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    雞傳染性支氣管炎病毒的分離鑒定

    2019-12-27 05:30:52金福源陶艷華李成貴彭會建
    中國畜禽種業(yè) 2019年11期
    關(guān)鍵詞:雞胚死雞尿囊

    金福源 陶艷華 李成貴 彭會建

    (江蘇省蘇州市吳江區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所 215200)

    雞傳染性支氣管炎是由傳染性支氣管炎病毒引起的,通過臨床癥狀進(jìn)行初步判斷,再根據(jù)其流行性和病理變化等初步診斷,確診還需要利用實(shí)驗(yàn)室技術(shù)進(jìn)行檢測。許多試驗(yàn)通過一些生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)技術(shù),RT-PCR、血清學(xué)試驗(yàn)、核苷酸測序等進(jìn)行分離鑒定病毒。傳統(tǒng)的病毒分離與鑒定方法對IBV 進(jìn)行診斷會更加準(zhǔn)確,并且許多研究利用分離得到的病毒株可以研發(fā)出新型的疫苗和診斷試劑盒,為未來的預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)。

    1 材料

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 試驗(yàn)動物

    SPF 雞胚(山東濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司)。

    1.1.2 試驗(yàn)病料

    取腎、肺、氣管等組織器官,或者急性期病雞氣管滲出物,制成懸浮液。(每毫升加青霉素和鏈霉素各1 萬IU,置4℃冰箱過夜,以抑制細(xì)菌污染)。

    1.1.3 試驗(yàn)儀器和試劑

    儀器:電泳儀;紫外燈儀;基因擴(kuò)增儀;單人凈化操作臺;37℃恒溫箱;臺式離心機(jī);孵化機(jī)。

    生化試劑Trizol Reagent;RNA PCR Kit、Mix、D2000 DNA Marker、膠回收試劑盒均;瓊脂糖。胰蛋白酶 (濃度為1.47%);雞紅細(xì)胞(濃度為0.8%);青霉素和鏈霉素(濃度為940IU);動物疫病基因芯片診斷試劑盒。

    2 試驗(yàn)方法

    2.1 動物接種試驗(yàn)

    將采集到的病料加入滅菌生理鹽水中進(jìn)行細(xì)細(xì)研磨,放入離心機(jī)中12000r/min 離心20min;之后再將上層清液用濾過膜過濾除菌,接種20 枚9 日齡SPF 雞胚,在尿囊腔中注入0.1ml/胚。觀察雞胚死亡情況,舍去一日內(nèi)死亡的雞胚,對1~6d 內(nèi)死雞胚進(jìn)行打蛋觀察雞胚的病變[1]。無菌條件下收集1~6d 內(nèi)死雞胚的尿囊液,接種10 日齡SPF 雞胚20 枚,連續(xù)傳3 代,再傳至10 代進(jìn)行備用。分離第3 代毒尿囊液,用肌肉注射的方式接種20 只SPF 雞,0.1ml/只,觀察SPF 雞的發(fā)病率和死亡率,對死亡雞進(jìn)行剖檢并觀察病理變化。

    2.2 毒價測定

    第3 代分離毒尿囊液用經(jīng)滅菌后的生理鹽水依次作10 倍系列稀釋,取10-4、10-5、10-6、10-7,4 個稀釋度分別接10~11 日齡SPF 雞胚10 枚,0.1ml/胚,孵育至144h。24h 以內(nèi)死亡的雞胚舍去,根據(jù)接種后24~144h 內(nèi)雞胚死亡的數(shù)量及144h 活胚中有特異性病理變化的雞胚總數(shù)計(jì)算毒價。

    2.3 HA 試驗(yàn)

    IBV 在雞胚中可干擾NDV-B1 株血凝素的產(chǎn)生[2]。取9~11日齡雞胚20 枚,分兩組,一組先尿囊液進(jìn)行接種被檢IBV 雞胚液;另一組作為對照。10~18h 后兩組同時進(jìn)行尿囊內(nèi)接種NDV-B1,孵化36~48h 后,置雞胚與4℃8h,取雞胚液做HA。

    間接HA 試驗(yàn)陽性樣品用兔抗雞IBV 陽性血清測定血凝抑制(HI)效價。

    2.4 RT-PCR 檢測

    2.4.1 RNA 提取

    (1)取被測樣品100μl,加300μlTirzol 裂解液,上下顛倒混勻,冰上靜置15min[2];(2)加入氯仿后充分混勻,放在冰上靜置10min,然后4℃、12000r/min 離心20min;(3)取上清液250μl,加入250μl 異丙醇,充分混勻,置于冰上15min,然后4℃、12000r/min 離心20min;(4)舍去上清液,加入75%的乙醇1ml,然后4℃,12000r/min 離心10min,舍去上清液,放置5min;(5)加入15μlddH2O 除去沉淀,此時得到產(chǎn)物就是RNA 溶解液。

    2.4.2 RT-PCR 擴(kuò)增體系

    PCR 擴(kuò)增體系,見表1。

    表1 PCR 擴(kuò)增體系

    2.5 序列比對

    將測序獲得的核苷酸序列與核苷酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析[3]。

    3 試驗(yàn)結(jié)果

    3.1 動物接種試驗(yàn)結(jié)果

    初代接種的雞胚,孵化至19d,可使少量雞胚發(fā)育受阻,有個別死亡的情況,而多數(shù)的雞胚能存活。雞胚連續(xù)傳至三代后,雞胚便出現(xiàn)規(guī)律性死亡現(xiàn)象,剖檢死雞胚可見雞胚蜷縮、矮小,出現(xiàn)“侏儒胚”的典型癥狀。臨床病料樣品接種第10代的9~11 日齡SPF 雞胚,接種后1~2d 內(nèi)雞胚全部死亡。收集死亡雞胚尿囊液作為分離毒株。

    3.2 毒價測定結(jié)果

    設(shè)置10-4、10-5、10-6、10-74 個稀釋梯度組,觀察雞胚死亡情況及特異性病痕的雞胚數(shù)量。如表2 所示,根據(jù)Reedmuench 法計(jì)算,得出該分離病毒的毒價為10-4.8/0.1ml。

    表2 毒力測定結(jié)果

    3.3 HA 試驗(yàn)結(jié)果

    試驗(yàn)組雞胚液有49%以上HA 滴度在1:20 以下,對照組91%以上雞胚液HA 滴度在1:40 以上[2]。

    分離出來的毒株進(jìn)行血凝試驗(yàn),其中1%的雞紅細(xì)胞不出現(xiàn)凝集。病料的上清液接種雞胚,觀察雞胚存活情況是全部能存活。通過胰酶處理之后,血凝能夠被IBV 陽性血清抑制,HI效價在1:24~1:28;第一代的尿囊液進(jìn)行直接HA、間接HA試驗(yàn),得到的結(jié)果均為陰性,并且胚體均發(fā)育正常,第二代到第十代第的尿囊液進(jìn)行直接HA 試驗(yàn),試驗(yàn)的結(jié)果均為陰性,間接HA 試驗(yàn)的結(jié)果均為陽性。該病毒在雞胚上傳至第三代時,死雞胚或侏儒胚,隨傳代次數(shù)的增加萎縮癥狀呈現(xiàn)地越來越明顯。雞胚接種生理鹽水后,尿囊液都沒有出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集的現(xiàn)象,對照組雞胚的尿囊液平均HA 效價在1:28.3 之上,試驗(yàn)組的平均HA 效價在:1:24.6 之下,說明分離毒株干擾NDV 的增值。接種分離毒株的數(shù)量越多,干擾率會越高。從而初步判斷該尿囊液中分離物中有IBV。

    3.4 RT-PCR 檢測結(jié)果

    通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物,可觀察到在427bp 處有特異的擴(kuò)增條帶,根據(jù)相關(guān)的報道分析可知[4],表明分離毒為IBV,參見附圖。

    3.5 分離毒株的序列分析結(jié)果

    通過核苷酸序列的對比 [5]可以得到毒株基因的核苷酸序列與國內(nèi)廣泛使用的歐洲呼吸型疫苗株H52、H120 的各自的同源性可達(dá)到78.5%和78.7%;與美國呼吸型、腎型代表毒株M41、Holte 的同源性分別是78.9%和79.1%;與澳大利亞呼吸型株T 的同源性是78.3%;與國內(nèi)呼吸型疫苗株W93 的同源性為78.5%;與變異株5/91 的同源性為98.7%;同腺胃型毒株CK/CH/LDL/97I 的同源性是75.5%;與臺灣地區(qū)的分離病毒株TW97-4 的同源性是78.5%。HP-W 株S1 基因編碼氨基酸的序列與變異株5/91 的同源性達(dá)97.2%,同其他毒株氨基酸序列的同源性都在79%之下。通過軟件分析可得該分離病毒株與現(xiàn)有的腎型、呼吸型疫苗株的親緣性都比較遠(yuǎn),與變異株5/91 有很近的親緣性。

    附圖 RT-PCR 結(jié)果

    4 討論

    雞傳染性支氣管炎的確定需要先通過臨床癥狀進(jìn)行初步判斷,再根據(jù)其流行性和病理變化等初步診斷,確診還需要利用實(shí)驗(yàn)室技術(shù)進(jìn)行檢測。本次試驗(yàn)通過一些生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)技術(shù),RT-PCR、血清學(xué)試驗(yàn) [5]等進(jìn)行分離鑒定病毒,最后確定該養(yǎng)殖場雞群發(fā)病病因是IBV。傳統(tǒng)的病毒分離與鑒定方法對IBV進(jìn)行診斷會更加準(zhǔn)確,并且利用分離得到的病毒株可以研發(fā)出新型的疫苗和診斷試劑盒,為未來的預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)。由于IBV 血清型比較多且病毒變異速度較快,使用疫苗前要對當(dāng)?shù)亓餍械腎BV 血清型進(jìn)行調(diào)查,這樣得到的診斷和之后的防治才能更準(zhǔn)。

    各種年齡的雞群都易感IBV,雞舍由于飼養(yǎng)管理不當(dāng)、養(yǎng)殖密度大、通風(fēng)不佳、飼料營養(yǎng)不均衡等原因都會發(fā)生IBV 的感染?,F(xiàn)在IB 還沒有特效藥品,所以對其病的防控措施方法是加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和疫苗接種。阻止應(yīng)激反應(yīng),保證飼養(yǎng)環(huán)境和飼料的衛(wèi)生。預(yù)防該病的免疫程序一般為7~10 日齡弱毒疫苗首免,30 日齡弱毒疫苗二免,肌肉注0.4ml/只,并且要根據(jù)當(dāng)?shù)卦撘卟×餍星闆r選用合適的疫苗毒株。外來的雞群應(yīng)先隔離觀察一段時間,無癥狀的情況下再混入雞舍飼養(yǎng)。

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