MiR-15a對奶牛乳腺上皮細胞泌乳功能的影響

邵麗，曲波，王春梅，李慶章，高學(xué)軍，李慧銘，王褚悅，張莉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

0 引言

MicroRNAs（miRNAs）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類廣泛存在于動植物細胞的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA分子，它在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄與表達、細胞周期、細胞凋亡、機體生長發(fā)育等過程中發(fā)揮著重要的作用[1]。miRNAs可通過部分互補結(jié)合到靶基因mRNA的非編碼區(qū)3′UTR從而阻礙其翻譯來調(diào)控基因的表達[2]。miR-15a定位于人類染色體13q14[3]，其作為凋亡因子、癌基因、抑癌基因、抑制細胞周期蛋白表達等方面的作用都有相關(guān)的研究報道[4-7]。Li等[8]研究發(fā)現(xiàn)miR-15a可通過調(diào)控生長激素受體，影響奶牛乳腺上皮細胞泌乳通路蛋白的表達?？傊壳瓣P(guān)于miR-15a對奶牛乳腺上皮細胞具體作用的研究還是很少。本實驗通過在奶牛乳腺細胞中過表達bta-miR-15a，研究其對奶牛乳腺上皮細胞泌乳功能的具體影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物組織

本研究選取妊娠中期奶牛乳腺組織用于乳腺上皮細胞的培養(yǎng)，器具嚴格滅菌。準備含有100 U/mL青霉素和質(zhì)量濃度為100 mg/L鏈霉素的經(jīng)0.22 μm濾膜過濾D-Hank’s緩沖液。常規(guī)手術(shù)切取乳腺組織，迅速將乳腺組織切割成塊約100 ng的小組織塊，生理鹽水沖洗幾次后，將組織置于裝有D-Hank’s緩沖液（含雙抗、兩性霉素）的三角瓶中，冰盒保存，馬上帶回實驗，用于乳腺上皮細胞培養(yǎng)實驗。

1.1.2 抗體與試劑

Cytokeratin（C-04）18 Antibody，鼠抗羊β-actin多克隆抗體，辣根酶標記山羊抗兔，山羊抗鼠IgG一抗，F(xiàn)ITC-山羊抗兔IgG，山羊抗鼠二抗；bta-miR-15a mimics，Negative Control，轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2000，DMEM/F-12培養(yǎng)基，胎牛血清，DMSO，Opti-MEM I medium（Gibco），β-Casein 抗體，BCA蛋白濃度測定試劑盒，預(yù)染蛋白Marker（10～230ku）；PX型醫(yī)用X-ray膠片，ECL超敏發(fā)光液，血液甘油三酯酶測定試劑盒，Lactose/D-Glucose Assay Kit試劑盒等。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

倒置相差顯微鏡DFC280，激光掃描共聚焦顯微鏡 TCS-SP2 AOBS，Mini Trans-Blot Criterion半干轉(zhuǎn)印儀，Model 680型全自動酶標儀，DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，DYCZ-23A型穩(wěn)壓電泳槽，PowerLook 2100XL掃描儀，ULT1386-3-V30型超低溫冰箱，超純水器，立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器，CO-150 CO2培養(yǎng)箱等。

1.2 方法

1.2.1 奶牛乳腺上皮細胞的培養(yǎng)與鑒定

按Ke等[9-11]的方法進行奶牛乳腺上皮細胞的分離和原代培養(yǎng)。將所得的奶牛乳腺上皮細胞接種于培養(yǎng)瓶中，在37℃質(zhì)量分數(shù)為5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)上皮細胞與成纖維細胞對酶敏感性不同將混合生長的原代或傳代奶牛乳腺上皮細胞純化。將純化的奶牛乳腺上皮細胞接種到35 mm小皿中，質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛固定，質(zhì)量分數(shù)5%的BSA封閉，細胞角蛋白18一抗，F(xiàn)ITC-山羊抗兔IgG二抗免疫熒光染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞角蛋白18的特異性表達情況，參考文獻[12]中的方法進行。

1.2.2 奶牛乳腺上皮細胞的瞬時轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的奶牛乳腺上皮細胞，用完全培養(yǎng)基將其濃度調(diào)整為6.0×105mL-1，接種于六孔培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)箱中孵育過夜待轉(zhuǎn)染。用①Opti-MEM I medium稀釋LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（6孔培養(yǎng)板6 μL+94 μL），輕輕混勻，在室溫孵育5 min；②將 miR-15a mimics、Negative Control分別用適量Opti-MEM I medium稀釋（6孔細胞培養(yǎng)板8 μL+92 μL），柔和混勻室溫孵育5 min。①＋②分別混勻，每組實驗進行3次重復(fù)，形成的復(fù)合物在室溫條件下孵育20 min，將復(fù)合物逐滴加入換有Opti-MEM I medium培養(yǎng)基的待轉(zhuǎn)染細胞中；輕輕晃動細胞培養(yǎng)板以使細胞與復(fù)合物充分接觸混合均勻，在37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，6 h后更換完全培養(yǎng)基，48 h后收集樣品，備用。

實驗具體分組如下：bta-miR-15a過表達組（bta-miR-15a mimics）；miR-15a陰性對照組（microRNA mimics NC）；加LipofectamineTM2000的空白對照組。

1.2.3 細胞分泌乳糖質(zhì)量濃度的檢測

轉(zhuǎn)染方法和分組同1.2.2，每組3個平行，轉(zhuǎn)染48 h后，收集6組細胞培養(yǎng)液，檢測方法按照Lactose/D-Glucose(Rapid)Assay Kit試劑盒（Megazyme）說明書進行。在同等條件下進行乳糖含量的測定。

1.2.4 細胞分泌甘油三酯濃度的檢測

轉(zhuǎn)染方法和分組同1.2.2，每組3個平行，48 h后收集6組細胞培養(yǎng)液，檢測方法按照血液甘油三酯酶法測定試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）說明書進行。

1.2.5 細胞β-酪蛋白表達量的檢測

轉(zhuǎn)染方法同1.2.2，分6組，每組3個平行，轉(zhuǎn)染48h后，分別收獲各組奶牛乳腺上皮細胞，用細胞裂解液提取細胞總蛋白，收集的細胞裂解液放入超聲儀中震蕩3次，每次10 s；再放入100℃水中煮沸5～10 min，12 000 r/min離心5 min，Manodrop2000測定蛋白濃度，2×SDS上樣緩沖液調(diào)成相同濃度分裝到200 μL小EP管中，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。進行SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)印后的NC膜37℃封閉2 h，一抗過夜，二抗1 h。在暗室中，加入ECL超敏化學(xué)發(fā)光液孵育壓暗盒曝光，顯影，定影。采用Image J2x軟件對Western blotting圖譜進行灰度掃描分析。

一抗為兔抗人β-Casein抗體、鼠抗羊β-actin多克隆抗體；二抗為辣根酶標記羊抗兔、羊抗鼠IgG，以β-actin為內(nèi)參，進行光密度分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。本實驗所有試驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)兩組之間比較采用t檢驗分析，三組數(shù)據(jù)比較則采用單因素方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義，定量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1 奶牛乳腺上皮細胞的培養(yǎng)與鑒定

圖1為奶牛乳腺上皮細胞的培養(yǎng)與純化。圖1中，在倒置相差顯微鏡下觀察純化的奶牛乳腺上皮細胞，細胞排列緊密、形態(tài)均一，呈鵝卵石狀（圖1A）；圖1B為成纖維細胞；圖1C為乳腺上皮細胞與成纖維混合生長。圖2為免疫熒光鑒定奶牛乳腺上皮細胞角蛋白18。圖2中，圓形的是DAPI染色的細胞核，絲狀綠色的是角蛋白18。由圖2可以看出，本研究純化后的細胞是奶牛乳腺上皮細胞。

圖1 奶牛乳腺上皮細胞的培養(yǎng)與純化

圖2 奶牛乳腺上皮細胞的角蛋白18鑒定

2.2 細胞分泌乳糖質(zhì)量濃度的影響

過表達miR-15a，轉(zhuǎn)染48h后分別收集培養(yǎng)液，應(yīng)用Lactose/D-Glucose(Rapid)Assay Kit試劑盒檢驗細胞培養(yǎng)液中的乳糖質(zhì)量濃度。檢測結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計分析后如表1所示。由表1可以看出，兩個對照組之間乳糖的分泌量沒有顯著差異（P＞0.05），而在miR-15a基因過表達組中，奶牛乳腺上皮細胞所分泌的乳糖質(zhì)量濃度要顯著低于陰性對照組和空白對照組（P＜0.05），表明miR-15a可抑制奶牛乳腺上皮細胞乳糖的產(chǎn)生和分泌。

表1 奶牛乳腺上皮細胞中乳糖質(zhì)量濃度的檢測結(jié)果

2.3 細胞分泌甘油三酯濃度的變化

過表達miR-15a，轉(zhuǎn)染48 h后分別收集培養(yǎng)液，應(yīng)用甘油三脂測定試劑盒檢測奶牛乳腺上皮細胞中的甘油三酯濃度，結(jié)果如表2所示。根據(jù)甘油三酯標準曲線（圖3）分析比較試驗結(jié)果顯示，過表達miR-15a后，奶牛乳腺上皮細胞中的甘油三酯濃度顯著減少（P＜0.05），表明miR-15a可抑制奶牛乳腺上皮細胞甘油三酯的產(chǎn)生和分泌。

圖3 甘油三酯標準曲線

表2 奶牛乳腺上皮細胞中甘油三酯濃度的檢測結(jié)果

2.4 細胞β-酪蛋白表達量的影響

用miR-15a mimics和negative control分別轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細胞，轉(zhuǎn)染48 h后，應(yīng)用Western blotting方法檢測奶牛乳腺上皮細胞β-酪蛋白的表達變化。圖4（a）為miR-15a超表達后Western blotting方法檢測β-酪蛋白含量的結(jié)果；圖4（b）為灰度掃描分析酪蛋白表達的光密度分析結(jié)果，通過3個平行實驗獲得試驗數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示與對照組相比，miR-15a mimics轉(zhuǎn)染48 h后，奶牛乳腺上皮細胞中β-酪蛋白的表達水平顯著降低（P＜0.05）。圖4中，1為miR-15a過表達組；2為陰性對照組；3為空白對照組

圖4 miR-15a過表達后奶牛乳腺上皮細胞β-酪蛋白的檢測結(jié)果

3 討論

乳腺是合成乳蛋白的重要器官。乳蛋白的組成成分和含量是衡量牛奶營養(yǎng)品質(zhì)的重要指標，其質(zhì)量分數(shù)高低不僅決定牛奶的風(fēng)味水平，而且是乳制品企業(yè)的核心競爭力[13]。乳汁中最主要的營養(yǎng)物質(zhì)是乳糖、蛋白質(zhì)和甘油三脂。β-酪蛋白（CSN2）是牛乳中含量最高的乳蛋白，也是乳蛋白中含量最高的酪蛋白，β-酪蛋白代表乳腺上皮細胞分泌乳蛋白的多少[14]。在泌乳激素的刺激下，β-酪蛋白具有很強的表達活性，其調(diào)控成分能夠指導(dǎo)靶基因在乳腺組織中高效表達[15]。所以本研究選擇乳糖、甘油三脂和β-酪蛋白進行miR-15a對泌乳功能影響的研究指標。角蛋白18是奶牛乳腺上皮細胞的識別蛋白，在奶牛乳腺上皮細胞的鑒定中普遍應(yīng)用[16-18]，所以本試驗選擇該方法進行奶牛乳腺上皮細胞的鑒定。

目前發(fā)現(xiàn)的miRNA作用于靶基因mRNA的具體機制有兩種，一種是當(dāng)miRNA序列與靶基因mRNA的3′UTRs堿基區(qū)域近乎完全配對互補結(jié)合時則進行剪切作用，促使靶基因的mRNA迅速地降解而抑制基因轉(zhuǎn)錄水平的表達；當(dāng)miRNA與靶基因mRNA不完全互補配對結(jié)合時，則會抑制靶基因mRNA的翻譯而發(fā)揮其調(diào)節(jié)功能，但是卻不會造成靶基因mRNA的降解[19]。另外一種情況是miRNAs誘導(dǎo)其靶基因mRNA快速地脫腺苷酸化，造成靶基因mRNA的快速衰弱和表達量的降低而發(fā)揮作用[20-22]。乳腺的發(fā)育可歷經(jīng)胚胎期、青春期、妊娠期、泌乳期、退化期等一系列時期，同時也是雌性哺乳動物出生之后能夠多次重復(fù)生長發(fā)育的唯一的器官。所以miRNAs作為基因轉(zhuǎn)錄后表達調(diào)節(jié)的小分子，如何調(diào)控乳腺的發(fā)育、泌乳、退化以及相關(guān)基因的表達研究具有重要的理論和實際意義。2009年，Tanaka等研究報道了miR-101a在小鼠乳腺中通過調(diào)節(jié)環(huán)氧酶-2的表達進而調(diào)節(jié)乳腺的發(fā)育[23]。2013年，Xu等研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌發(fā)生過程中，miR-148a/152-DNMT1信號通路可能起到重要的調(diào)節(jié)作用[24]。在小鼠的乳腺中，miR-126-3p特異性的參與了乳腺的發(fā)育過程，并且靶向調(diào)節(jié)孕酮受體，抑制小鼠乳腺上皮細胞的增殖以及-酪蛋白的分泌[25]。本實驗室的王杰等人研究發(fā)現(xiàn)miR-152調(diào)控p-Stat5、p-mTOR、Cyclin D1蛋白表達，能促進乳腺上皮細胞增殖和乳蛋白合成[26]。目前國內(nèi)外的研究中，miR-15a對奶牛乳腺發(fā)育及其泌乳功能的調(diào)控報道很少。本實驗室從2012年開始關(guān)注miR-15a，發(fā)現(xiàn)其可以通過調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細胞中生長激素受體起作用[8]。本研究通過在奶牛乳腺上皮細胞中過表達miR-15a，研究其對奶牛乳腺泌乳功能的影響，主要檢測其對乳糖、甘油三酯、酪蛋白泌乳指標的影響，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達miR-15a降低了奶牛乳腺上皮細胞的細胞活力，降低了乳糖和甘油三脂的分泌以及β-酪蛋白的表達，表明bta-miR-15a負調(diào)控奶牛乳腺細胞的泌乳功能，說明其極可能與退化期奶牛乳腺上皮細胞的凋亡作用有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究證明bta-miR-15a可抑制奶牛乳腺上皮細胞乳糖、甘油三酯和β-酪蛋白的分泌表達，降低奶牛乳腺上皮細胞的細胞活力，表明bta-miR-15a負調(diào)控奶牛乳腺上皮細胞的泌乳功能。這為進一步研究miR-15a在奶牛乳腺發(fā)育及泌乳功能方面的作用提供了實驗依據(jù)。

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