基因芯片檢測魚類病毒的方法建立與優(yōu)化

王勝強，耿偉光，李 晉，粟子丹，史成銀

（1．農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071；2．上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

基因芯片檢測魚類病毒的方法建立與優(yōu)化

王勝強1，2，耿偉光1，2，李 晉1，2，粟子丹1，2，史成銀1

（1．農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071；2．上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

本研究建立并優(yōu)化了一種基因芯片檢測方法，可以同步檢測7種重要的海水養(yǎng)殖魚類病毒（淋巴囊腫病毒、細胞腫大病毒屬虹彩病毒、赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒、傳染性造血器官壞死病毒、傳染性胰臟壞死病毒、病毒性出血敗血癥病毒、傳染性鮭貧血病毒）。該基因芯片包含10條病毒特異性的寡核苷酸探針（25～30 mer）分別與病毒的CP、N、VP5、G、NS、MA等基因位點互補。將各病毒基因探針以50% DMSO稀釋至20 μmol/L，使用PersonalArrayer 16個人點樣儀在醛基修飾玻片上點樣，然后與Cy3標(biāo)記的擴增產(chǎn)物在47℃條件下雜交1.5 h，最后在LuxScan 10K掃描儀上采集熒光信號、判斷檢測結(jié)果。初步應(yīng)用表明，該基因芯片檢測方法具有良好的特異性和可靠性，在魚類病毒高通量檢測技術(shù)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。

病毒；基因芯片；高通量檢測；魚類

建立對多種病毒的快速、高通量、低成本的分子檢測方法，對保障養(yǎng)殖魚類健康、防止疾病發(fā)生具有重要的意義。淋巴囊腫病毒（lymphocystis disease virus，LCDV）、大菱鲆紅體病虹彩病毒（turbot reddish body iridovirus，TRBIV）、細 胞腫大病毒屬虹彩病毒（Megalocytivirus，Mega）、赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒（red-spotted grouper nervous necrosis virus，RGNNV）、傳染性造血器官壞死病毒（infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV）、傳染性胰臟壞死病毒（infectious pancre-

atic necrosis virus，IPNV）、病毒性出血敗血癥病毒（viral hemorrhagic septicemia virus，VHSV）、傳染性鮭魚貧血病毒（infectious salmon anaemia virus，ISAV）是養(yǎng)殖魚類主要的病毒性病原，均能引起傳染性、暴發(fā)性疾病。國內(nèi)外關(guān)于這些病毒的毒力基因分析以及分子檢測已有較多的文獻報道。其中LCDV、TRBIV、Mega和RGNNV都含有衣殼蛋白（CP），在病毒顆粒中負責(zé)包被病毒核酸和核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合體，由于不同病毒的CP基因序列相似性較低，因此該基因可用于這些病毒的特異性鑒定[1-3]。核蛋白基因（N）是IHNV的主要毒力基因之一，通常被用于IHNV的分子鑒定以及其毒性強弱的判斷[4]。VP5是IPNV的主要毒力基因之一，因此VP5基因可作為檢測IPNV的生物學(xué)標(biāo)記[5]。糖蛋白基因（G）是VHSV的主要毒力基因之一，常被用于VHSV的分子鑒定以及其毒性強弱的判斷[6]。核蛋白NS、基質(zhì)蛋白MA是ISAV的主要毒力基因，因此NS、MA基因可作為檢測ISAV的生物學(xué)標(biāo)記[7]。

基因芯片作為生物芯片的一種，最初是在20世紀(jì)80年代初由Bains W.等人提出的概念。目前是在生命科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的最為廣泛也最為成熟的一種對大量的遺傳信息進行高效、快速的檢測和分析的方法。在表達譜的構(gòu)建[8]、篩選相關(guān)基因[9]、臨床診斷上都有廣泛的研究和應(yīng)用[10]。基因芯片在臨床醫(yī)學(xué)檢測上的應(yīng)用已有相關(guān)的報道，但在魚類病毒的檢測方面研究很少。本研究針對上述魚類病毒，建立了基因芯片檢測方法，對其反應(yīng)參數(shù)進行優(yōu)化并進行了初步應(yīng)用，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 含病毒基因的克隆質(zhì)粒。含有LCDV、TRBIV、Mega、RGNNV、IHNV、IPNV、VHSV、ISAV-NS、ISAV-MA相關(guān)基因的T-A克隆質(zhì)粒和菌株均由本實驗室構(gòu)建，用作基因芯片檢測的陽性模板（各基因的GenBank檢索號見表1）。

1.1.2 主要試劑、耗材。實驗中所用到的Trans-StartTMTop Taq DNA Polymerase、High Pure dNTPs購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購自博邁德生物，氨基、醛基修飾片基購自博奧生物。

1.2 方法

1.2.1 病毒基因陽性模板的制備。分別將含有LCDV、TRBIV、Mega、RGNNV、IHNV、IPNV、VHSV、ISAV-NS、ISAV-MA等病毒相關(guān)基因的克隆菌株過夜培養(yǎng)。對擴大培養(yǎng)的菌液提取質(zhì)粒，用超微量核酸蛋白測定儀（美國Nano-Drop2000）測定核酸的濃度和純度，保存于-20 °C備用。

1.2.2 基因芯片探針的設(shè)計。各病毒探針的設(shè)計方法是：依據(jù)病毒特異性的基因序列，使用AlleleID 7.0軟件設(shè)計寡核苷酸探針（25 ～ 30 mer），使其分別與病毒的CP、N、VP5、G、NS、MA等基因位點互補。此外，在各探針5′端連上一段長度為15 mer的poly（dT）作為間隔臂，以減少探針與片基之間的空間位阻，提高其雜交效率（檢測各魚類病毒的探針序列見表1）。

表1 用于基因芯片的魚類病毒探針序列

本研究還設(shè)計了基因芯片的3套質(zhì)控探針，即表面化學(xué)質(zhì)控探針、陽性對照探針、陰性對照探針。表面化學(xué)質(zhì)控探針（QC-1）：隨機'寫出一段寡核苷酸序列（5'-ACAAGGGATATCGCTGGGT-3'），該序列不產(chǎn)生穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，與病原基因序列也沒有同源性。陽性對照探針（QC-2）：根據(jù)牛的β-珠蛋白基因（HBB）設(shè)計擴增引物和陽性對照探針，擴增得到的標(biāo)記產(chǎn)物與陽性對照探針雜交產(chǎn)生陽性信號。陰性對照探針（QC-3）：根據(jù)牛的β-珠蛋白基因（HBB）進行陰性探針的設(shè)計。另外設(shè)置一套空白對照（QC-4），即以ddH2O代替探針點樣。

1.2.3 基因芯片和Cy3標(biāo)記產(chǎn)物的制備。芯片制備：將各探針以50% DMSO稀釋至20 μmol/L，操作PersonalArrayer 16 個人點樣儀點樣于醛基修飾玻片，每種探針并排點3份，即設(shè)置3個平行。將玻片置于濕盒中室溫放置4 h，0.5% SDS清洗10 min，超純水洗滌2 min，離心后4℃保存。采用多重PCR技術(shù)對魚類病毒的相關(guān)基因片段進行擴增，并對擴增產(chǎn)物進行同步Cy3標(biāo)記。

1.2.4 雜交體系組成。雜交體系總體積15 μL：含100%甲 酰 胺3.75 μL，20×SSC 2.25 μL，10% SDS 0.3 μL，50×Denhardt’s 1.5 μL，Cy3標(biāo)記產(chǎn)物7.2 μL。

1.2.5 氨基片基和醛基片基對比。氨基片基探針的固定：將未修飾的LCDV、RGNNV探針以50% DMSO稀釋至20 μmol/L，點樣后將玻片置于80°C烘箱80 min，浸入超純水中1 min，再迅速浸入-20 °C無水乙醇中1 min，超純水清洗2 min，離心后4 °C保存。醛基片基探針的固定：將5′端帶有氨基修飾的LCDV、RGNNV探針按1.2.3制備流程進行探針的固定。最后取LCDV、RGNNV的Cy3標(biāo)記產(chǎn)物按1.2.4配制成雜交液與基因芯片進行雜交、清洗和掃描，分析結(jié)果。

1.2.6 不同探針點樣液的對比。取LCDV、RGNNV、IHNV、IPNV氨基修飾的探針，分別用50% DMSO、3×SSC和ddH2O稀釋至20 μmol/L，進行醛基片基點樣。取等量LCDV、RGNNV、 IHNV、IPNV的Cy3標(biāo)記產(chǎn)物，按1.2.4配制雜交液，進行雜交、清洗，最后用LuxScan 10K掃描儀掃描，分析結(jié)果。

1.2.7 芯片雜交探針濃度的優(yōu)化。取LCDV、RGNNV、IHNV、IPNV的氨基修飾探針以50% DMSO分別稀釋成20、15、10、5 μmol/L，進行醛基片基點樣。取等量LCDV、RGNNV、IHNV、IPNV的 Cy3標(biāo)記產(chǎn)物，按1.2.4配制雜交液，進行雜交、清洗和掃描，分析結(jié)果。

1.2.8 芯片雜交溫度的優(yōu)化。取LCDV、RGNNV、IHNV、IPNV的氨基修飾探針點樣，取等量LCDV、RGNNV、IHNV、IPNV的Cy3標(biāo)記產(chǎn)物，按1.2.4配制交體系，每次取一張基因芯片進行雜交，每次的雜交溫度分別設(shè)定為37 °C、42 °C、47 °C、52 °C、57 °C，最終清洗、掃描，分析結(jié)果。

1.2.9 芯片雜交時間的優(yōu)化。取LCDV、RGNNV、IHNV、IPNV的氨基修飾探針點樣，取等量LCDV、RGNNV、IHNV、IPNV的Cy3標(biāo)記產(chǎn)物，按1.2.4配制雜交體系，取四張芯片進行雜交，雜交過程中每隔0.5 h取出一張芯片進行清洗，最終進行芯片的掃描，分析結(jié)果。

1.2.10 優(yōu)化后芯片的整體雜交效果。根據(jù)上述優(yōu)化得到的最佳反應(yīng)參數(shù)，對LCDV、TRBIV、Mega、RGNNV、IHNV、IPNV、VHSV、ISAVNS、ISAV-MA進行Cy3標(biāo)記產(chǎn)物的制備、與芯片進行雜交、清洗和掃描，評價雜交效果。

1.2.11 基因芯片對病魚樣品的檢測。取患病魚的腦、脾、腎等組織，分別提取DNA和RNA。對DNA和反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA進行多重PCR擴增，制備Cy3標(biāo)記產(chǎn)物。將擴增產(chǎn)物按照1.2.10所述進行基因芯片檢測，分析檢測結(jié)果。同時使用常規(guī)PCR方法進行病毒檢測，作為對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基片基與醛基片基的雜交效果對比

醛基片基的點樣結(jié)果與氨基片基相比，點陣更加均一，雜交信號強度明顯高于氨基片基（圖1）。表明醛基片基的探針結(jié)合能力更強，因此本研究選用醛基片基進行基因芯片的制備。

圖1 醛基片基（左）和氨基片基（右）對雜交結(jié)果的影響

2.2 不同點樣液的對比

通過對不同點樣液制備的芯片進行雜交、清洗及掃描，結(jié)果顯示：50% DMSO效果最好，該點樣液的點圓潤均一，雜交信號最強；而3 × SSC作為點樣液雜交信號強度較弱，且部分點出現(xiàn)擴散、大小不均一的情況；ddH2O作為點樣液的雜交結(jié)果幾乎看不到信號（圖2）。因此選用50 % DMSO作為基因芯片制備的點樣液。

圖2 點樣液對雜交結(jié)果的影響

2.3 芯片雜交探針濃度的優(yōu)化

通過對不同濃度探針制備的芯片進行雜交、清洗及掃描，結(jié)果顯示：隨著探針濃度的逐漸降低，雜交信號強度與雜交信號均值大致呈下降趨勢。由于各探針的點樣均一程度等問題，個別雜交點出現(xiàn)了低濃度探針雜交信號高于高濃度探針雜交信號的情況（圖3）。綜合比較，探針終濃度為20 μmol/L時雜交效果最好，因此選用該濃度的探針用于基因芯片的檢測。

2.4 雜交溫度的優(yōu)化

圖3 探針濃度對雜交結(jié)果的影響

當(dāng)雜交溫度為37 °C、42 °C、47 °C時，樣品的熒光信號均清晰可見。隨著溫度的升高，信號強度也相應(yīng)增強，在47 °C時達到最強。當(dāng)雜交溫度升高至52 °C時，信號強度急劇下降。其中LCDV和RGNNV的信號強度很弱；當(dāng)雜交溫度升高至57 °C時，IHNV和IPNV的信號強度也變得很弱（圖4）。因此最終選擇47 °C作為基因芯片的最佳雜交溫度。

圖4 不同雜交溫度的結(jié)果

2.5 雜交時間的優(yōu)化

當(dāng)雜交時間為0.5 h時，幾乎看不到樣品的熒光信號；雜交1.0 h后，熒光信號有所增強。隨著雜交時間延長至1.5 h時，熒光信號強度也達到了峰值。繼續(xù)延長雜交時間至2.0 h時，熒光信號強度并無明顯增加（圖5）。綜合考慮，選用1.5 h作為基因芯片的最佳雜交時間。

圖5 不同雜交時間的結(jié)果

2.6 參數(shù)優(yōu)化后的基因芯片雜交效果

制備魚類病毒相關(guān)基因Cy3標(biāo)記產(chǎn)物之后，應(yīng)用上述優(yōu)化后的反應(yīng)參數(shù)，進行基因芯片的雜交。結(jié)果顯示：病毒探針均能與對應(yīng)的Cy3標(biāo)記產(chǎn)物雜交，并產(chǎn)生均勻的熒光信號，整體雜交效果非常理想（圖6）。

圖6 整體雜交結(jié)果

2.7 對病魚樣品的檢測結(jié)果

在對病魚樣品的實際檢測中，該基因芯片對本實驗室收集到的19份樣品的檢測結(jié)果為：養(yǎng)成期牙鲆中檢出LCDV的感染，養(yǎng)成期大菱鲆中檢出TRBIV的感染，在半滑舌鰨魚苗中檢出RGNNV的感染，在石斑魚中檢出細胞腫大屬（Mega）病毒（圖7）。該檢測結(jié)果與使用常規(guī)PCR的檢測結(jié)果完全一致。

圖7 應(yīng)用基因芯片在19份魚類樣品中檢測出的4份病毒陽性結(jié)果

3 討論

在魚類的養(yǎng)殖過程中，多種病毒病的發(fā)生往往會帶來巨大的經(jīng)濟損失，嚴(yán)重影響了養(yǎng)殖業(yè)的健康、可持續(xù)發(fā)展，因此研發(fā)快速、可靠、高通量的病毒檢測方法具有重要價值。生物芯片技術(shù)已被廣泛應(yīng)用在基因工程和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[9，11]，在水產(chǎn)方面的研究和應(yīng)用也日益增多，比如在水母分型及進化地位[12]、貝類致病性弧菌[13]、對蝦致病菌[14]、魚類病原菌[15-16]等方面，但在魚類病毒方面的研究和應(yīng)用卻很少。本研究建立了基因芯片技術(shù)檢測魚類病毒的方法，優(yōu)化了反應(yīng)參數(shù)，得到了穩(wěn)定、清晰的雜交結(jié)果，并在魚類病毒檢測中的進行了初步應(yīng)用。

本研究建立的基因芯片檢測技術(shù)能夠在一個微陣列中與7種病毒10個基因的標(biāo)記擴增產(chǎn)物同時進行雜交，并得到理想的雜交效果，這在很大程度上提高了重要海水養(yǎng)殖魚類病原篩查工作的效率，與已報道的僅能同時檢測2種魚類病毒的基因芯片相比具有明顯的優(yōu)勢[17]。在探針設(shè)計方面，本研究在每條探針的5'端連上一段長度為15 mer的poly（dT）作為間隔臂，從而有效地降低了探針與片基間的空間位阻，提高了標(biāo)記產(chǎn)物與其雜交的效率?？傊狙芯拷⒌幕蛐酒瑱z測魚類病毒的方法，具有通量高、特異性強的優(yōu)勢，為魚類的多病原檢測及流行病調(diào)查提供了快速、有效的工具，對保障養(yǎng)殖魚類健康、防治疾病發(fā)生具有重要的意義。

本研究的不足之處是對建立并優(yōu)化的基因芯片方法應(yīng)用不足，今后需要使用更多的樣品對該基因芯片進行驗證和測試，以便持續(xù)改進。

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（責(zé)任編輯：白雅娟）

Establishment and Optimization of Gene Microarray for Detection of Fish Viruses

Wang Shengqiang1，2，Geng Weiguang1，2，Li Jin1，2，Su Zidan1，2，Shi Chengyin1
（1. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries，Ministry of Agriculture，Yellow Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Qingdao，Shangdong 266071；2. College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）

A gene microarray was established and optimized in the study for spontaneous detection of seven marine fi sh viruses in（lymphocystis disease virus，Megalocytivirus，red-spotted grouper nervous necrosis virus，infectious haematopoietic necrosis virus，infectious pancreatic necrosis virus，viral hemorrhagic septicemia virus and infectious salmon anemia virus）. The microarray was composed of ten short oligonucleotide probes（25 ～ 30 mer）complementary to specifi c genes of above viruses. For gene microarrays，oligonucleotide probes（20 μmol/L in 50% DMSO）for these targeted genes were spotted onto aldehyde-masked slides by using a PersonalArrayer 16. Amplifi ed PCR products were hybridized to arrays at 47℃ for 1.5 h and detected by using signal amplifi cation with Cy3 fl uorescent dye. Slides were imaged by using a LuxScan 10K. The established gene microarray showed good specifi city and reliability by preliminary application，and could be widely used in high throughput detection of fi sh viruses.

virus；gene microarray；high throughput detection；Fish

S941.41；Q78

A

1005-944X（2015）07-0077-06

國家科技支撐計劃課題（2012BAD17B01）

史成銀