Taqman-LNA熒光PCR快速檢測肉制品中馬源性成分的研究

許如蘇，周廣彪，段建發(fā)，蘇建暉，魏 霜，陳冠武

（汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東汕頭 515031）

Taqman-LNA熒光PCR快速檢測肉制品中馬源性成分的研究

許如蘇，周廣彪，段建發(fā)，蘇建暉，魏 霜，陳冠武

（汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東汕頭 515031）

[目的] 建立快速檢測肉制品中馬源性成分的Taqman-LNA熒光PCR方法。[方法] 基于馬的種屬保守序列，設(shè)計(jì)特異性引物和Taqman-LNA探針，建立可快速檢測肉制品中馬源性成分的Taqman-LNA熒光PCR檢測方法。通過對(duì)特異性、靈敏度、重復(fù)性的檢測，對(duì)建立的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。[結(jié)果] 建立的Taqman-LNA熒光PCR方法靈敏，可檢測到馬肉DNA最低限為1.4 pg；特異，與豬、牛、羊、鹿、驢、兔、雞、鴨、鵝、蝦無非特異性反應(yīng)；可重復(fù)，批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均小于2%；準(zhǔn)確，應(yīng)用該法檢測人為摻入馬肉的肉制品，檢測結(jié)果與預(yù)期相符。[結(jié)論 ]本研究建立的方法具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，適合于肉制品中馬源性成分檢測。

馬源性成分；鎖核酸（LNA）探針；熒光定量PCR；肉制品

一些不法商家為牟取暴利，在標(biāo)明某肉的肉制品中摻入低價(jià)位其它肉類，如在牛肉丸中摻入豬肉，在牛肉制品中摻入馬肉等，極大地?fù)p壞了消費(fèi)者的利益。在我國，媒體已多次曝光假冒牛羊肉卷事件。在瑞典、英國和法國等西方國家，也多次曝光用馬肉假冒牛肉事件。BALLIN等對(duì)近千種肉制品的檢測分析發(fā)現(xiàn)，有近20%的產(chǎn)品存在標(biāo)識(shí)與品種不完全相符現(xiàn)象[1]。目前，打擊肉制品摻假已成為社

會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)，而對(duì)肉制品中動(dòng)物源性成分的快速鑒別是打假的重要技術(shù)手段。

對(duì)肉制品的摻假檢測主要基于對(duì)動(dòng)物源性成分的鑒別，盡管動(dòng)物源性成分鑒別有多種方法，但以檢測DNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法，尤其是PCR技術(shù)以穩(wěn)定、準(zhǔn)確、快速等優(yōu)勢而得到越來越廣泛的應(yīng)用[2-5]。然而，食品中DNA成分復(fù)雜，加之PCR技術(shù)的高靈敏度，使得應(yīng)用PCR方法來鑒別物種存在因非特異性擴(kuò)增而產(chǎn)生假陽性結(jié)果的缺點(diǎn)。因此，以PCR為基礎(chǔ)，應(yīng)用改良的引物探針設(shè)計(jì)策略已逐步成為肉類鑒別的新方向[6]。Taqman-LNA熒光探針是在Taqman探針的基礎(chǔ)上，有目的地將探針的一些堿基修飾成LNA堿基，通過提供探針的Tm值，縮短探針長度來增加探針的穩(wěn)定性、特異性和設(shè)計(jì)的靈活性[7]。目前，Taqman-LNA熒光PCR已在病原檢測[8-11]、基因突變檢測[12-13]等方面得到廣泛應(yīng)用，但該技術(shù)在動(dòng)物源性成分檢測方面國內(nèi)尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究利用Taqman-LNA熒光探針的上述優(yōu)點(diǎn)，首次建立肉制品中馬源性成分的Taqman-LNA熒光PCR檢測方法，為該技術(shù)應(yīng)用于其他動(dòng)物源性成分的檢測提供了借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

LightCycler?480型熒光定量PCR儀（Roche），高速離心機(jī)（Beckman），恒溫干熱器（Eppendorf）。

1.2 主要試劑

Probes Master 2×conc購自Roche公司；核酸提?。x心柱法）試劑盒購自達(dá)安公司。

1.3 肉及肉制品來源

從農(nóng)貿(mào)市場和超市購買馬、牛、羊、豬、雞、鴨等動(dòng)物肌肉和牛肉丸、羊肉串、羊肉丸、豬肉丸、肉腸、肉松等肉制品共80份樣品，本單位提供進(jìn)口牛肉樣品10份。

1.4 樣品制備和DNA提取

取樣品10～25 g，剪碎后用絞肉機(jī)絞成糊狀。稱取30 mg，使用核酸提?。x心柱法）試劑盒進(jìn)行DNA提取并測定DNA濃度。

1.5 引物探針設(shè)計(jì)與合成標(biāo)記

使用Primer Express軟件針對(duì)馬的種屬保守基因設(shè)計(jì)特異引物和鎖核酸探針。正向引物序 列：5'-CCCACTATCAGGATTCATACCC-3'，反 向 引 物 序 列：5'-AGTGAGGTGGAATAGGTTAGTCG-3'，LNA探 針 序 列： 5'-FAMCACCAAAAATAG+CAGCATCATCCTCC–BHQ1-3'，均由上海輝睿公司合成。

1.6 Taqman-LNA熒光PCR方法的建立

根據(jù)反應(yīng)體系酶的特性、熒光PCR儀的特點(diǎn)和引物Tm值設(shè)定預(yù)反應(yīng)條件，再通過對(duì)引物探針濃度和退火溫度的優(yōu)化，最后確定Taqman-LNA熒光PCR的最佳反應(yīng)條件為：反應(yīng)總體積為20μL，內(nèi)含Probes Master 2×conc 10μL，10μmol/L上游和下游引物各0.4μL，10μmol/L鎖核酸探針0.3μL，模板1μL；反應(yīng)參數(shù)為：預(yù)變性95℃ 8min；95 ℃，10 s，58 ℃，30 s（收集熒光信號(hào)），40個(gè)循環(huán)。

1.6.1 特異性檢驗(yàn)。以同一提取方法，同等肉量提取的馬、豬、牛、羊、驢、鹿、驢、雞、鴨、鵝、蝦的DNA為模板，進(jìn)行Taqman-LNA熒光PCR試驗(yàn)以檢測方法的特異性。

1.6.2 靈敏度檢驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。將從馬肉提取的DNA 作10×系列稀釋，分別進(jìn)行Taqman-LNA熒光PCR試驗(yàn)。選取6個(gè)梯度的DNA濃度，以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)對(duì)數(shù)值與CP值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（由儀器配套軟件自動(dòng)生成）。

1.6.3 重復(fù)性檢驗(yàn)。將從馬肉提取的DNA 作10×系列稀釋，取100～10-4稀釋的DNA模板進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，每次試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，共進(jìn)行3次試驗(yàn)，計(jì)算批內(nèi)和批間CP值的變異系數(shù)V。V=標(biāo)準(zhǔn)差s/CP均值。

1.7 對(duì)人為摻入馬肉肉制品的檢測

選擇已知成分的牛肉丸和羊肉串作為肉制品基質(zhì)，分別按1.4制成糊狀樣品，按大約50%、30%、10%、5%和1%的比例在糊狀樣品中摻入絞碎馬肉，混勻制成人為摻入馬肉的肉制品，每個(gè)比例各取2份樣品，按1.4提取DNA，采用本研究建立的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，以評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確性。

1.8 對(duì)市售肉制品的檢測

按1.4提取市售肉制品的DNA，采用本方法進(jìn)行馬源性成分檢測。試驗(yàn)設(shè)馬肉DNA和空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性

試驗(yàn)結(jié)果只有馬肉出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，牛、羊、豬、驢、鹿、驢、雞、鴨、鵝、蝦肉均無擴(kuò)增曲線（圖1），說明本研究建立的方法具有高度特異性。

圖1 特異性試驗(yàn)擴(kuò)增曲線

2.2 靈敏度

使用10倍系列稀釋的馬肉提取的DNA為模板進(jìn)行馬源性成分檢測，各梯度反應(yīng)體系中的模板DNA量分別為140ng、14ng、1.4ng、0.14ng、0.014ng、0.0014ng、0.00014ng，相當(dāng)于馬肉含量為100%，10%，1%，0.1%，0.01%，0.001%和0.0001%。反應(yīng)擴(kuò)增曲線見圖2。從圖2可見，本方法可檢測到馬肉最低含量為0.0001%。當(dāng)馬肉含量在100% ～0.001%時(shí)，與CP值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖3）。y=-3.460lgx+15.18 擴(kuò)增效率E=1.945，R2達(dá)到0.999以上。

圖2 馬肉DNA 10倍系列稀釋的Taqman-LNA熒光PCR擴(kuò)增曲線

圖3 馬肉DNA 10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)曲線

一方面，考慮到摻假的動(dòng)機(jī)在于節(jié)約生產(chǎn)成本，摻假肉類的比例低于1%，則沒有經(jīng)濟(jì)意義；另一方面，考慮到肉制品生產(chǎn)加工，銷售運(yùn)輸過程可能被其他肉類污染，因此，將樣品CP值-純馬肉CP值≤7判定為樣品摻有馬源性成分。

2.3 重復(fù)性

重復(fù)性檢驗(yàn)結(jié)果，批內(nèi)和批間CP值的變異系數(shù)分別小于1.5%和2%（表1），表明本法具有良好的可重復(fù)性和再現(xiàn)性。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 人為摻假樣品檢測結(jié)果

檢測人為摻入馬肉的牛肉丸和羊肉串共20份樣品。結(jié)果與預(yù)期相符，檢測結(jié)果100%正確（表2）。

2.5 對(duì)市售樣品的檢測結(jié)果

共檢測市售樣品牛肉及牛肉丸30份、羊肉和羊肉串10份、火腿腸等肉其他肉制品20份和進(jìn)口牛肉10份，結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)馬源性成分。

3 結(jié)論與討論

我國尚沒有檢測馬源性成分的國家標(biāo)準(zhǔn)，只有地方標(biāo)準(zhǔn)DB 37/T 1020-2008 肉類制品中雞肉、牛肉、豬肉和馬肉成分PCR快速檢測方法[14]。該標(biāo)準(zhǔn)采用普通PCR方法，存在費(fèi)時(shí)、易污染、檢測通量小等缺點(diǎn)。關(guān)于馬源性成分的檢測鑒定研究報(bào)道不多，李愛民等建立的羧化膠乳凝集抑制試驗(yàn)[15]雖成本低、操作簡便，但不適合熟制馬肉的檢測。鄭光明等建立了普通PCR鑒定馬肉的方法[16]，該法使熟制馬肉制品的鑒別成為可能，但該法存在普通PCR的缺點(diǎn)。李楠等建立了實(shí)時(shí)熒光PCR方法[17]，實(shí)現(xiàn)了肉制品中馬源性成分的快速檢測，但該法還有瑕疵，如與牛源性成分有一定交叉反應(yīng)，存在假陽性誤判可能。

表2 人為摻入馬肉的肉制品檢測結(jié)果

Taqman-LNA熒光探針是在Taqman探針的基礎(chǔ)上，有目的地將探針的一些堿基修飾成LNA堿基，而引入一個(gè)LNA堿基可以將探針的Tm值提高3℃～8℃，可以縮短探針長度，增加探針的穩(wěn)定性、特異性和設(shè)計(jì)的靈活性，并可使探針信號(hào)增強(qiáng)、信噪比增大，從而顯著減少實(shí)驗(yàn)檢測的環(huán)境限制[7]。本研究利用Taqman-LNA熒光探針的上述優(yōu)點(diǎn)，首次建立Taqman-LNA熒光PCR方法用于肉制品中的馬源性成分檢測，結(jié)果表明，該方法具有快速、特異、靈敏、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可在2小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)肉制品中馬源性成分的檢測。

不同的DNA提取方法，或使用不同的DNA提取試劑盒，DNA提取率和純度存在較大差異[18]。為避免因DNA提取對(duì)檢測結(jié)果的影響，同時(shí)基于馬肉含量在100% ～0.001%時(shí)，其含量與CP值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（100% 馬肉與1%馬肉含量的CP值理論上相差約6.7），并考慮肉制品在生產(chǎn)加工及運(yùn)輸銷售過程可能存在其他肉類污染，而摻假肉類低于1%時(shí)沒有摻假的實(shí)際意義，本方法采用樣品CP值與純馬肉CP值之差小于7作為肉制品摻假判定標(biāo)準(zhǔn)。必須強(qiáng)調(diào)的是，作為判定參照的純馬肉DNA的提取必須與樣品DNA的提取同步進(jìn)行，這樣可避免不同批次的操作誤差，結(jié)果才具有可比性。

本研究對(duì)市售肉制品的抽查結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有馬源性成分，這可能與本研究抽查的樣品數(shù)量不足，地域局限有關(guān)；也與我國的飲食習(xí)慣和馬匹飼養(yǎng)情況密切有關(guān)。本次抽查的進(jìn)口牛肉產(chǎn)自澳大利亞，為整塊肉，摻假可能性極小。

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（責(zé)任編輯：胡藕祥）

Development of a Taqman-LNA PCR Assay for Rapid Detection of Horse-Derived Ingredients in Meat Products

Xu Rusu，Zhou Guangbiao，Duan Jianfa，Su Jianhui，Wei Shuan，Chen Guanwu
（Shantou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shantou，Guangdong 515031）

[Objective] To develop a Taqman-LNA PCR assay for rapid detection of horse-derived ingredients in meat products. [Method] A Taqman-LNA PCR was developed for rapid detection of horse-derived ingredients in meat products，using the horse-specific primers and Taqman-LNA probe designed according to the conservative domain gene sequences of horse，and evaluated for its sensibility，specificity and reproducibility. [Results] The method was sensitive with detecting limit of 1.4pg horse DNA and was specific without cross-reaction with pork，beef，mutton，deer，donkey，rabbit，chicken，duck，goose and shrimp. The repeatability test showed that the coeffi cient of variation of intra-assay and inter-assay was less than 2%. The method was used to detect meat products mixed with horse fl esh，obtaining the expected results. [Conclusion] The established Taqman-LNA PCR possessed high sensibility，good specifi city and excellent reproducibility，and was fi t for rapid detection of horse-derived ingredients in meat products.

horse-derived ingredients；locked nucleic acid probe；real-time fluorescence quantitative PCR；meat product

TS 207.3

A

1005-944X（2015）07-0062-05

廣東檢驗(yàn)檢疫局科研課題（2014GDK24）

周廣彪