數(shù)字RT-PCR檢測(cè)鯉春病毒血癥的方法建立與應(yīng)用

吳 斌，申翠翠，張晨曦，胡德聰，肇慧君，張 琳

（1.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧大連 116001；2. 大連大學(xué)，遼寧大連 116622；3. 湖北出入境檢驗(yàn)檢疫局，湖北武漢 430050）

數(shù)字RT-PCR檢測(cè)鯉春病毒血癥的方法建立與應(yīng)用

吳 斌1，申翠翠1，張晨曦2，胡德聰3，肇慧君1，張 琳1

（1.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧大連 116001；2. 大連大學(xué)，遼寧大連 116622；3. 湖北出入境檢驗(yàn)檢疫局，湖北武漢 430050）

[目的] 通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR和數(shù)字RT-PCR兩種方法的比對(duì)試驗(yàn)，建立快速檢測(cè)鯉春病毒血癥的數(shù)字RT-PCR方法。[方法]利用同一對(duì)引物和探針，以梯度稀釋的方法測(cè)定兩種方法針對(duì)SVCV的靈敏性、特異性及重現(xiàn)性。[結(jié)果]兩種方法均能夠檢測(cè)出104倍稀釋的SVCV，而數(shù)字RT-PCR可以檢測(cè)出單個(gè)微滴中的SVCV，其靈敏度性高于實(shí)時(shí)定量RT-PCR。同時(shí)，兩種方法的特異性都很強(qiáng)，對(duì)其他病毒，如傳染性胰腺壞死病毒（IPNV）、傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）、病毒性出血敗血病毒（VHSV）均未有擴(kuò)增反應(yīng)。兩種方法的重現(xiàn)性也較好。[結(jié)論]數(shù)字RT-PCR方法比實(shí)時(shí)定量RT-PCR具有更高的靈敏度，在鯉春病毒血癥的早期快速診斷方面具有重要作用。

鯉春病毒血癥（SVC）；數(shù)字RT-PCR；實(shí)時(shí)定量RT-PCR；靈敏性；特異性；重現(xiàn)性

鯉春病毒血癥（spring viraemia of carp ，SVC）又稱鯉魚傳染性腹水癥，是一種急性、出血性傳染性敗血病[1]。該病可以危害鯉魚、鯰魚、鯽魚、鰱魚、鳙魚等[2-3]，在歐亞均有流行[4]。鯉春病毒血癥是魚類口岸檢疫的第一類檢疫對(duì)象，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為需申報(bào)疫病[5]，我國(guó)農(nóng)業(yè)部將其定為一類動(dòng)物疫病。

在鯉春病毒血癥檢測(cè)中，常面臨的問題有：檢測(cè)方法是否準(zhǔn)確，檢測(cè)靈敏度和范圍是否達(dá)到要求。數(shù)字RT-PCR（digital RT-PCR）技術(shù)是通過“油包水”的形式將反應(yīng)體系分割成一個(gè)個(gè)小微滴，然后

進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，并對(duì)發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)的樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)的一種技術(shù)。數(shù)字RT-PCR技術(shù)可以達(dá)到檢測(cè)大量樣品中的微量待測(cè)分子的目的，在疾病檢測(cè)中有著廣泛的應(yīng)用。本文通過比較實(shí)時(shí)定量RT-PCR與數(shù)字RT-PCR兩種檢測(cè)方法的靈敏性、特異性及重現(xiàn)性，建立檢測(cè)SVCV中的數(shù)字RT-PCR方法，并應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，達(dá)到快速檢測(cè)鯉春血癥病毒的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒

實(shí)驗(yàn)室保存的病料，經(jīng)細(xì)胞系EPC（鯉魚上皮瘤細(xì)胞）分離和增殖得到SVCV；特異性檢測(cè)用的傳染性胰腺壞死病毒（IPNV）、傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）、病毒性出血敗血病毒（VHSV）均為實(shí)驗(yàn)室保存；樣品為實(shí)驗(yàn)室接收的病魚材料。

1.1.2 儀器和試劑

1.1.2.1 儀器

實(shí)時(shí)定量RT-PCR儀，Applied Biosystems 公司生產(chǎn)的7300Real-time RT-PCR System；數(shù)字RTPCR儀，伯樂公司生產(chǎn)的QX200Droplet Generator，PX1 RT-PCR Plate Sealer，S1000 Thermal Cycler，QX200 Droplet Reader。

1.1.2.2 試劑

One step prime script RT-RT-PCR kit（perfect real time）試劑盒，購(gòu)自寶生物公司；One-step RT-ddRT-PCR kit for probes試劑盒，購(gòu)自伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針的設(shè)計(jì)

選取SVCV的糖蛋白基因，由大連寶生物公司合成的引物和探針如表1所示。

表1 SVCV引物和探針序列

1.2.2 RNA提取

取魚組織勻漿，采用Takara RNA 提取試劑盒按照要求提取病毒RNA。RNA提取后作為原始模板并分別作10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6稀釋，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實(shí)時(shí)定量RT-PCR試驗(yàn)

用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法測(cè)定SVCV原始模版×100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，IPNV、IHNV、VHSV、NTC（H2O）的擴(kuò)增曲線及Ct值，重復(fù)三次。

1.2.4 數(shù)字RT-PCR試驗(yàn)

采用RT-ddRT-PCR方法測(cè)定SVCV原始模版×100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，IPNV、IHNV、VHSV、NTC（H2O）的擴(kuò)增的微滴數(shù)目，重復(fù)三次。按表2反應(yīng)體系（20μL）配置反應(yīng)液。

表2 數(shù)字RT-PCR反應(yīng)體系

數(shù)字RT-PCR反應(yīng)條件如表3所示。

表3 數(shù)字RT-PCR的反應(yīng)條件

1.2.5 魚類樣品的檢測(cè)

選擇合適的魚類樣品，并用上述方法（1.2.3、1.2.4）進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)體系利用SDS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，查看擴(kuò)增曲線及Ct值，在結(jié)果的判斷過程中，主要以擴(kuò)增曲線是否為“S”型和熒光值得大小作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。數(shù)字RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增結(jié)

束后利用Droplet Reader進(jìn)行結(jié)果的讀取，判斷以存在擴(kuò)增的微滴為準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈敏性分析

2.1.1 實(shí)時(shí)定量RT-PCR的靈敏度

將SVCV原液作10倍系列稀釋，進(jìn)行定量RT-PCR檢測(cè)，圖1表示各個(gè)稀釋度的擴(kuò)增曲線。其中X軸表示RT-PCR的反應(yīng)循環(huán)數(shù)，Y軸表示熒光信號(hào)強(qiáng)度?？梢钥闯觯瑵舛葹樵寄０妗?00、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的7個(gè)數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)實(shí)時(shí)定量RT-RT-PCR均為“S”型的增長(zhǎng)曲線；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，其中原始模版×100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的指數(shù)增長(zhǎng)期的曲線基本平行，反映RT-PCR的擴(kuò)增效率相近；原始模版×10-5、10-6的Ct值與對(duì)照組的Ct值相近，因此檢測(cè)靈敏度為原始模版×10-4。

圖1 SVCV實(shí)時(shí)定量RT-RT-PCR反應(yīng)的擴(kuò)增曲線

2.1.2 數(shù)字RT-PCR的靈敏度

將SVCV原始模板作10倍系列稀釋，進(jìn)行數(shù)字RT-PCR檢測(cè)，圖2表示各個(gè)稀釋度的擴(kuò)增量。其中X軸表示反應(yīng)的微滴數(shù)，Y軸表示熒光信號(hào)強(qiáng)度。可以看出，SVCV的最低檢出限度為原始模板的106倍稀釋。從每個(gè)稀釋度的擴(kuò)增的微滴數(shù)可以看出，原始模版×100、10-1、10-2、10-3、10-4的幾個(gè)稀釋度擴(kuò)增的微滴數(shù)與原始模板的稀釋倍數(shù)成反比，原始模板的擴(kuò)增數(shù)為4 260拷貝/μL，而稀釋104倍是的擴(kuò)增數(shù)僅為4.8拷貝/μL，對(duì)照組的擴(kuò)增數(shù)目為零。

圖2 數(shù)字RT-PCR反應(yīng)對(duì)SVCV檢測(cè)的靈敏性

2.1.3 兩種方法靈敏度的比較

兩種方法檢測(cè)SVCV的靈敏度基本一致，檢測(cè)低限均為10-4稀釋，大于10-4的稀釋倍數(shù)時(shí)，實(shí)時(shí)定量RT-PCR所得到的Ct值與空白對(duì)照的Ct值接近，數(shù)字RT-PCR測(cè)得的拷貝數(shù)分別為0.3，0.53拷貝/μL，雖然發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)的微滴數(shù)雖然少，但是能夠得到檢測(cè)數(shù)值，這是數(shù)字RT-PCR相對(duì)于實(shí)時(shí)定量RT-PCR的優(yōu)點(diǎn)，這一優(yōu)點(diǎn)在SVCV的檢測(cè)尤其是早期預(yù)防中有著重要的應(yīng)用，可以及時(shí)地發(fā)現(xiàn)并控制病原，防治疾病蔓延，減少損失。

2.2 特異性分析

2.2.1 實(shí)時(shí)定量RT-PCR的特異性

提取SVCV、IPNV、IHNV、VHSV核酸，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)，擴(kuò)增曲線如圖3所示，SVCV呈“S”型的擴(kuò)增曲線，而IPNV、IHNV、VHSV的擴(kuò)增曲線為不規(guī)則的折線型，沒有典型的

“S”型的擴(kuò)增曲線，表明引物和探針對(duì)IPNV、IHNV、VHSV均沒發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。

圖3 實(shí)時(shí)定量RT-RT-PCR檢測(cè)SVCV的特異性實(shí)驗(yàn)

2.2.2 數(shù)字RT-PCR的特異性

SVCV、IPNV、IHNV、VHSV 的RNA原始模板的擴(kuò)增情況圖4所示，由圖可知，SVCV病毒的特異性較好，其擴(kuò)增的微滴數(shù)為4790拷貝/μL，而其他三種病毒（IPNV、IHNV、VHSV）的擴(kuò)增數(shù)僅為0.3、0.14、0.25拷貝/μL，可忽略不計(jì)。

圖4 數(shù)字RT-PCR反應(yīng)對(duì)SVCV檢測(cè)的特異性

2.2.3 兩種方法特異性的比較

兩種方法均表現(xiàn)出較強(qiáng)的特異性，均能特異性地?cái)U(kuò)增出SVCV RNA，而對(duì)IPNV、IHNV、VHSV的RNA未出現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)，說明本文設(shè)計(jì)的引物和探針特異性良好，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.3 重現(xiàn)性分析

通過8次重現(xiàn)試驗(yàn)得到實(shí)時(shí)定量RT-PCR與數(shù)字RT-PCR方法檢測(cè)SVCV的重現(xiàn)性，如表4所示?？芍?次重現(xiàn)試驗(yàn)的誤差較小，故實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性較好。其中實(shí)時(shí)定量RT-PCR的Ct值8次重復(fù)使得的標(biāo)準(zhǔn)誤差在0.41～1.29之間，誤差較小；數(shù)字RT-PCR的微滴數(shù)8次重復(fù)試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)誤差小于總微滴數(shù)（Droplet Reader讀取的總微滴數(shù)為2 000個(gè)/μL）的1.5%，重現(xiàn)性良好。

表4 實(shí)時(shí)定量RT-PCR與數(shù)字RT-PCR檢測(cè)的重現(xiàn)性（mean±SE）

2.4 魚類樣品的檢測(cè)

2.4.1 實(shí)時(shí)定量RT-PCR對(duì)樣品的檢測(cè)

用建立的實(shí)時(shí)定量RT-RT-PCR方法檢測(cè)待檢的魚類樣品，在檢測(cè)的過程中，分別以SVCV RNA、健康魚組織RNA和水作為陽性、陰性和空白對(duì)照，以排除假陰性和假陽性的可能性。實(shí)時(shí)定量RT-RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，陽性對(duì)照的結(jié)果呈“S”型的擴(kuò)增曲線，空白對(duì)照和陰性對(duì)照無明顯的“S”型的擴(kuò)增曲線，實(shí)驗(yàn)質(zhì)量符合要求，可以排除假陰性和假陽性的結(jié)果。待檢魚類樣本的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)其成明顯的“S”型的擴(kuò)增曲線，可判斷為含有SVCV。

圖5 感染SVCV的檢測(cè)樣本的實(shí)時(shí)定量RT-RT-PCR反應(yīng)的擴(kuò)增曲線

2.4.2 數(shù)字RT-PCR對(duì)魚類樣品的檢測(cè)

用建立的實(shí)時(shí)定量RT-RT-PCR方法對(duì)檢測(cè)待檢的魚類樣品，在檢測(cè)的過程中，分別以SVCV RNA、健康魚組織RNA和水作為陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，以排除假陰性和假陽性結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果，陽性對(duì)照有明顯的擴(kuò)增，而陰性對(duì)照和空白對(duì)照幾乎沒有擴(kuò)增，可以排除假陰性和假陽性的結(jié)果。待檢樣本的檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明，待檢樣本中含有SVCV病毒。

2.4.3 兩種方法的比較

兩種方法均能達(dá)到檢測(cè)魚類樣品的的目的，選擇相同的樣品分別用兩種方法進(jìn)行檢測(cè)，檢出

率相同，且1-5樣品中含有的SVCV量逐漸減少。數(shù)字RT-PCR方法檢測(cè)出空白對(duì)照中含有微量的SVCV，分析是實(shí)驗(yàn)過程中污染造成的。

圖6 數(shù)字RT-PCR反應(yīng)對(duì)感染SVCV的檢測(cè)樣本的檢測(cè)

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)的SVCV診斷方法是對(duì)病毒先進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，再通過ELISA等方法進(jìn)行鑒定，這些方法往往耗時(shí)較長(zhǎng)，而SVCV難以制備高效價(jià)抗血清[6]。實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法是病毒常見的檢測(cè)方法，在魚類病毒疾病的診斷中有著泛的應(yīng)用。本文建立的數(shù)字RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，可以檢測(cè)到單個(gè)微滴中SVCV的存在，達(dá)到對(duì)樣品中微量病毒檢測(cè)的目的，實(shí)現(xiàn)疾病的早期的防控。

本文通過對(duì)實(shí)時(shí)定量RT-RT-PCR 與數(shù)字RTPCR 兩種方法的比較得到如下結(jié)論：數(shù)字RT-PCR比實(shí)時(shí)定量RT-RT-PCR 靈敏度高，而且能夠?qū)蝹€(gè)微滴中的目標(biāo)基因進(jìn)行檢測(cè)，因此可以實(shí)現(xiàn)痕量病原檢測(cè)，比實(shí)時(shí)定量RT-PCT方法應(yīng)用更為廣泛；所設(shè)計(jì)的引物和探針特異性強(qiáng)，只對(duì)SVCV有擴(kuò)增反應(yīng)，可應(yīng)用于日常的SVCV檢測(cè)；數(shù)字RTPCR相比于實(shí)時(shí)定量RT-RT-PCR方法，檢測(cè)重現(xiàn)性更高，因此在常規(guī)檢測(cè)中可以作為確診方法。

總之，本文建立的數(shù)字RT-PCR體系能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)鯉春病毒血癥的準(zhǔn)確診斷，且該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)、使用方便，可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量樣品進(jìn)行檢測(cè)，并且可以對(duì)魚病進(jìn)行早期診斷，及時(shí)切斷傳播途徑，促進(jìn)魚類養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。

[1]景宏麗，張旻，王娜，等. 鯉春血癥病毒單克隆抗體建立及免疫學(xué)特性鑒定[J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，2014（3）：55-59.

[2]Reschova S，Pokorova D ，Nevorankova Z，et al. Detection of spring viraemia of carp virus（SVCV）with monoclonal antibodies[J]. Veterinarni Medicina，2007，52（7）：308-316.

[3]The Center for Food Security and Public Health. Spring Viremia of Carp[R].Iowa State University：2007：1-4.

[4]Wolf K. Fish Viruses and Fish Viral Diseases[M]. New York：Cornell University Press，1988.

[5]OIE. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals[M]. Paris：OIE，2009.262-278.

[6]高隆英，史秀杰，劉葒，等. 用RT-PCR法快速檢測(cè)鯉春病毒血癥病毒基因[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2002，26（9）：452-456.

（責(zé)任編輯：胡藕祥）

Establishment and Application of Digital RT-PCR Assay for Detection of Spring Viraemia of Carp

Wu Bin1，Shen Cuicui1，Zhang Chenxi2，Hu Decong3，Zhao Huijun1，Zhang Lin1
（1. Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Dalian，Liaoning 116001；2. Dalian University，Dalian，Liaoning 116622；3. Hubei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Wuhan，Hubei 430050 ）

[Objective] To established a rapid digital RT-PCR assay for detection of spring viraemia of carp virus by comparison of real-time quantitative RT-PCR and digital RT-PCR. [Methods] Same primers and probes were used in the digital RT-PCR assay and the real-time quantitative RT-PCR to test their sensitivity，repeatability and specifi city for detection of SVCV by means of gradient dilution. [Result] Both the digital RT-PCR and real-time quantitative RT-PCR assays could detect SVCV diluted to 10-4，and the former could detect SVCV in a single droplet，more sensitive than the real-time quantitative RT-PCR. At the same time，the specifi city of the two methods were strong，there were no amplifi cation reaction with other viruses，such as infectious pancreatic necrosis virus（IPNV），infectious hematopoietic necrosis virus（IHNV），viral haemorrhagic septicemia virus（VHSV）. There was a better reproducibility of the two methods. [Conclusion] Digital RT-PCR had a better sensitivity than the real-time quantitative RT-PCR，and could play an important role in early and rapid diagnosis of spring viraemia of carp virus.

spring viraemia of carp （SVC）；digital RT-PCR；real-time RT-PCR；sensitivity； specificity；repeatability

S941.41+6

B

1005-944X（2015）07-0072-05

國(guó)家公益項(xiàng)目（201410059）