HPLC測(cè)定中添加劑前處理方法的探討

孫偉，王榮榮，汪清美

（信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 a生物技術(shù)系，b食品科學(xué)系，河南信陽(yáng) 464000）

0 引言

近年來(lái)，食品添加劑在各類(lèi)食品飲料中超范圍、超量使用，形成了消費(fèi)領(lǐng)域的一股暗流。國(guó)家對(duì)山梨酸、苯甲酸、糖精鈉的使用都有明確的限量標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法[1-2]。國(guó)標(biāo)HPLC法只規(guī)定了汽水、果汁類(lèi)、酒類(lèi)飲料品中測(cè)定苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的前處理方法，而GB2760也未對(duì)其他類(lèi)食品作規(guī)定。酸牛奶除含有大量的蛋白質(zhì)外，還含有增稠劑、穩(wěn)定劑等，給HPLC法測(cè)定這類(lèi)樣品中的苯甲酸、山梨酸、糖精鈉帶來(lái)很多困難。

準(zhǔn)確測(cè)定酸牛奶中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的含量，關(guān)鍵是快速、高效的沉淀蛋白質(zhì)。常用的沉淀蛋白質(zhì)的方法有：加熱、加堿或酸、加入氧化劑、離心、加重金屬鹽、加有機(jī)溶劑、加入濃的鹽溶液[3]。在實(shí)驗(yàn)中傳統(tǒng)的處理方法是用亞鐵氰化鉀－乙酸鋅[4]來(lái)沉淀蛋白質(zhì)。本文結(jié)合在文獻(xiàn)中曾報(bào)道過(guò)的4種化學(xué)沉淀劑，分別是：無(wú)水乙醇[5]、硫酸銅[6]、硫酸銅－氫氧化鈉[7]、高氯酸[8]，通過(guò)實(shí)驗(yàn)與傳統(tǒng)方法相對(duì)比，尋求可替代傳統(tǒng)方法的沉淀劑。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器及試劑

1.1.1 儀器

SCL-10AVP高效液相色譜儀，帶紫外檢測(cè)器，N2000色譜工作站。旋渦混合器（QL-901）。00.45 μm濾膜，10 μL注射器。

1.1.2 試劑

苯甲酸（SB）、山梨酸（SA）糖精鈉（Sac）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（質(zhì)量濃度1.0 g/L）；甲醇、乙醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水，溶液為水溶液。

質(zhì)量濃度為1.54 g/L乙酸銨溶液（稱(chēng)取1.54g乙酸銨加水至1000 mL，溶解，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾）；濃度為106 g/L亞鐵氰化鉀溶液（稱(chēng)取10.6 g亞鐵氰化鉀加水至100 mL）；質(zhì)量濃度為219 g/L乙酸鋅溶液（稱(chēng)取21.9 g乙酸鋅加冰乙酸3 mL加水至100 mL）；質(zhì)量濃度為20 g/L碳酸氫鈉溶液（稱(chēng)取2 g碳酸氫鈉加水至100 mL）；濃度為50.0 g/L硫酸銅溶液（稱(chēng)取5.00 g硫酸銅加水至100 mL）；質(zhì)量濃度為200 g/L硫酸銅溶液（稱(chēng)取20 g硫酸銅加水至100 mL）；質(zhì)量濃度為40 g/L氫氧化鈉溶液（稱(chēng)取4 g氫氧化鈉加水至100 mL）。體積分?jǐn)?shù)為5%高氯酸溶液（移取5 mL高氯酸加水至100 mL）；（1+1）氨水（氨水加等體積水混合）。

1.2 色譜分析條件

色譜柱為 VP-ODS，4.6mm×150mmC18色譜柱。流動(dòng)相為甲醇∶乙酸銨溶液（0.02 mol/L）=5∶95（體積分?jǐn)?shù)）；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL。檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)230 nm，靈敏度0.2 AUFS。

1.3 樣品處理

1.3.1 106 g/L亞鐵氰化鉀－219 g/L乙酸鋅溶液

稱(chēng)取10.00 g樣品置于50 mL具塞比色管中，加少量的水，加質(zhì)量濃度為106 g/L亞鐵氰化鉀溶液5.0 mL，質(zhì)量濃度為219 g/L乙酸鋅溶液5.0 mL，用水定容至50 mL，搖勻。

1.3.2 5%硫酸銅溶液

稱(chēng)取10.00 g樣品置于50 ml具塞比色管中，加少量的水，加質(zhì)量濃度為50.0 g/L硫酸銅溶液10 mL，定容至50 mL，搖勻。

1.3.3 200 g/L硫酸銅－40 g/L氫氧化鈉溶液

稱(chēng)取10.00 g樣品置于50 mL具塞比色管中，加少量的水，加質(zhì)量濃度200 g/L硫酸銅溶液8 mL，混勻，再加質(zhì)量濃度為40 g/L氫氧化鈉溶液2 mL，用水定容至50 mL，搖勻。

1.3.4 體積分?jǐn)?shù)5%高氯酸溶液

稱(chēng)取10.00 g樣品置于50 mL具塞比色管中，加少量的水，加體積分?jǐn)?shù)為5%高氯酸溶液10 mL，用水定容至50 mL，搖勻。

靜置30 min后，分別移取經(jīng)上述處理過(guò)的樣品10 mL于離心機(jī)中，以轉(zhuǎn)速為4 000 r/min離心10 min，然后取上層清液經(jīng)0.45 μm濾頭過(guò)濾，待儀器穩(wěn)定后進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 無(wú)水乙醇

稱(chēng)取10.00 g樣品置于50 mL具塞比色管中，加無(wú)水乙醇定容至50 mL，搖勻。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別吸取苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0，0.50，1.00，1.50，2.00 mL于10 mL容量瓶中加水定容到刻度。苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)使用溶液質(zhì)量濃度分別為 0，0.05，0.10，0.15，0.20 g/L，混勻后經(jīng)0.45 μm濾頭過(guò)濾，進(jìn)行測(cè)定，以濃度對(duì)應(yīng)峰面積作線性回歸。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)沉淀劑的直觀比較

分別用質(zhì)量濃度106 g/L亞鐵氰化鉀－219 g/L乙酸鋅溶液、無(wú)水乙醇、質(zhì)量濃度為50.0 g/L硫酸銅溶液、質(zhì)量濃度200 g/L硫酸銅－40 g/L氫氧化鈉溶液、體積分?jǐn)?shù)5%高氯酸溶液處理樣品，定容并搖勻。在靜止的30 min內(nèi)觀察沉淀的情況，結(jié)果如表1所示。

表1 5種沉淀劑的沉淀結(jié)果（n=3）

由表1可以看出，用傳統(tǒng)方法質(zhì)量濃度106 g/L亞鐵氰化鉀－219 g/L乙酸鋅溶液沉淀蛋白質(zhì)時(shí)間最短，速度最快，蛋白質(zhì)沉淀較完全。無(wú)水乙醇沉淀蛋白質(zhì)的速度較快。質(zhì)量濃度200 g/L硫酸銅－40 g/L氫氧化鈉溶液、體積分?jǐn)?shù)5%高氯酸溶液沉淀蛋白質(zhì)的速度相近，次于無(wú)水乙醇。質(zhì)量濃度為50.0 g/L硫酸銅溶液對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀速度最慢。

2.2 流動(dòng)相配比的選擇

流動(dòng)相中的甲醇起黑殺菌、防腐的作用，同時(shí)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性，改變組分出峰時(shí)間、分離效果，得到較好的圖譜；加入乙酸銨則是調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，使待測(cè)物的峰形不致變壞[9]。流動(dòng)相中不同配比的甲醇與乙酸銨，會(huì)使苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的保留時(shí)間發(fā)生顯著的變化。增加甲醇的含量會(huì)使擴(kuò)散效應(yīng)減小，峰形尖銳，出峰時(shí)間提前，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的峰可能產(chǎn)生重疊；而減少甲醇的含量會(huì)使擴(kuò)散效應(yīng)增大，峰形較差，出峰時(shí)間變慢，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的分離效果較好。糖精鈉的保留時(shí)間對(duì)甲醇質(zhì)量濃度最敏感，為了達(dá)到較好的分離效果和分離時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)采用國(guó)標(biāo)[1,2]中色譜分析條件：甲醇∶乙酸銨溶液（質(zhì)量濃度1.540 g/L）為（5∶95，體積比）。標(biāo)準(zhǔn)譜圖如圖1所示，由圖1可以看出，出峰的順序依次是苯甲酸、山梨酸、糖精鈉，保留時(shí)間分別是9.390，12.707，20.157 min。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

在選定的色譜分析條件下，得到苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)使用溶液濃度X與峰面積Y之間的工作曲線呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的回歸方程和線性范圍如表2所示。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

2.4 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

按照實(shí)驗(yàn)選定的色譜分析條件，采用加標(biāo)回收率的方法來(lái)評(píng)定方法準(zhǔn)確度，向已知酸牛奶樣品中分別加入標(biāo)準(zhǔn)添加劑樣品，用以上5種方法沉淀蛋白質(zhì)，測(cè)定加入后酸牛奶樣品中添加劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，各三次，計(jì)算回收率，并分析相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表3所示。

表3 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 mg/kg

2.5 討 論

酸牛奶樣品預(yù)處理的關(guān)鍵在于如何完全除去蛋白質(zhì)，且不影響測(cè)量結(jié)果，即尋找一種較為理想的沉淀劑。這里分別采用了常用的質(zhì)量濃度106 g/L亞鐵氰化鉀－219 g/L乙酸鋅溶液、無(wú)水乙醇、質(zhì)量濃度為50.0 g/L硫酸銅溶液、質(zhì)量濃度200 g/L硫酸銅－40 g/L氫氧化鈉溶液、體積分?jǐn)?shù)5%高氯酸溶液來(lái)沉淀樣品中的蛋白質(zhì)。從加標(biāo)平均回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果的來(lái)看，5種方法的回收率和精密度均符合測(cè)定要求。

質(zhì)量濃度為50.0 g/L硫酸銅溶液沉淀蛋白質(zhì)的速度最慢，所測(cè)的結(jié)果與傳統(tǒng)方法差距很大。質(zhì)量濃度200 g/L硫酸銅－40 g/L氫氧化鈉溶液、體積分?jǐn)?shù)5%高氯酸溶液沉淀蛋白質(zhì)的速度較快，但是所測(cè)的數(shù)值與傳統(tǒng)方法有差距。而無(wú)水乙醇的沉淀速度僅次于質(zhì)量濃度106 g/L亞鐵氰化鉀－219 g/L乙酸鋅溶液，對(duì)待測(cè)物含量的影響相對(duì)于質(zhì)量濃度200g/L硫酸銅－40 g/L氫氧化鈉溶液、5%高氯酸溶液、質(zhì)量濃度為50.0g/L硫酸銅溶液較小，與用傳統(tǒng)方法質(zhì)量濃度106g/L亞鐵氰化鉀－219 g/L乙酸鋅溶液測(cè)得的數(shù)值最相近，精密度高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性好，但是在樣品離心時(shí)需要用具塞離心管以防止乙醇的揮發(fā)，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

樣品處理選擇提取溶劑時(shí)，不僅要考慮浸提溶劑是否與待測(cè)組分發(fā)生反應(yīng)、欲分析物質(zhì)在溶劑中溶解性，還要考慮到溶劑的毒性[10]。傳統(tǒng)方法亞鐵氰化鉀溶液在使用過(guò)程中受熱分解產(chǎn)生氰化物有劇毒而無(wú)水乙醇沒(méi)有毒性。另外，作為一種有機(jī)溶劑，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉均易溶于無(wú)水乙醇。故綜合沉淀的時(shí)間、濾液的澄清度、提取溶劑的毒性及待分析物質(zhì)溶解性的差異，無(wú)水乙醇可以作為質(zhì)量濃度106 g/L亞鐵氰化鉀－219 g/L乙酸鋅溶液的替代物。

[1]GB/T 5009.28-2003食品中糖精鈉的測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

[2]GB/T 5009.29-2003食品中山梨酸、苯甲酸的測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

[3]黃雄偉.鹽提法提取黃粉蟲(chóng)蛋白質(zhì)工藝研究［J］.食品與機(jī)械，2010，26（3）：150-152.

[4]GB/T 5009.33-2003食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

[5]劉賜敏，周金森，劉鈺釵，等.HPLC測(cè)定乳制品中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的前處理方法研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2006，11（16）：1315-1316.

[6]祝偉霞，魏蔚，楊冀州，等.高效液相色譜法測(cè)定乳飲料和奶制品中苯甲酸和山梨酸[J].中國(guó)國(guó)家衛(wèi)生檢疫雜志，2005，28（5）：280-281.

[7]李白玉，鄭兵福，蔣立文，等.四棱豆蛋白質(zhì)提取工藝研究[J].食品與機(jī)械，2010，26（2）：126-128.

[8]楊潔，夏虹，彭茂民.含乳飲料中山梨酸·苯甲酸·糖精鈉的含量測(cè)定前處理方法初探[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（25）：7729-7730.

[9]朱建豐.HPLC同時(shí)測(cè)定豆制品中常見(jiàn)的3種食品添加劑[J].食品與機(jī)械，2012，28（4）：87-89.

[10]汪輝,曹小彥,李林,等.反相高效液相色譜法對(duì)果蔬汁飲料中14種常見(jiàn)食品添加劑的快速測(cè)定[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2009,28（10）：1194-1197.