腫瘤血管抑制劑DX-1002結(jié)構(gòu)的NMR確證

陳芙蓉，寧 欣，張玉霞，李 丹，林 潔，雍智全，徐小平

（1.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041；2.東莞達(dá)信生物技術(shù)有限公司，廣東 東莞 523808）

0 引 言

DX-1002 的化學(xué)名為（E）-3-（3″-羥基-4″-甲氧苯基）-2-（3′，4′，5′-三甲氧基苯基）丙烯酸正丁銨鹽，分子式為：C23H31NO7；分子量為 433.21，是 Compretastatin類化合物的新衍生物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

Compretastatin類化合物是Petti小組等從南非Combretum caffrum樹干中提取分離的具有抗腫瘤活性的二苯乙烯類化合物[1-3]。與傳統(tǒng)的直接作用于癌細(xì)胞靶點(diǎn)的細(xì)胞毒類化療藥不同，Compretastatin類化合物可靶向作用于腫瘤的血管，引起內(nèi)皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上的改變，從而阻塞腫瘤微血管，達(dá)到抑制腫瘤的目的[3-9]。目前，同類型的化合物已有CompretastatinA-4P（CA4P）作為前體藥物進(jìn)入臨床II-III期試驗(yàn)[2]。然而，這類化合物最大的缺陷是母體結(jié)構(gòu)，即CA4的溶解性極差，雖然經(jīng)磷酸酯化后以二鈉鹽的形式增加了水溶性，但是磷酸鹽的引入不僅可能帶來(lái)一定的不良反應(yīng)，而且降解后的母體溶解性同樣低，嚴(yán)重限制了CA4P向其他口服劑型開發(fā)的可能，僅能成為靜脈注射劑。為此，DX-1002在研發(fā)時(shí)著重解決了本類化合物的溶解性問題，以溶解性更好的銨鹽替代了CA4P的前體結(jié)構(gòu)，不僅藥理活性更優(yōu)且毒副反應(yīng)更低。由于增加了活性母體的溶解性，使DX-1002化合物適合于制備各種劑型，特別是口服制劑，成為一個(gè)極具開發(fā)價(jià)值的腫瘤血管靶向抑制劑。為了明確本品化學(xué)結(jié)構(gòu)，本文擬采用NMR技術(shù)檢測(cè)DX-1002的NMR譜，同時(shí)結(jié)合本品質(zhì)譜和紅外光譜吸收等特征光譜的驗(yàn)證[10]，首次解析了本品的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖1 DX-1002的結(jié)構(gòu)圖

1 儀器與試劑

1.1 儀 器

Varian UNITY INOVA型400核磁共振譜儀（美國(guó)瓦里安公司）；布魯克道爾頓Bio-TOF Q質(zhì)譜儀（美國(guó)布魯克-道爾頓儀器公司）；意大利CARLO ERBA 1106元素分析儀（意大利）；Nicolet Impact 410型紅外光譜儀（美國(guó)Nicolet儀器公司）。

1.2 試 劑

氘代水（D2O）：NMR專用試劑。

1.3 樣 品

DX-1002精制品的批號(hào)為010203，含量≥99.75%（HPLC法），購(gòu)于東莞安好醫(yī)藥科技有限公司。

2 核磁共振譜

2.1 核磁共振氫譜（1H-NMR）

根據(jù)氫譜（見圖2），結(jié)合gCOSY譜，對(duì)樣品DX-1002各個(gè)氫原子的1H譜進(jìn)行歸屬：

1）在1H-MNR譜中，共有11組峰，從低場(chǎng)到高場(chǎng)積分比為 3∶2∶2∶2∶9∶3∶2∶1∶1∶1∶1，DX-1002 分子結(jié)構(gòu)中的27個(gè)質(zhì)子在圖譜上體現(xiàn)，4個(gè)活潑氫被氘代。

2）δ0.832為一組二重峰，質(zhì)子數(shù)為3，同時(shí)gCOSY譜顯示，該質(zhì)子與b-H質(zhì)子相關(guān)，推測(cè)為a-CH3；δ1.329為一組二重峰，質(zhì)子數(shù)為2，gCOSY譜顯示，該質(zhì)子除與a-H質(zhì)子相關(guān)外，還與c-H相關(guān)，推測(cè)為b-CH2；δ1.546為一組二重峰，質(zhì)子數(shù)為2，gCOSY譜顯示，該質(zhì)子與b-H質(zhì)子和d-H質(zhì)子相關(guān)，推測(cè)為c-CH2；δ2.914為一組二重峰，質(zhì)子數(shù)為2，該質(zhì)子與c-H質(zhì)子相關(guān)，推測(cè)為d-CH2。由此，可以推斷這4組質(zhì)子為正丁基上的質(zhì)子。

3）δ3.593為一組二重峰，質(zhì)子數(shù)為 9，gCOSY 譜顯示，該質(zhì)子與 4″-OCH3和 2′，6′-H 質(zhì)子相關(guān)，推測(cè)為 3′，4′，5′-OCH3；δ3.749 為一組二重峰，質(zhì)子數(shù)為 3，gCOSY 譜顯示，該質(zhì)子與 3′，4′，5′-OCH3和 5″-H 質(zhì)子都相關(guān)，推測(cè)為4″-OCH3。這兩組甲氧基上的質(zhì)子相互影響，以致在圖譜中出現(xiàn)了一個(gè)又強(qiáng)又復(fù)雜的多峰體系，與DX-1002的化學(xué)結(jié)構(gòu)相符。

4）δ6.375為一組單峰，此峰尖銳，質(zhì)子數(shù)為 2，gCOSY 譜顯示，該質(zhì)子與 3′，4′，5′-OCH3質(zhì)子和6″-H質(zhì)子相關(guān)，推測(cè)為 2′，6′-H，與 DX-1002 的結(jié)構(gòu)相符。

圖2 DX-1002的1H-NMR譜

5）δ6.386為一組單峰，質(zhì)子數(shù)為 1，gCOSY 譜顯示，該質(zhì)子與3-H質(zhì)子和6″-H質(zhì)子具有相關(guān)性，推測(cè)為 2″-H。

6）δ6.462為一組二重峰，質(zhì)子數(shù)為 1，gCOSY 譜顯示該質(zhì)子與 2′，6′-H 質(zhì)子和 5″-H 質(zhì)子相關(guān)，推測(cè)為 6″-H。 δ6.499為一組二重峰，質(zhì)子數(shù)為 1，gCOSY譜顯示，該質(zhì)子與4″-OCH3質(zhì)子和6″-H質(zhì)子相關(guān)，推測(cè)為 5″-H。δ7.346為一組單峰，質(zhì)子數(shù)為 1，gCOSY譜顯示，該質(zhì)子與2″-H和6″-H相關(guān)，推測(cè)為3-H。

由上述解析綜合可得出DX-1002結(jié)構(gòu)中所有氫原子的歸屬：δ0.832（d，3H，a-CH3），δ1.329（d，2H，b-CH2），δ1.546（d，2H，c-CH2），δ2.914（d，2H，d-CH2），δ3.593（d，9H，3′，4′，5′-OCH3），δ3.749（d，3H，4″-OCH3），δ6.375（s，2H，2′，6′-H），δ6.386（s，1H，2″-H），δ6.462（d，1H，5″-H），δ6.499（d，1H，6″-H），δ7.346（s，1H，3-H）；另外還有4個(gè)活潑氫，在圖譜中未能表現(xiàn)出來(lái)，在D2O中被D氫取代。該信號(hào)歸屬符合DX-1002的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.2 核磁共振碳譜（13C-NMR）

1）以重水為溶劑測(cè)得13C-NMR的圖譜（見圖3）中，共有21組峰：其中DEPT圖譜表現(xiàn)出伯碳有4組共5個(gè)碳原子；仲碳有3組共3個(gè)碳原子；叔碳有5組共6個(gè)碳原子；季碳有8組共為9個(gè)碳原子的峰。故樣品中共有23個(gè)碳原子，這與DX-1002的分子式相符。

2）δ15.103為伯碳峰，且在gHMQC譜上顯示與a-CH3的質(zhì)子近程相關(guān)，在gHMBC譜上顯示與b-CH3，c-CH3的質(zhì)子遠(yuǎn)程相關(guān)，故可推定為 a-CH3；δ21.34，δ31.101，δ41.526 均為烷烴仲碳，根據(jù) DX-1002 的結(jié)構(gòu)可推定其分別為 b-CH2，c-CH2，d-CH2。確定這 4 個(gè)碳原子構(gòu)成正丁基（C4H9-）。

3）δ57.788 為伯碳峰，且與 4′-OCH3上的質(zhì)子近程相關(guān)，與4″-OCH3的質(zhì)子遠(yuǎn)程相關(guān)，推測(cè)為4′-OCH3上的伯碳原子；同時(shí)δ58.186為二重峰，表示有兩個(gè)伯碳原子，且與 3′，5′-OCH3的質(zhì)子近程相關(guān)，與 4″-OCH3上的質(zhì)子遠(yuǎn)程相關(guān)，推測(cè)為 3′，5′-OCH3的 2 個(gè)伯碳原子；同理，δ63.341為4″-OCH3上的伯碳原子。

4）δ109.224為叔碳峰，峰高且尖，為二重峰，與芳環(huán)2′，6′-H上的質(zhì)子存在近程相關(guān)，與3-H的質(zhì)子遠(yuǎn)程相關(guān)，推定此碳為芳環(huán)2′，6′的二個(gè)叔碳原子。

5）δ113.626 為叔碳峰，其與 5″-H 位上的質(zhì)子近程相關(guān)，與6′-H上的質(zhì)子具有遠(yuǎn)程相關(guān)性，推定為5″-C。

6）δ118.900為叔碳峰，與2″-H的質(zhì)子近程相關(guān)，與3-H和6′-H的質(zhì)子具有遠(yuǎn)程相關(guān)性，推定為2″-C。

7）δ125.518為叔碳峰，與6″-H的質(zhì)子近程相關(guān)，與5″-H的質(zhì)子存在著遠(yuǎn)程相關(guān)性，推定其為6″-C。

8）δ130.918 為季碳峰，只與 2″，6″-H 的質(zhì)子存在著遠(yuǎn)程相關(guān)性，推定其為1″-C。

9）δ137.718為叔碳峰，與3-H的質(zhì)子有近程相關(guān)；δ137.812為季碳峰，只有與3-H的質(zhì)子存在遠(yuǎn)程相關(guān)，推測(cè)為C=C上的兩個(gè)碳原子，即3，2-C。

10）δ138.175為季碳峰，其與多組質(zhì)子峰存在著遠(yuǎn)程相關(guān)性，故推定為1′-C。

11）δ139.29 為季碳峰，只與 4′-OCH3上的質(zhì)子存在遠(yuǎn)程相關(guān)性，推測(cè)為4′-C。

12）δ146.588 為季碳峰，只與 2″-H 的質(zhì)子有遠(yuǎn)程相關(guān)性，推測(cè)為 3″-C。

13）δ149.858 為季碳峰，只與 5″-H 的質(zhì)子有遠(yuǎn)程相關(guān)性，推測(cè)為 4″-C。

14）δ154.930為季碳雙峰，符合這一特性的只有苯環(huán)上的 3′，5′-C。

圖3 DX-1002的13C-NMR譜

15）δ178.099為季碳峰，沒有近程相關(guān)的氫，只與3-H質(zhì)子具有遠(yuǎn)程相關(guān)性，推測(cè)為1-C。

綜上所述，13C譜的信號(hào)歸屬如下：

δ15.103（a-CH3），δ21.34（b-CH2），δ31.101（c-CH2），δ41.526（d-CH2），δ57.788（4′-OCH3），δ58.186（3′，5′-OCH3），δ63.341（4″-OCH3），δ109.224（2′，6′-C），δ113.626（5″-C），δ118.900（2″-C），δ125.518（6″-C），δ130.918（1″-C），δ137.718（3-C），δ137.812（2-C），δ138.175（1′-C），δ139.29（4′-C），δ146.588（3″-C），δ149.858（4″-C），δ154.930（3′，5′-C），δ178.099（1-C）。

1.3 順反異構(gòu)體結(jié)構(gòu)的鑒定

根據(jù)本品1H譜、gCOSY、gHQMC和NOESY譜的數(shù)據(jù)比較和解析，對(duì)分子中順反異構(gòu)進(jìn)行了判斷。

1）在 gCOSY 譜中可以看到 2′，6′-H 與 6″-H 也具有相關(guān)性，證明了 2′，6′-H 與 6″-H 在空間位置上是相接近的，即 2′，6′-H 所在的苯環(huán)與 6″-H 所在的苯環(huán)在烯烴雙鍵的同側(cè)。

2）由gHMQC譜可知，1-C與3-H具有遠(yuǎn)程相關(guān)性，說(shuō)明1-C和3-H在烯鍵的同側(cè)。

3）由 NOESY 譜中可看出，3-H 與 2″-H 和 6″-H具有相關(guān)性，說(shuō)明3-H與2″-H和6″-H在空間位置上很接近，即3-H與2″-H和6″-H所在的苯環(huán)連在同一個(gè)烯烴碳原子上。

1）2）3 ）的譜圖結(jié)果顯示本結(jié)構(gòu)中的烯鍵符合反式烯烴（E）的結(jié)構(gòu)特征。

由以上的NMR數(shù)據(jù)可知，本品與DX-1002的化學(xué)結(jié)構(gòu)一致。

2 元素分析

元素分析的結(jié)果表明本品H為7.13%，C為60.80%，N為2.86%，與分子式C23H31NO7理論值（C：63.76%，H：7.21%，N：3.23%）相符合。

3 質(zhì)譜（ESI-MS）

ESI+質(zhì)譜的質(zhì)荷比434.16與本品的分子離子峰[M+H]相符；質(zhì)荷比 361.12 與其[M-NH2（C4H9）+H]的碎片離子相符；質(zhì)荷比 794.28 為[2M-NH2（C4H9）+H]的碎片峰，質(zhì)荷比 776.31 為[2M-NH2（C4H9）-OH+H]的碎片峰，由此進(jìn)一步證明本品分子式為C23H31NO7，分子量為433.21，化學(xué)結(jié)構(gòu)與圖1的化學(xué)結(jié)構(gòu)的一致性。

4 紅外吸收光譜（IR）

紅外吸收光譜的特征吸收3 516.47，3 384.46，1580.01，1552.05cm-1體現(xiàn)出分子中的胺基的存在，2960.07，2847.16cm-1為甲基，2938.54，2839.19cm-1為亞甲基；3167.50，3066.01cm-1為甲氧基，1233.63，1124.66 cm-1為苯環(huán)C-O-C，說(shuō)明本品中有-OCH3連接在苯環(huán)上；1 632.45，1 508.69 cm-1為-C=C-，972.56 cm-1為乙烯基中=CH，904.85，872.63cm-1為苯環(huán)上的=CH，說(shuō)明本品結(jié)構(gòu)中有-C=CH和苯環(huán)；1459.37，1355.95cm-1為羧C=O，說(shuō)明結(jié)構(gòu)中有-COOH。由此，證明本品的結(jié)構(gòu)中存在了-NH2，-CH3，-CH2CH3，-OCH3，苯環(huán)，CH=CH，C=O等基團(tuán)。

5 結(jié)束語(yǔ)

綜上所訴，根據(jù)DX-1002的NMR譜結(jié)果，同時(shí)結(jié)合DX-1002質(zhì)譜碎片特征、IR光譜特征和元素分析，證明 DX-1002 的化學(xué)結(jié)構(gòu)為（E）-3-（3″-羥基-4″-甲氧苯基）-2-（3′，4′，5′-三甲氧基苯基） 丙烯酸正丁銨鹽，分子式為C23H31NO7，分子量為433.21。

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