松樹皮多聚原花青素片段化產(chǎn)物的分離鑒定及活性*

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松樹皮多聚原花青素片段化產(chǎn)物的分離鑒定及活性*

李娜1，但漢龍1，姜永新1，李美娟2，張加研2，趙平1

(1.西南林業(yè)大學(xué) 云南省木材膠黏劑及膠合制品重點實驗室，云南昆明650224；2.西南林業(yè)大學(xué) 材料工程學(xué)院，云南昆明 650224)

摘要：采用多種柱層析手段，分別從基于茶多酚的思茅松和馬尾松樹皮多聚原花青素片段化反應(yīng)產(chǎn)物中分離得到1個主要產(chǎn)物。通過MS、1H NMR和13C NMR波譜解析，其化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定為(-)-表兒茶素-(4β-8)-(-)-表沒食子兒茶素3-O-沒食子酸酯(1)。結(jié)果表明，茶多酚中的(-)-表沒食子兒茶素3-O-沒食子酸酯(EGCG)在片段化反應(yīng)中扮演著重要角色，化合物1是EGCG通過4β-8與(-)-表兒茶素C-4位上的正離子鍵合形成而來。采用DPPH、ABTS自由基清除活性測定方法評價了化合物1的抗氧化活性，其清除DPPH、ABTS自由基的能力均高于茶多酚、多聚原花青素及其片段化總產(chǎn)物，SC50值分別為6.12±0.03 g/mL和41.41±0.66 g/mL。

關(guān)鍵詞：松樹皮；思茅松；馬尾松；多聚原花青素；片段化產(chǎn)物；分離鑒定；抗氧化活性

原花青素(proanthocyandins,PC)是植物中由不同數(shù)目的黃烷3-醇單元通過C4-C8、C4-C6或C2-O-C7等不同鍵合方式聚合而成的一大類多酚類物質(zhì)。按其聚合度大小，PC分為低聚原花青素(oligomeric proanthocyanidins,OPC)和多聚原花青素(polymeric proanthocyanidins,PPC)[1]。與PPC相比，OPC在抗氧化、清除自由基等方面具有顯著的生物活性，但大多數(shù)植物PC主要以PPC的形式存在，如松樹皮PC的平均分子量為2 800，平均聚合度為9～10[2]。由于PPC分子量大、水溶性較差，導(dǎo)致其不易透過生物膜，從而影響其生物活性，并隨聚合度的增加其抗氧化作用顯著降低[3～5]。

通過黃烷3-醇單元之間連接鍵的酸催化裂解實現(xiàn)PPC片段化是PC最重要的化學(xué)反應(yīng)之一[6]，半胱氨酸、半胱胺、谷胱甘肽等先后被應(yīng)用于葡萄籽、松樹皮、荔枝PPC的片段化反應(yīng)中，并發(fā)現(xiàn)其片段化產(chǎn)物具有良好的抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護等活性[7～13]。近年來，本研究組開發(fā)了基于茶多酚的PPC片段化技術(shù)，李美娟等[14]對云南松(Pinusyunnanensis)樹皮等幾種植物PC及其基于茶多酚的片段化產(chǎn)物進行了體內(nèi)抗ROS活性比較，發(fā)現(xiàn)片段化產(chǎn)物的活性得到顯著提高；姜永新等[15]、尹繼庭等[16]和姜力等[17]進一步對源于馬尾松(Pinusmassoniana)樹皮、葡萄籽皮和木瓜(Chaenomelessinensis)原花青素的茶多酚片段化產(chǎn)物進行了液質(zhì)聯(lián)用分析，發(fā)現(xiàn)他們的片段化主產(chǎn)物均為同一物質(zhì)，并推測其可能結(jié)構(gòu)為(表)兒茶素和(表)沒食子兒茶素3-O-沒食子酸酯結(jié)合的二聚體。本研究采用多種柱層析手段并結(jié)合質(zhì)譜(MS)、核磁共振(NMR)波譜技術(shù)，對基于茶多酚的思茅松(P.kesiyavar.langbianensis)和馬尾松樹皮PPC的片段化反應(yīng)主產(chǎn)物進行分離鑒定，并采用DPPH和ABTS自由基清除活性測定方法評價其抗氧化活性，以期為PPC/茶多酚片段化反應(yīng)機理的闡明以及片段化反應(yīng)產(chǎn)物進一步的高值化開發(fā)利用等提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

思茅松樹皮(云南省景谷林業(yè)股份有限公司提供)、馬尾松樹皮(PC購自桂林萊茵生物科技有限公司)、茶多酚(云南省紅河唐人生物科技發(fā)展有限公司)。Sephabeads LP-20、Diaon HP-20、MCI GEL CHP20/P120和CG161M大孔吸附樹脂、Sephadex LH-20凝膠(北京慧德易科技有限責任公司)。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(Sigma公司)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)(BomeiBio公司)?；衔锓蛛x用甲醇、乙醇為化學(xué)純，過硫酸鉀、Vc、HCl、H2SO4以及TLC用氯仿、甲醇和乙醇均為分析純。TLC展開劑為氯仿：甲醇：水(7：3：0.5)，顯色劑為10 % H2SO4乙醇溶液。

主要儀器有賽特路斯BT244S型萬分之一電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)、HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)、EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1001型(日本東京理化器械有限公司)、UV1000紫外可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)、BRUKER AM-400MHz超導(dǎo)核磁共振儀(瑞士布魯克公司)、Autospec Premier P776雙聚焦三扇型磁質(zhì)譜儀(美國沃特斯公司)。

1.2思茅松樹皮PPC的制備

干燥思茅松樹皮8 kg用80 %乙醇25 L冷浸3次，合并提取液減壓濃縮后分別用石油醚和乙酸乙酯萃取，所得水溶液經(jīng)減壓濃縮去除殘留有機溶劑后上Sephabeads LP-20柱(10 cm×80 cm)，用2個柱體積的蒸餾水洗脫，水洗脫部分再經(jīng)Diaion HP-20柱(8 cm×80 cm)吸附，用1個柱體積的蒸餾水洗脫去雜后，用2個柱體積的乙醇進行洗脫，乙醇洗脫液合并后經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥得到思茅松樹皮PPC(271.4 g)。

1.3片段化總產(chǎn)物的制備

參照PPC/茶多酚片段化反應(yīng)方法[15～17]，分別稱取思茅松樹皮PPC和馬尾松樹皮PC各10 g，溶解于1 L含茶多酚10 g、10 μmol/L Vc的1 % HCl水溶液中，在70℃恒溫水浴中加熱反應(yīng)90 min后，置于室溫冷卻以終止反應(yīng)。各反應(yīng)溶液經(jīng)Diaon HP-20柱(5 cm×60 cm)分別吸附，用2倍柱體積的蒸餾水洗脫去除Vc和HCl后，用甲醇洗脫至洗脫液近無色，所得甲醇洗脫液在50℃下減壓濃縮干燥，分別得到思茅松樹皮PPC片段化總產(chǎn)物16.8 g和馬尾松樹皮PC片段化總產(chǎn)物17.0 g。

1.4片段化產(chǎn)物1的分離鑒定

取思茅松樹皮PPC片段化總產(chǎn)物4.84 g溶解于少量50 %甲醇水溶液后，經(jīng)MCI GEL CHP20/P120柱(4 cm×40 cm)吸附，用30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %的甲醇水溶液各400 mL進行梯度洗脫，經(jīng)TLC檢測合并，得到10個組分(Fr1-Fr10)。Fr.2(733.6 mg)用少量乙醇溶解后上Sephadex LH-20(2.5 cm×35 cm)柱層析，用乙醇等度洗脫，經(jīng)TLC檢測合并，得到11個組分(Fr2.1-Fr2.11)。其中，F(xiàn)r2.4(41.2 mg)經(jīng)CG161M(1.5 cm×40 cm)柱層析，用30 %、50 %和80 %甲醇水各150 mL進行梯度洗脫，得到化合物1(7.5 mg)。

取馬尾松樹皮PC片段化總產(chǎn)物5.23 g溶解于少量乙醇后上Sephadex LH-20(3.5 cm× 40 cm)柱層析，用乙醇等度洗脫，經(jīng)TLC檢測合并，得到11個組分(Fr1-Fr11)。其中，F(xiàn)r10(418 mg)進一步經(jīng)Sephadex LH-20(2.0 cm×30 cm)柱層析，用乙醇等度洗脫，得到5個組分(Fr10.1-Fr10.5)。Fr10.3(140.8 mg)經(jīng)CG161M(1.5 cm×20 cm)柱層析，用10 %、30 %、50 %和80 %甲醇水溶液各200 mL進行梯度洗脫，得到化合物1(15.0 mg)。

采用BRUKER AM-400MHz超導(dǎo)核磁共振儀和Autospec Premier P776雙聚焦三扇型磁質(zhì)譜儀對化合物1進行波譜測定。

1.5抗氧化活性測定

參照DPPH自由基清除活性測試方法[18]，用70 %的乙醇配制成濃度為0.2 mmol/L的DPPH溶液備用。化合物1、茶多酚、思茅松樹皮PPC及其片段化總產(chǎn)物分別用70 %乙醇溶解配制成不同濃度的溶液，并各取2 mL不同質(zhì)量濃度的溶液于棕色小瓶中，分別加入0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液2 mL，在避光條件下混均，反應(yīng)20 min后，在波長517 nm處測定吸光度。以70 %乙醇調(diào)零，用70 %乙醇2 mL加入0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液2 mL作為空白對照。按如下公式計算供試樣品的DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率(%)=[(AX0-AX)/ AX0]×100。式中，AX為供試樣品溶液加入DPPH自由基溶液反應(yīng)后的吸光度；AX0為空白對照溶液的吸光度。根據(jù)供試樣品的DPPH自由基清除曲線，計算它們的SC50值(清除率為50 %時所需供試樣品的質(zhì)量濃度)。測定時每個樣品進行3次平行重復(fù)實驗。

參照ABTS自由基清除活性測試方法[19]，稱取38.5 mg的ABTS，6.6 mg的過硫酸鉀用70 %乙醇溶解定容于10 mL的棕色容量瓶，避光反應(yīng)12-16 h之后，用70 %乙醇稀釋，使其在734 nm處的吸光度值為0.70±0.02，即得ABTS工作液?；衔?、茶多酚、思茅松樹皮PPC及其片段化總產(chǎn)物分別用70 %乙醇溶解配制成不同濃度的溶液，取0.1 mL不同質(zhì)量濃度的溶液于棕色小瓶中，分別加入ABTS工作液3.9 mL，在避光條件下混均，反應(yīng)6 min后，在波長734 nm處測定吸光度。以70 %乙醇調(diào)零，用70 %乙醇0.1 mL加入ABTS工作液3.9 mL作為空白對照。按如下公式計算供試樣品的ABTS自由基清除率。ABTS自由基清除率(%)=[(AX0-AX)/ AX0]×100。式中，AX為供試樣品溶液加入ABTS工作液反應(yīng)后的吸光度；AX0為空白對照溶液的吸光度。根據(jù)供試樣品的ABTS自由基清除曲線，計算它們的SC50值(清除率為50 %時所需供試樣品的質(zhì)量濃度)。測定時每個樣品進行3次平行重復(fù)實驗。

2結(jié)果與分析

2.1片段化產(chǎn)物1的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為淡黃色無定形粉末，ESI--MS顯示其分子離子峰m/z 746 [M]-，表明其分子量為746。其1H NMR譜顯示出典型的黃烷3-醇二聚體的質(zhì)子信號，其中δ5.24(1H,br s)，4.00(1H,br s)和δ5.12(1H,br s)，5.56(1H，m)分別為黃烷3-醇C環(huán)2位和3位上的質(zhì)子信號，且H-2和H-3、H-2′和H-3′均處于同側(cè)。 δ6.02(3H，m)為典型的黃烷3-醇骨架A環(huán)6位和8位上的質(zhì)子。δ7.02(2H,s)為典型的沒食子?；?galloyl)上的芳香質(zhì)子信號，結(jié)合分子量信息，推測該化合物為(-)-表兒茶素結(jié)構(gòu)上附加了(-)-表沒食子兒茶素3-O-沒食子酸酯(EGCG)，分子式為C37H30O17。結(jié)合C-4位上的質(zhì)子信號[δ4.84(1H,br s)，2.80～3.10(2H，m)]，表明(-)-表兒茶素和EGCG通過4β-8位相連[20]。其1H NMR和13C NMR譜數(shù)據(jù)與文獻報道的(-)-表兒茶素-(4β-8)-(-)-表沒食子兒茶素3-O-沒食子酸酯[20]完全一致，因此該化合物的結(jié)構(gòu)鑒定為(-)-表兒茶素-(4β-8)-(-)-表沒食子兒茶素3-O-沒食子酸酯(1)(圖1)。

化合物1的波譜數(shù)據(jù)：ESI--MS: m/z 746 [M]-.1H NMR(acetone-d6,400 MHz): δ7.02(2H,s,galloyl H),6.63～6.92(5H,m,B,B′-ring H),6.02(3H,m,H-6,8,6′),5.56(1H,m,H-3′),5.24(1H,br s,H-2),5.12(1H,br s,H-2′),4.84(1H,br s,H-4),4.00(1H,br s,H-3),2.80～3.10(2H,m,H-4′).13C NMR(acetone-d6,100 MHz,):δ166.9(COO),157.7,157.3,155.8,155.6,155.4(s,C-5,7,9,5′,7′,9′),146.0,145.7,145.4,145.1(B-ring C-3,4,B′-ring C-3,5,galloyl C-3,5),139.1(galloyl C-4),132.8,132.1,130.3(B-ring C-1,B′-ring C-1,4),121.3(galloyl C-1),119.1,115.7,115.2(B-ring C-2,5,6),110.2(galloyl C-2,6),107.6(C-8′),106.3(B′-ring C-2,6),101.5(C-10),99.2(C-10′),97.0,96.2,95.6(C-6,8,6′),77.8(C-2),76.8(C-2′),73.2(C-3),72.9(C-3′),36.5(C-4),26.7(C-4′)。

圖1化合物1的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其形成機理

Fig.1Chemical structure of compound 1 and its formation mechanism

依據(jù)原花青素酸催化降解反應(yīng)原理，化合物1的形成機理如圖1所示。在加熱和適當?shù)乃嵝詶l件下，“直鏈型”結(jié)構(gòu)的松樹皮PPC[2]中的黃烷3-醇單元之間的C4-C8連接鍵容易發(fā)生斷裂，其上部延伸單元中C-4位形成的(-)-表兒茶素碳正離子容易被適當?shù)挠H核劑所捕捉，從而形成親核劑附加產(chǎn)物[6]。由于茶多酚主要由EGCG等兒茶素類物質(zhì)所構(gòu)成，在反應(yīng)體系中EGCG扮演親核試劑的主要角色，與(-)-表兒茶素碳正離子發(fā)生C4-C8化學(xué)鍵合，從而形成片段化主產(chǎn)物1。

2.2片段化產(chǎn)物1的抗氧化活性

按照1.5的實驗方法分別測定了化合物1、茶多酚、思茅松樹皮PPC及其片段化總產(chǎn)物對DPPH自由基和ABTS自由基的清除率，清除活性測定結(jié)果見圖2所示。從圖2可知，供試樣品對DPPH自由基都具有較高的清除能力，它們的最大清除率分別達到71.28 %、73.10 %、75.70 %和77.32 %。其中，化合物1對DPPH自由基的半清除濃度(SC50=6.12±0.03 μg/mL)明顯低于思茅松樹皮PPC的半清除濃度(SC50=15.23±0.63 μg/mL)，同時也低于茶多酚的半清除濃度(SC50=8.28±0.45 μg/mL)和PPC片段化總產(chǎn)物的半清除濃度(SC50=9.01±0.14 μg/mL)，表明化合物1的DPPH自由基清除能力最強。

化合物1、茶多酚、思茅松樹皮PPC及其片段化總產(chǎn)物對ABTS自由基同樣也具有較高的清除能力，它們的最大清除率分別達到了100 %、99.82 %、92.49 %和99.74 %。其中，化合物1對ABTS自由基的半清除濃度(SC50=41.41±0.66 μg/mL)遠遠低于思茅松樹皮PPC的半清除濃度(SC50=105.85±1.33 μg/mL)，并且也低于茶多酚的半清除濃度(SC50=65.32±0.71 μg/mL)和PPC片段化產(chǎn)物的半清除濃度(SC50=64.02±2.59 μg/mL)，同樣表明化合物1的ABTS自由基清除能力最強。

圖2　供試樣品的DPPH、ABTS自由基清除率

3結(jié)語

本研究采用多種柱層析手段，分別從基于茶多酚的思茅松樹皮PPC和馬尾松樹皮PC片段化總產(chǎn)物中分離得到1個主要產(chǎn)物，通過MS、1H NMR和13C NMR波譜解析，其化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定為(-)-表兒茶素-(4β-8)-(-)-表沒食子兒茶素3-O-沒食子酸酯(1)。該主產(chǎn)物是EGCG通過4β-8與(-)-表兒茶素C-4位上的碳正離子鍵合形成而來，表明源于茶多酚的EGCG在思茅松樹皮PPC和馬尾松樹皮PC片段化反應(yīng)中扮演著非常重要的角色?？寡趸钚詫嶒灲Y(jié)果顯示化合物1的DPPH和ABTS自由基清除能力均明顯高于茶多酚、思茅松樹皮PPC及其片段化總產(chǎn)物，其SC50值分別為6.12±0.03 μg/mL和41.41±0.66 μg/mL。研究結(jié)果表明通過基于食品來源茶多酚的多聚原花青素片段化技術(shù)，其片段化產(chǎn)物的抗氧化能力得到了顯著提高，該技術(shù)的推廣應(yīng)用可望為植物PPC進一步的高值化開發(fā)利用提供一條新的途徑。

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Identification and Activities of the Fragmented Product of

Polymeric Proanthocyanidins from Pine Barks

LI Na1, DAN Han-long1, JIANG Yong-xin1, LI Mei-juan2, ZHANG Jia-yan2, ZHAO Ping1

(1.Yunnan Key Laboratory of Wood Adhesives and Glue Products,Southwest Forestry University,Kunming Yunnan 650224,P.R.China;

2.College of Material Engineering,Southwest Forestry University,Kunming Yunnan 650224,P.R.China)

Abstract:A principal product in the fragmented reaction of polymeric proanthocyanidins from the barks of Pinus kesiya var.langbianensis and P.massoniana with tea polyphenols was isolated by column chromatographies,respectively.On the basis of MS,1H NMR and13C NMR spectroscopic analyses,its structure was established as (-)-epicatechin-(4β-8)-(-)-epigallocatechin 3-O-gallate (1).The results showed that the EGCG in tea polyphenols plays an important role in the fragmentation reaction,which attached to the cation at C-4 of (-)-epicatechin by 4β-8 linkness to form 1.The antioxidant activities of 1 were evaluated by DPPH and ABTS radical scavenging activity assays.Its scavenging capacities against DPPH and ABTS free radicals with SC50values of 6.12±0.03 g/mL and 41.41±0.66 g/mL were higher than those of tea polyphenols,polymeric proanthocyanidins and their fragmented products,respectively.

Key words:Pine barks;Pinus kesiya var.langbianensis; Pinus massoniana; polymeric proanthocyanidins; fragmented product; isolation and identification; antioxidant activity

中圖分類號：TQ 35

文獻標識碼：A

文章編號：1672-8246(2015)05-0076-05

通訊作者簡介：趙平(1965-)，男，研究員，博士，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。E-mail：hypzhao@yahoo.com

作者簡介：第一李娜(1990-)，女，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。E-mail：576909424@qq.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)項目(31260163)、云南省教育廳科學(xué)研究基金重大專項(ZD2010006)。

收稿日期：*2015-04-07

doi10.16473/j.cnki.xblykx1972.2015.05.015