開菲爾粒增殖條件的優(yōu)化研究

劉克營(yíng)，鐘浩，郭愛珍，劉朋龍，王亮

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.天潤(rùn)乳業(yè)股份有限公司，烏魯木齊830000）

0 引言

開菲爾粒是一種天然的發(fā)酵劑，其中乳酸菌最多，其次是酵母菌和醋酸菌[1]。開菲爾粒在發(fā)酵過程中容易造成發(fā)酵不均勻等問題，嚴(yán)重影響了開菲爾的風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)[2-3]。而純培養(yǎng)發(fā)酵劑不僅連續(xù)傳代活力不穩(wěn)定，而且易發(fā)生雜菌污染或共生菌群失衡，產(chǎn)品的質(zhì)量不穩(wěn)定，從而使傳統(tǒng)開菲爾飲品難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[4]。而開菲爾粒凍干粉的使用可以有效解決以上難題，因此，開菲爾粒的生產(chǎn)至關(guān)重要。

目前，許多研究從不同的角度分析了不同的因素對(duì)開菲爾粒增殖的影響[5-11]，但仍需要不斷的探索和研究。本研究對(duì)開菲爾粒發(fā)酵過程中的物理因素、pH值、營(yíng)養(yǎng)條件進(jìn)行研究，從而找出最佳的開菲爾粒增值條件，擴(kuò)大開菲爾粒凍干粉的生產(chǎn)，促進(jìn)開菲爾產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

純牛奶（市售），低脂牛奶（市售），脫脂牛奶（市售），開菲爾粒，胰蛋白胨LP0037，酵母提取物L(fēng)P0021，蔗糖，乳糖，葡萄糖，氯化鈉。

1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，KH2PO4為2 g，檸檬二銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫80為1mL，MgSO4·7H2O為0.58 g，Mn-SO4·4H2O 為 0.25 g，蒸餾水1000 mL，pH值為6.2～6.4。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.4。

1.3 儀器

SW-CJ系列潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），QYC 200全溫空氣搖床，pH計(jì)，BPMJ-250F型霉菌培養(yǎng)箱，手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，BSA124S-CW電子天平，LSHZ-300型低溫水浴培養(yǎng)箱。

1.4 方法

1.4.1 開菲爾粒的活化

將凍存的開菲爾粒取出，按2%的比例接種到滅菌乳中，在28℃，100 r/min條件下培養(yǎng)，每24 h，測(cè)發(fā)酵液的pH值，并將開菲爾粒重新接種到新鮮滅菌乳中。重復(fù)6 d。

1.4.2 開菲爾粒的增殖

1.4.2.1 物理因素對(duì)開菲爾粒增值的影響。

（1）清洗攪拌對(duì)開菲爾粒增值的影響。將4份滅菌乳放入三角瓶中，然后將開菲爾粒按2%的比例接種到滅菌乳中。①攪拌，100 r/min，28℃條件下,每24 h過濾出開菲爾粒，無菌水沖洗，用無菌濾紙吸干開菲爾粒表面水分稱重。②攪拌，100 r/min，28℃條件下,每24 h過濾出開菲爾粒，用無菌濾紙吸干開菲爾粒表面水分稱重。③不攪拌，28℃條件下,每24 h過濾出開菲爾粒，無菌水沖洗，用無菌濾紙吸干開菲爾粒表面水分稱重。④不攪拌，28℃條件下,每24 h過濾出開菲爾粒，用無菌濾紙吸干開菲爾粒表面水分稱重，最后再次接種到新鮮的滅菌乳中。如此重復(fù)6 d。

（2）開菲爾粒的大小對(duì)開菲爾粒增殖的影響。將直徑為大于1 cm、0.5～1 cm和小于0.5 cm的開菲爾粒按2%的比例分別接種到滅菌乳中，100 r/min，28℃條件下培養(yǎng)，每24小時(shí)過濾出開菲爾粒，用無菌濾紙吸干開菲爾粒表面水分稱重。如此重復(fù)6 d。

（3）不同的發(fā)酵條件對(duì)開菲爾粒增殖的影響。以發(fā)酵溫度、接種量、攪拌速度、發(fā)酵時(shí)間為因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)（表1），到時(shí)間后，用無菌濾紙吸干開菲爾粒表面水分后稱重，然后再次接種到新鮮的滅菌乳中。如此重復(fù)6 d。

表1 正交實(shí)驗(yàn)（I）

1.4.2.2 pH值對(duì)開菲爾粒增殖的影響。

準(zhǔn)備3份活化的開菲爾粒，分別做以下處理：①取一份接種到滅菌乳中，連續(xù)培養(yǎng)3 d不作處理，3 d后取出測(cè)定開菲爾粒的質(zhì)量。②取一份接種到滅菌乳中，每天用濃度為0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值至6.45，連續(xù)培養(yǎng)3 d，3 d后取出測(cè)定開菲爾粒的質(zhì)量。③取一份接種到滅菌乳中，每天更換培養(yǎng)基，測(cè)定開菲爾粒的質(zhì)量，其中培養(yǎng)條件均為30℃，120 r/min。

1.4.2.3 營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)開菲爾粒增殖的影響。

（1）不同的培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)開菲爾粒增殖的影響。將開菲爾粒按2%的比例接種到相同體積的滅菌乳，MRS培養(yǎng)液，LB培養(yǎng)液中攪拌培養(yǎng)，30℃（120 r/min）條件下培養(yǎng)，每24 h過濾出開菲爾粒，用無菌濾紙吸干開菲爾粒表面水分稱重，如此重復(fù)6 d。

（2）不同碳源對(duì)開菲爾粒增值的影響。在滅菌乳中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的乳糖、葡萄糖、蔗糖，然后接種開菲爾粒，在最佳的條件下培養(yǎng)，30℃（120 r/min）條件下培養(yǎng)，每24 h過濾出開菲爾粒，無菌濾紙吸干開菲爾粒表面水分后稱重，然后再次接種到新鮮的滅菌乳中，如此重復(fù)6 d。

（3）不同氮源對(duì)開菲爾粒增殖的影響。在滅菌乳中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的胰蛋白胨、酵母粉，然后接種開菲爾粒，在最佳的條件下培養(yǎng)，30℃（120 r/min）條件下培養(yǎng)，每24 h過濾出開菲爾粒，無菌濾紙吸干開菲爾粒表面水分后稱重，然后再次接種到新鮮的滅菌乳中，如此重復(fù)6 d。

（4）正交實(shí)驗(yàn)。在上述實(shí)驗(yàn)得到的最佳的條件基礎(chǔ)上，然后以碳源、氮源、脂肪和氯化鈉為因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)（表2），30℃（120 r/min）條件下培養(yǎng)，每24h過濾出開菲爾粒，無菌濾紙吸干開菲爾粒表面水分后稱重，然后再次接種到相應(yīng)的新鮮的滅菌乳中，如此重復(fù)6 d。

表2 正交實(shí)驗(yàn)（II） %

2 結(jié)果與分析

2.1 開菲爾粒的活化

開菲爾粒低溫保存時(shí)，開菲爾粒中菌種活性保持很低的水平，在活化的過程中，菌種的活性逐漸達(dá)到最佳狀態(tài)。由圖1可以看出，隨著活化的進(jìn)行，發(fā)酵液的pH值逐漸降低，當(dāng)開菲爾?；罨?次后，發(fā)酵液pH值在3.9左右波動(dòng)，這說明開菲爾粒的活化狀態(tài)已達(dá)到最佳狀態(tài)。

圖1 開菲爾粒的活化

2.2 開菲爾粒的增殖

2.2.1 物理因素對(duì)開菲爾粒增殖的影響

（1）清洗攪拌對(duì)開菲爾粒增值的影響。開菲爾粒表面的清洗可以有效地避免開菲爾粒表面雜菌的污染，而攪拌也可以防止霉菌在開菲爾的表面生長(zhǎng)[5]。雖然清洗和攪拌在防止污染方面起到一定的作用，但阻礙了開菲爾粒的增殖。由圖2可以看出，攪拌有利于開菲爾粒的增殖，而清洗不利于開菲爾粒的增殖。

這是由于在攪拌的過程中，加大了發(fā)酵液中的氧氣質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及有利于營(yíng)養(yǎng)成分分布均勻，從而加快了開菲爾粒中的酵母菌、乳酸菌和醋酸菌的生長(zhǎng)，因此攪拌有利于開菲爾粒的增殖[12]。另外，開菲爾粒在增殖的過程中會(huì)在開菲爾粒的表面形成一層多糖物質(zhì)，即為開菲爾粒的組成成分，而在清洗的過程中，這種多糖物質(zhì)會(huì)被破壞，從而影響開菲爾粒的增殖。所以攪拌不清洗的效果是最好的，七天的培養(yǎng)使開菲爾粒的增殖率達(dá)到106%，增加了一倍。

圖2 攪拌清洗對(duì)開菲爾粒增殖的影響

（2）開菲爾粒的大小對(duì)開菲爾粒增殖的影響。開菲爾粒是由多糖物質(zhì)、蛋白質(zhì)和各種菌種組成的粒狀發(fā)酵劑，而菌種在開菲爾粒的表面和內(nèi)部都有分布[12-15]。開菲爾粒的增殖過程其實(shí)就是一個(gè)菌種的增殖和多糖物質(zhì)的合成過程，而這個(gè)過程需要開菲爾粒內(nèi)外菌種的共同作用來完成。開菲爾粒的表面積越大，越有利于開菲爾粒內(nèi)部與外部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交流和產(chǎn)物的合成。從而加速菌種的繁殖和多糖物質(zhì)的合成。另外，相同質(zhì)量的開菲爾粒粒徑越小，開菲爾粒的表面積就越大，相反開菲爾粒的表面積就越小。

圖3 粒徑大小對(duì)其增殖的影響

由圖3可以看出，開菲爾粒越小開菲爾粒的生長(zhǎng)速度越快。當(dāng)開菲爾粒的粒徑小于0.5 cm時(shí)，連續(xù)培養(yǎng)7 d開菲爾粒增長(zhǎng)率達(dá)到195.3%，而粒徑超過1 cm的開菲爾粒的增長(zhǎng)率只是141.4%。因此，開菲爾粒的大小對(duì)開菲爾粒增殖是有影響的，開菲爾粒越小越有利于開菲爾粒的增殖，越大越不利于開菲爾粒的增殖。當(dāng)然也不是越小越好，要符合現(xiàn)實(shí)情況。

（3）不同發(fā)酵條件對(duì)開菲爾粒增殖的影響。在已得最佳條件下，進(jìn)行發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、攪拌速度和接種量正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

表3 各因素和接種量正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3可以看出，4種不同的因素對(duì)開菲爾粒增殖的影響大小不同，其影響主次順序是發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞攪拌速度＞接種量。通過表3中的極差分析可得出，開菲爾粒的最佳的增殖條件是發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間24 h，攪拌速度為120 r/min，接種量2%。

2.2.2 pH值對(duì)開菲爾粒增殖的影響

開菲爾粒發(fā)酵前期，發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)成分充足，生長(zhǎng)環(huán)境適宜，開菲爾粒中的菌種代謝旺盛，而隨著發(fā)酵的進(jìn)行，生長(zhǎng)環(huán)境逐漸變的惡劣，減緩了菌種的增殖，同時(shí)因?yàn)樗嵝缘脑鰪?qiáng)，抑制了產(chǎn)粘細(xì)菌代謝產(chǎn)生粘性多糖，從而阻礙了開菲爾粒的增殖。由表4可以看出，相同條件下，3處理比1處理的增長(zhǎng)率高30.3%，而2和3增長(zhǎng)率相差僅6.5%。所以，pH值的變化也是影響開菲爾粒增殖的一個(gè)重要因素。

表4 pH值對(duì)開菲爾粒增殖的

2.2.3 營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)開菲爾粒增殖的影響

（1）不同培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)開菲爾粒增殖的影響。由圖4可以看出，不同培養(yǎng)基影響開菲爾粒的增殖。其中滅菌乳是開菲爾粒增殖的最佳培養(yǎng)基，相同培養(yǎng)條件下，在滅菌乳中開菲爾粒的增殖率達(dá)到85%，MRS次之，LB培養(yǎng)基最差。這是由于開菲爾粒中主要包括乳酸菌和酵母菌，LB培養(yǎng)基雖然是基本培養(yǎng)基，但它不是最佳培養(yǎng)基，它只是為微生物提供基本的生存保證，在里面微生物得不到快速繁殖，而MRS培養(yǎng)基是乳酸菌培養(yǎng)基，它有利于乳酸菌的快速增殖，但是它不利于開菲爾粒中酵母菌的增殖，所以開菲爾粒的增殖速度雖然比在LB培養(yǎng)基中高，但還是不能滿足要求。滅菌乳中各種營(yíng)養(yǎng)成分充足，而且并不對(duì)某種菌進(jìn)行選擇性抑制，這使得乳酸菌和酵母菌都能在滅菌乳中進(jìn)行快速繁殖，從而加速開菲爾粒的增殖。因此，在滅菌乳中，開菲爾粒的增殖率最高。

圖4 培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)開菲爾粒增殖的影響

（2）不同碳源對(duì)開菲爾粒增殖的影響。開菲爾粒中菌種的組成是多樣的，而不同的菌種對(duì)碳源需求是不同的，本試驗(yàn)取了三種基本的糖（乳糖、葡萄糖、蔗糖），研究不同的糖對(duì)開菲爾粒增殖的影響。由圖5可以看出，不是所有的糖對(duì)開菲爾粒的增殖有促進(jìn)作用，相同條件培養(yǎng)，乳糖對(duì)開菲爾粒增殖有明顯的促進(jìn)作用，葡萄糖對(duì)開菲爾粒的增殖的也有促進(jìn)作用，但效果不如乳糖，而蔗糖對(duì)開菲爾粒增殖的作用最小，在一定程度上會(huì)抑制開菲爾粒的增殖。

圖5 不同碳源對(duì)開菲爾粒增殖的影響

圖6 不同碳源對(duì)開菲爾粒增殖的影響

（3）不同氮源對(duì)開菲爾粒增殖的影響。在培養(yǎng)初期，開菲爾粒中的乳酸菌利用乳中氨基酸和蛋白質(zhì)，快速反應(yīng)，產(chǎn)生大量的酸，從而導(dǎo)致了發(fā)酵液中氨基酸和蛋白質(zhì)的不足，抑制了產(chǎn)粘菌種的繁殖和代謝，進(jìn)而影響了開菲爾粒的增殖[5]。本文以胰蛋白胨和酵母提取物為兩種氮源物質(zhì)，以期選出一種對(duì)開菲爾粒增殖最佳的氮源。由圖6可以看出，酵母提取物和胰蛋白胨對(duì)開菲爾粒都有促進(jìn)作用，而添加胰蛋白胨的效果比添加酵母提取物的效果要好。這符合Anine Schoevers等的研究成果，他們發(fā)現(xiàn)在促進(jìn)開菲爾粒增殖方面，胰蛋白胨的效果優(yōu)于酵母提取物[6]。

（4）正交實(shí)驗(yàn)。在已得最佳條件下，進(jìn)行脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)、乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、胰蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表5所示。

由表5可以看出，4種不同的因素對(duì)開菲爾粒增殖的影響大小不同，其影響主次順序是脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞胰蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。通過表5中的極差分析可得出，開菲爾粒的最佳的增殖條件是脫脂牛奶、乳糖0.5%，胰蛋白胨0.5%和氯化鈉0.8%（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。由此可知，乳糖和胰蛋白胨的添加量并不是越多越好。按正交實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖7所示。由圖7可以看出，開菲爾粒的增殖率最低增加了31.08%，因此可知，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。

表5 脂肪、乳糖、胰蛋白胨和氯化鈉正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 %

圖7 最佳條件下開菲爾粒的增長(zhǎng)

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，開菲爾粒在連續(xù)接種培養(yǎng)3天時(shí)達(dá)到最高的活性狀態(tài)，發(fā)酵液的pH值穩(wěn)定在3.9左右。另外，通過對(duì)增殖工藝（清洗攪拌，粒徑大?。┖驮鲋硹l件（培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、接種量、攪拌速度）進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)得出，清洗減緩了開菲爾粒的增殖速度，攪拌有利于開菲爾粒的增殖；當(dāng)粒徑小于0.5 cm時(shí)開菲爾粒的增殖速度最快；而且還得出當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時(shí)間是24 h，攪拌速度為120 r/min和接種量為2%時(shí)，開菲爾粒的增殖速度最大。

另外，研究發(fā)現(xiàn)，相同條件下培養(yǎng)，調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值的變化可使開菲爾粒的增長(zhǎng)率比不做處理的開菲爾粒的增長(zhǎng)率高出23.8%，而這比更換培養(yǎng)基的對(duì)照組僅僅低了6.5%。由此可得出，連續(xù)3 d發(fā)酵的過程中，營(yíng)養(yǎng)成分的變化并不是主要的因素，pH值的變化才是影響開菲爾粒增殖的主要因素。

關(guān)于營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)開菲爾粒增殖的影響。通過單因素試驗(yàn)得出，牛奶是開菲爾粒增殖的最佳營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)；胰蛋白胨的效果比酵母粉的效果好；乳糖對(duì)促進(jìn)開菲爾粒增殖的效果最好，葡萄糖次之，而添加葡糖糖的效果不明顯，甚至在一定程度上削弱了開菲爾粒的增殖速度。另外，通過正交試驗(yàn)得出，當(dāng)使用脫脂牛奶，胰蛋白胨添加量為0.5%，乳糖添加量為0.5%以及氯化鈉添加量為0.8%時(shí)，開菲爾粒的增殖率最高，接近普通牛奶發(fā)酵增殖率的2倍。

最后，利用所得最佳條件進(jìn)行開菲爾粒的增殖實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，開菲爾粒的增殖率比實(shí)驗(yàn)過程中的最佳水平高出31個(gè)百分點(diǎn)，增殖效果明顯。

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