(xiàn)該遺傳病雜合子C-末端編碼405處氨基酸的密碼子存在1個(gè)C→T點(diǎn)突變，原編碼精氨酸的密碼子CGA轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子TGA[1].該病攜帶者因基因突變不能將乳清酸轉(zhuǎn)化為鳥苷酸，瓜氨酸積累引起高氨血癥，使致病純合子犢牛在出生一周內(nèi)死亡，或者母牛妊娠40 d左右流產(chǎn)[2-3].

由于隱性遺傳病的攜帶者表現(xiàn)正常，因此難以發(fā)現(xiàn).DUMPS發(fā)現(xiàn)于荷斯坦牛中，攜帶該病基因的優(yōu)質(zhì)種公牛的精液，因人工授精技術(shù)的廣泛應(yīng)用，有可能導(dǎo)致DUMPS病在較大范圍內(nèi)傳播.國(guó)內(nèi)已有檢測(cè)出荷斯坦牛攜帶DUMPS的報(bào)道，而關(guān)于牦牛中是否存在DUMPS尚未見報(bào)道.牦牛是青藏高原及毗鄰高寒地帶特有的牛種，是當(dāng)?shù)啬撩裰匾纳钯Y料和創(chuàng)造財(cái)富的生產(chǎn)資料.研究牦牛種群中是否存在DUMPS，對(duì)牦牛的育種和改良等工作具有實(shí)際意義.利用PCR -RFLP方法檢測(cè)DUMPS雜合子，已在美國(guó)、歐洲等地廣泛使用.該方法對(duì)牛的基因型進(jìn)行分型，簡(jiǎn)單快速，不受奶牛的年齡、性別等因素影響[4-6].

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)牦牛和樣品的采集

選取分布于四川省三個(gè)地區(qū)的成年健康牦牛(Bos grunniens)100頭，其中九龍牦牛40頭，昌臺(tái)牦牛30頭，麥洼牦牛30頭，分別飼養(yǎng)于九龍縣、紅原縣和白玉縣.通過(guò)頸靜脈采血，用肝素抗凝，冰瓶帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存至分析.

1.2 基因組DNA的提取

TaKaRa DNA提取試劑盒購(gòu)自寶生物(大連)有限公司，按試劑盒操作指南從全血中提取牦?；蚪MDNA.

1.3 尿苷一磷酸合成酶(UMPS)基因的PCR擴(kuò)增

PCR引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成，采用Schwenger等設(shè)計(jì)的引物[7]，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為108 bp，序列為:UMPS-F:5′-GCAAATGGCTGAAGAACATTCTG-3′，UMPS-R:5′-GCTTCTAACTGAACTCCTCGAGT-3′.用Eppendorf AG 22331 Hamburg PCR儀擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為25 μL: 2×Taq PCR MasterMix酶12.5 μL，超純水9.5 μL，上、下游引物各0.8 μL，DNA模板1.4 μL.擴(kuò)增條件: 94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min.用3%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，60 V電泳40 min.

PCR產(chǎn)物通過(guò)基因克隆方法測(cè)序.用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司生產(chǎn))對(duì)目的條帶進(jìn)行回收，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定回收片段的DNA濃度.pMD?19-T Vector(TaKaRa公司生產(chǎn))連接目的基因后，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，在培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑出單一菌落于液體培養(yǎng)基內(nèi)搖菌培養(yǎng).菌液送予上海生工公司進(jìn)行測(cè)序.

1.4 酶切分型

酶切反應(yīng)體系:PCR產(chǎn)物10 μL，Ava I 1 μL，超純水9 μL，10×buffer 1 μL.混勻后于37℃酶切過(guò)夜.酶切產(chǎn)物用4%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，50 V電泳50 min.

AvaI酶識(shí)別序列位點(diǎn)為5′-CYCGRG-3′，因此荷斯坦牛的PCR擴(kuò)增序列酶切后分為三種情況:正常純合子基因型為CC，酶切后得到53 bp、36 bp、19bp共3條帶；患病雜合子基因型為CT，酶切后得到89bp、53 bp、36 bp、19 bp共4條帶；患病純合子基因型為TT，酶切后得到89 bp、19 bp兩條條帶[8].

2 結(jié)果與分析

2.1 尿苷一磷酸合成酶基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

100頭牦牛的基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳分離，獲得了同預(yù)期分子量大小相近的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1).

圖1 牦牛UMPS基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳泳道1～4為牦牛樣品，M為DNA markerFig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products amplifying UMPS gene of yak Lanes 1 to 4:yak samples，M:DNA marker

裁掉克隆測(cè)序結(jié)果中載體的固有序列，再與上、下游引物進(jìn)行比對(duì)，得到牦牛UMPS基因的部分編碼區(qū)序列，長(zhǎng)度為108 bp，用DNAMAN軟件將PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與荷斯坦牛UMPS基因?qū)Ρ?圖2)，顯示二者相似性為99.07%.其中的1個(gè)堿基不同，是在設(shè)計(jì)引物時(shí)將G改為C，從而引入一個(gè)酶切位點(diǎn)(CYCGRG)，因此，實(shí)驗(yàn)所獲得的牦牛和荷斯坦牛UMPS基因片段序列是相同的.牦牛與荷斯坦牛的酶切位點(diǎn)是一致的，因此酶切后非患病純合子為3條帶，雜合子為4條帶.

2.2 檢測(cè)分型結(jié)果

對(duì)三個(gè)品種(類群)的100頭牦牛的尿苷一磷酸合成酶基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，凝膠電泳上均顯示為3條區(qū)帶，為正?；蚣兒献樱窗l(fā)現(xiàn)DUMPS攜帶者(圖3).

圖2 牦牛與荷斯坦牛UMPS基因片段的序列比對(duì)Fig.2 Alignment of partial sequence of UMPS gene of yak and Holstein cattle

圖3 牦牛UMPS基因PCR產(chǎn)物酶切的瓊脂糖凝膠電泳圖泳道1～4是正常牦牛的條帶型，M為DNA markerFig.3 Agrose gelelectrophoresis of enzyme digested PCRproduct amplifying UMPS gene of yak Lanes 1 to 4:band types of normal yaks，M:DNA marker

3 討論

本研究采用PCR-RFLP方法檢測(cè)，用PCR擴(kuò)增出可能出現(xiàn)突變的基因片段，再用特異的內(nèi)切酶切割，由于存在特定位點(diǎn)的堿基突變產(chǎn)生不同長(zhǎng)度，直接用凝膠電泳分型[9].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用此方法檢測(cè)牦牛中是否存在DUMPS攜帶者，方法簡(jiǎn)便，分型時(shí)間短.雖然在3個(gè)牦牛品種(類群)中未發(fā)現(xiàn)DUMPS攜帶者，這是值得慶幸的，但也應(yīng)對(duì)該遺傳病予以重視.公牛攜帶者不會(huì)表現(xiàn)出癥狀，若未檢測(cè)到而用于配種，其隱性有害基因則會(huì)在牛群中快速傳播，給畜牧業(yè)造成很大經(jīng)濟(jì)損失.1987年美國(guó)公牛Happy-Herd Beautician因?yàn)槠渖a(chǎn)能力排行全美第五，其凍精被廣泛用于與各國(guó)當(dāng)?shù)嘏５娜斯な诰牧?，?dǎo)致北美洲和歐洲出現(xiàn)很多隱性基因攜帶者(美國(guó)438頭、歐洲314頭)[10].Jon-Red是上世紀(jì)80年代末期美國(guó)著名的公牛，其西門塔爾牛后代均攜帶DUMPS突變基因，在美國(guó)和歐洲分別檢測(cè)到101頭和84頭[11].國(guó)內(nèi)荷斯坦牛中檢測(cè)到DUMPS攜帶者也時(shí)常見報(bào)道.在臺(tái)灣1468頭荷斯坦牛中檢測(cè)到2頭隱性突變基因攜帶者[12].謝巖等人檢測(cè)了全國(guó)14個(gè)省共計(jì)519頭荷斯坦公牛凍精樣品，發(fā)現(xiàn)DUMPS攜帶者比例為0.17%，且是美國(guó)公牛Skokie sensation Ned的后代[13].梁若冰等檢測(cè)了來(lái)自全國(guó)27個(gè)牛場(chǎng)的691頭荷斯坦公牛的血樣，共發(fā)現(xiàn)1頭雜合子母牛[14].

國(guó)內(nèi)外報(bào)道的DUMPS發(fā)生頻率大約在0.2%～2.5%范圍內(nèi)[15]，盡管目前沒(méi)有在牦牛群體中發(fā)現(xiàn)該遺傳病攜帶者，但鑒于牦牛的雜交改良在青藏高原牧區(qū)的應(yīng)用，也須注意DUMPS突變基因的檢測(cè).牦牛若與荷斯坦牛進(jìn)行雜交改良，更應(yīng)注意檢測(cè)DUMPS攜帶者.同時(shí)，對(duì)牦牛DUMPS的檢測(cè)，應(yīng)擴(kuò)大牦牛的品種、數(shù)量和分布區(qū)范圍，尤其是經(jīng)過(guò)種間雜交改良的群體，以確保該遺傳病不在牦牛中發(fā)生.

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(責(zé)任編輯:李建忠，付強(qiáng)，張陽(yáng)，羅敏；英文編輯:周序林，鄭玉才)

Detection of deficiency of uridine monophosphate synthase in three yak breeds or population

YU Miao1，JIN Su-yu1，HUANG Lin1，JIANG Zhong-rong2，LIU Xi2，ZHENG Yu-cai1
(1.School of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.；2.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine of Ganzi Prefecture，Kangding 626000，P.R.C.)

The aim of the study is to detect the occurence of yaks carrying deficiency of uridine monophosphate synthase (DUMPS).A total of 100 yaks belonging to three breeds or population in Sichuan Province(Changtai yak，Jiulong yak and Maiwa yak)were used，Genomic DNA was extracted from the blood，and PCR-RFLP was employed to screen the possible occurrence of DUMPS.Ava I was used to digest PCR product generated by amplification of genomic DNA using DUMPS specific primers，and the genotypes were visualized according to the sizes of the fragments.The results showed that no carrier of DUMPS was found among the 100 yaks examined，normal homozygous DUMPS allele exhibited three fragments.

yak；deficiency of uridine monophosphate synthase；PCR-RFLP

S823；S852.23

A

2095-4271(2015)04-0403-04

10.11920/xnmdzk.2015.04.002

2015-05-04

鄭玉才(1965-)，男，內(nèi)蒙古人，教授，博士，研究方向:高原動(dòng)物生化與分子遺傳；E-mail:yucaizheng＠hotmail.com.

國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(編號(hào):201203010)