響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌產(chǎn)β-半乳糖苷酶發(fā)酵培養(yǎng)基

高曉峰，周穎，李柏良，周晶，霍貴成

（東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

0 引言

β-半乳糖苷酶廣泛來源于植物、動物、微生物中。其中微生物來源的β-半乳糖苷酶具有高活性及高穩(wěn)定性的優(yōu)點，因而在工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用[1]。該酶通過其水解活性可以克服乳糖不耐癥；通過轉(zhuǎn)糖基作用生成益生元—低聚半乳糖[2]。

乳酸菌是公認安全（GRAS）的食品級微生物，因此，乳酸菌來源的酶可以不需進行大量的純化而在各種食品工業(yè)中應(yīng)用[3]。目前乳酸菌中嗜酸乳桿菌[4]、保加利亞桿菌[5]、短乳桿菌[6]等β-半乳糖苷酶的研究較多，而對植物乳桿菌β-半乳糖苷酶的研究相對較少。植物乳桿菌具有耐膽鹽，免疫調(diào)節(jié)等益生功能[7]。本研究采用響應(yīng)面法對植物乳桿菌產(chǎn)β-半乳糖苷酶的培養(yǎng)基進行優(yōu)化，以提高β-半乳糖苷酶的產(chǎn)量，為菌株進一步工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌KLDS1.0628，鄰硝基苯酚-β-D-半乳糖苷（ONPG），鄰硝基酚（ONP），其他試劑均為市售國產(chǎn)分析純或化學純。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，乳糖20 g，檸檬酸氫二銨2 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，乙酸鈉0.5 g，磷酸氫二鉀2 g，吐溫-80 1 g，定容至1 000 mL，pH自然，121℃滅菌15 min。發(fā)酵培養(yǎng)基 蛋白胨10 g，酵母粉5 g，乳糖20 g，檸檬酸氫二銨2 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，乙酸鈉0.5 g，磷酸氫二鉀2 g，吐溫-80 1 g，定容至1 000 mL，調(diào)pH為6.0，121 ℃滅菌15 min

1.2 儀器與設(shè)備

GL-21M冷凍離心機，DU800紫外/可見光分光光度計，Delta 320 pH計，DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱，JY96-IIN超聲波細胞粉碎機。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液制備

將植物乳桿菌在種子培養(yǎng)基中活化3代，按體積分數(shù)為1%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h，以8 000 r/min（10 min）、4 ℃條件離心菌體，去上清，取等體積磷酸鈉緩沖液重懸菌體，以8 000 r/min（10 min）、4℃條件離心菌體，去上清，完成一次菌泥的洗滌；重復(fù)洗滌三次，獲得的菌泥在冰水浴中進行超聲波破碎，工作1 s，間歇2 s，破碎時間15 min，將裂解后的菌液于4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液，即為粗酶液。

1.3.2 酶活力測定

向試管中加入2.5 mL，pH值為7.0濃度為50 mmol/L的磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉緩沖液，加入100 μL質(zhì)量濃度為4 mg/mL（ONPG）溶液和100 μL酶液，40℃恒溫反應(yīng)10 min后加入0.3 mL濃度為1 mol/L的Na2CO3溶液中止反應(yīng)，于420 nm下測定吸光度。采用國際酶活單位：1 mL酶液1 min催化鄰硝基苯酚-β-D-半乳糖苷（ONPG）水解生成1 μmol鄰硝基酚（ONP）定義為一個酶活單位。用己知濃度ONP溶液做標準曲線，根據(jù)ONP的濃度c對應(yīng)的OD值，利用最小二乘法建回歸方程：OD=4.4984c-0.0045 R2=0.9996。酶活計算公式為

式中：V1為反應(yīng)混合液總體積（mL）；4.50為在實驗條件下1 μmol/mL的ONP吸光度；t為反應(yīng)時間（min）；V2為酶液體積（mL）；n為稀釋倍數(shù)。

1.3.3 不同碳源對植物乳桿菌產(chǎn)β-半乳糖苷酶活力的影響

以發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，選擇葡萄糖、葡萄糖與乳糖質(zhì)量比1：1的混合糖、麥芽糖、蔗糖、半乳糖替代發(fā)酵培養(yǎng)基中的乳糖，質(zhì)量分數(shù)都為2%，調(diào)初始pH值為6.0。按1%接種量接種種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37℃，置于恒溫箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24 h，測定β-半乳糖苷酶酶活力。

1.3.4 不同氮源對植物乳桿菌產(chǎn)β-半乳糖苷酶活力的影響

以發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，選擇蛋白胨、酵母粉、酪蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、大豆蛋白胨替代發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源（即蛋白胨、酵母粉），質(zhì)量分數(shù)都為1.5%，調(diào)初始pH值為6.0。按1%接種量接種種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37℃，置于恒溫箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24 h，測定β-半乳糖苷酶酶活力。

1.3.5 對植物乳桿菌產(chǎn)酶活力影響

本研究對影響產(chǎn)酶活力的9個因素進行篩選，9個因素包括：乳糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、乙酸鈉、吐溫-80、硫酸鎂、硫酸錳（均為質(zhì)量分數(shù)）。每個變量分別設(shè)定高（+1）和低（-1）兩個水平，實驗因素水平如表1所示。按照Plackett-Burman設(shè)計對數(shù)據(jù)進行分析，得到影響酶活的最主要因素。

1.3.6 最陡爬坡實驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果分析確定主要影響因素，以擬合的回歸方程模型的系數(shù)符號和大小來設(shè)定主要因素的步長和變化方向，即對主要因素進行質(zhì)量濃度梯度設(shè)計，能快速、經(jīng)濟地逼近最佳值區(qū)域。

表1 Plackett-Burman實驗設(shè)計參數(shù)與水平

1.3.7 中心組合試驗設(shè)計（BBD）

以最坡爬坡設(shè)計得出的實驗結(jié)果為依據(jù)確定Box-Behnken實驗設(shè)計的中心點和步長，結(jié)果如表2所示。響應(yīng)值為β-半乳糖苷酶活，主要影響因素為自變量，利用 Design-Expert實驗軟件進行Box-Behnken實驗設(shè)計和數(shù)據(jù)的分析。

表2 BBD實驗因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源的影響

圖1 碳源對β-半乳糖苷酶活力的影響

由圖1可以看出，該菌以乳糖為唯一碳源時，β-半乳糖苷酶酶活最高，而當乳糖和葡萄糖共同作為碳源時，酶活明顯降低，說明該菌株生物合成的β-半乳糖苷酶受乳糖操縱子的調(diào)控，是誘導酶，與已報道的乳糖對雙歧桿菌[8]和嗜酸乳桿菌[9]影響一致。而Kim和Rajagopal研究發(fā)現(xiàn)半乳糖比乳糖對卷曲乳桿菌產(chǎn)β-半乳糖苷酶具有更強的誘導作用[10]，宋園亮等研究發(fā)現(xiàn)以葡萄糖作為碳源時，短乳桿菌產(chǎn)β-半乳糖苷酶活性最高[6]。由此可見，不同碳源對產(chǎn)酶的影響因菌株的變化而不同。

2.2 不同氮源的影響

圖2 氮源對β-半乳糖苷酶活力的影響

由圖2可知，該菌采用唯一氮源時，6種氮源中酵母粉效果最好。但其酶活低于以蛋白胨和酵母粉為混合氮源的對照組，此時菌體所產(chǎn)酶的酶活為最大，說明蛋白胨和酵母粉這兩種氮源中的某些成分具有一定的協(xié)同作用。因此選取蛋白胨和酵母粉混合氮源作為培養(yǎng)植物乳桿菌KLDS1.0628的氮源。

2.3 重要因素篩選實驗

Plackett-Burman實驗設(shè)計及結(jié)果如表3所示，實驗的回歸分析如表4所示。

表3 Plackett-Burman實驗設(shè)計及結(jié)果

表4 Plackett-Burman實驗的回歸分析

由表4可以看出，9種培養(yǎng)基成分對植物乳桿菌產(chǎn)β-半乳糖苷酶影響的顯著性排列為：乳糖＞乙酸鈉＞檸檬酸氫二銨＞吐溫80＞酵母粉＞K2HPO4＞硫酸錳＞蛋白胨＞硫酸鎂。其中，乳糖、乙酸鈉、檸檬酸氫二銨影響最為顯著，可作為進一步優(yōu)化的因素。

2.4 最陡爬坡實驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果設(shè)計，按一定的梯度改變?nèi)樘?、檸檬酸氫二銨和乙酸鈉在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度，檸檬酸氫二銨和乙酸鈉是正效應(yīng)，應(yīng)依次增大；乳糖是負效應(yīng)，應(yīng)依次減?。黄渌侵饕蛩馗鶕?jù)表4中的估計系數(shù)的正負取Plackett-Burman設(shè)計中的最大值或最小值，實驗設(shè)計及結(jié)果如表5所示。

表5 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果

結(jié)果表明，隨著乳糖濃度逐漸減小，檸檬酸氫二銨和乙酸鈉濃度逐漸增大，酶活呈現(xiàn)先增大后減小的變化。當乳糖質(zhì)量濃度為15 g/L，檸檬酸氫二銨為5.0 g/L，乙酸鈉為10 g/L時，酶活達到最大。因此以實驗編號3各因素水平為中心值設(shè)計后續(xù)響應(yīng)面實驗。

2.5 Box-Benhnken試驗設(shè)計與響應(yīng)面分析

以β-半乳糖苷酶活力為響應(yīng)值Y，選取乳糖A、檸檬酸氫二銨B、乙酸鈉C三個因素進行設(shè)計，Box-Benhnken試驗設(shè)計及結(jié)果如表6所示。

表6 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果

根據(jù)試驗結(jié)果，采用逐步回歸的方法進行二次回歸分析，得到相應(yīng)的回歸方程式為Y=3.28+0.21A+0.20B+0.083C-0.023AB+0.048AC-0.12BC-0.20A2-0.11B2-0.20C2。對回歸模型進行方差分析，結(jié)果表明：該方程回歸顯著，模型的R2值為0.9425，說明回歸方程的擬合程度良好，失擬項為0.0984，大于0.05，因此回歸模型適合，不需對回歸議程調(diào)整[11]。

構(gòu)建β-半乳糖苷酶活與發(fā)酵培養(yǎng)組分乳糖、乙酸鈉、檸檬酸氫二銨的三維空間響應(yīng)面圖，結(jié)果如圖3～圖5所示。

表7 回歸模型方差分析

圖3 乳糖與檸檬酸氫二銨對β-半乳糖苷酶活力的影響

圖4 乳糖與乙酸鈉對β-半乳糖苷酶活力的影響

圖5 乙酸鈉與檸檬酸氫二銨對β-半乳糖苷酶活力的影響

圖3～圖5直觀地反映了各因素交互作用對β-半乳糖苷酶的影響。比較三組圖可知，乳糖和乙酸鈉對β-半乳糖苷酶活力的影響比檸檬酸氫二銨對β-半乳糖苷酶活力的影響更為顯著。根據(jù)Design-Expert軟件得到的回歸方程可計算得到Y(jié)的最大估計值為3.40 U/mL，此時乳糖 16.41 g/L，乙酸鈉 10.21 g/L，檸檬酸氫二銨5.83 g/L。

2.6 驗證實驗

為檢驗響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基進行驗證實驗，重復(fù)3次，測得的酶活平均值為3.32 U/mL，與理論預(yù)測值3.40 U/mL基本一致，因此，基于響應(yīng)曲面法所得的β-半乳糖苷酶發(fā)酵培養(yǎng)基參數(shù)準確可靠。

3 結(jié)論

在發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗中,首先采用單因素試驗對植物乳桿菌KLDS1.0628產(chǎn)β-半乳糖苷酶的最佳碳源、氮源進行優(yōu)化，得到最佳碳源為乳糖，最佳氮源為蛋白胨和酵母粉。而Duraiswamy Gobinath研究發(fā)現(xiàn)半乳糖為碳源時，Lactobacillus plantarum MCC2156產(chǎn)β-半乳糖苷酶活性最高[12]。以乳糖為最佳碳源說明其具有利用工業(yè)廢料乳清的潛力，從而降低β-半乳糖苷酶生產(chǎn)成本。通過Plackett-Burman試驗篩選出對酶活影響主要的3個因素即乳糖、檸檬酸氫二銨、乙酸鈉，然后以最陡爬坡試驗結(jié)果為中心點，利用Box-Benhnken試驗設(shè)計并進行響應(yīng)面分析,優(yōu)化得出植物乳桿菌KLDS1.0628發(fā)酵最佳質(zhì)量濃度分別為：乳糖16.41 g/L，乙酸鈉10.21 g/L，檸檬酸氫二銨5.83 g/L，利用該培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，測得的酶活平均值為3.32 U/mL，與理論預(yù)測值3.40 U/mL基本一致，酶活比優(yōu)化前提高了73.8%。

[1]PARK A R，OH D K.Galacto-oligosaccharide production using microbial β -galactosidase：Current state and perspectives,[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2010,85（5）：1279-1286.

[2]RYCROFT,CE,JONES,MR,GIBSON,A comparative in vitro evaluation of the fermentation properties of prebiotic oligosaccharides.[J]Appl.Microbiol,2001,91：878-887.

[3]VASILJEVIC,T.；JELEN,P.Lactose hydrolysis in milk as affected by neutralizers used for the preparation of crude β-galactosidase extracts from Lactobacillus bulgaricus 11842[J].Innovative Food Science&Emerging Technologies,2002,3（2）：175-184

[4]HUZAIFA S.CHOONIA,LELE S S,Three phase partitioning of β-galactosidase produced by an indigenous Lactobacillus acidophilus isolate[J].Separation and Purification Technology,2013,104（01）：44-50.

[5]MOEZ RHIMI,NUSHIN AGHAJARIB.Exploring the acid tolerance of β -galactosidase from Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus：an attractive enzyme for lactose bioconversion[J].Research in Microbiology,2009,160（10）：775-784.

[6]宋園亮，殷建忠等.云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中產(chǎn)β-半乳糖苷酶乳酸菌的篩選及其產(chǎn)酶條件的研究[J].Chinese Journal of Microecology，2011,23（5）：398-403

[7]郭本恒，益生菌[M].北京：化學工業(yè)出版社,2004：415-422.

[8]HSU,CA,YU,R C,CHOU,C.C.Production of β-galactosidase by Bifidobacteria as influenced by various culture conditions.[J].International Journal of Food Microbiology,2005,104（2）：197-206.

[9]AKOLKAR,S K,SAJGURE,A,LELE,S.S.Lactase production from Lactobacillus acidophilus.[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2005,21（6）：1119-1122.

[10]KIM,J W,RAJAGOPAL,S.N.Isolation and characterization of β-galactosidase from Lactobacillus crispatus.[J].Folia Microbiologica,2000,45（1）：29-34.

[11]左愛連,張偉國.利用Design-Expert軟件優(yōu)化絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基[J].生物技術(shù),2008,18（3）：45-49.

[12]DURAISWAMY GOBINATH,Permeabilized probiotic Lactobacillus plantarum as a source of β-galactosidase for the synthesis of prebiotic galactooligosaccharides.[J].Biotechnol Lett 2014,36（1）：153-157.