禽源空腸彎曲桿菌ERIC-PCR分型及毒力因子研究

王 娟，黃秀梅，崔曉娜，翟海華，曲志娜，趙思俊，王玉東，蓋文燕，王君瑋

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032;2. 山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061）

禽源空腸彎曲桿菌ERIC-PCR分型及毒力因子研究

王 娟1，黃秀梅1，崔曉娜2，翟海華1，曲志娜1，趙思俊1，王玉東1，蓋文燕1，王君瑋1

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032;2. 山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061）

[目的] 通過(guò)對(duì)禽源空腸彎曲桿菌分子分型和毒力研究，了解禽源空腸彎曲桿菌在禽肉產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中的主要傳播途徑和攜帶的主要致病因子。[方法] 對(duì)從家禽養(yǎng)殖場(chǎng)、屠宰場(chǎng)等采集的720份泄殖腔拭子和禽肉表面拭子樣品分離的311株空腸彎曲桿菌進(jìn)行ERIC-PCR分型和16種毒力因子檢測(cè)。[結(jié)果] 禽源空腸彎曲桿菌的分離率為43.19%；肉雞生產(chǎn)鏈中空腸彎曲桿菌沿生產(chǎn)鏈傳播，且有優(yōu)勢(shì)菌株型；90%以上分離菌株攜帶11種毒力基因。[結(jié)論] 肉雞生產(chǎn)鏈中空腸彎曲桿菌存在水平傳播現(xiàn)象，且沒(méi)有外源性污染；16種毒力基因中，14種毒力基因的攜帶率均在50%以上。加強(qiáng)禽源空腸彎曲菌的監(jiān)測(cè)是控制空腸彎曲菌的前提，對(duì)公共衛(wèi)生具有重要意義。

禽源；空腸彎曲桿菌；ERIC-PCR分型；毒力因子

空腸彎曲桿菌是一種重要的人獸共患病原菌，是引起人胃腸道感染最常見(jiàn)的病原菌之一，主要引起腹瀉，并引發(fā)嚴(yán)重的并發(fā)癥。在我國(guó)空腸彎曲桿菌也是主要的腹瀉病原菌之一[1]?？漳c彎曲桿菌廣泛散布在各種動(dòng)物體內(nèi)，其中雞是帶菌率最高的動(dòng)物，接觸或食用雞肉是主要傳染途徑。本文分析了禽產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中空腸彎曲桿菌的分子分型和毒力基因攜帶情況，為我國(guó)動(dòng)物產(chǎn)品安全和公共衛(wèi)生監(jiān)管提供了技術(shù)支持，也為空腸彎曲桿菌引起的疾病溯源及其分子流行病學(xué)研究提供了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株?？漳c彎曲菌（ATCC 33560），購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 主要試劑?？漳c彎曲桿菌選擇性瓊脂基礎(chǔ)以及配套添加劑購(gòu)自sigma公司；哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；綿羊全血購(gòu)自青

島海博生物科技公司；微需氧產(chǎn)氣袋購(gòu)自日本三菱MGC公司；DNA Marker DL-2000、Takara LA Taq ?購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；2×Taq PCR Master Mix購(gòu)自Promega公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備。凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀、CLASSⅡ生物安全柜、電熱恒溫水浴鍋、電子天平、旋渦混合儀。

1.1.4 樣品來(lái)源。2013年，從青島地區(qū)的3個(gè)蛋雞場(chǎng)、2個(gè)肉雞場(chǎng)、1個(gè)肉雞屠宰加工企業(yè)、以及2個(gè)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)共采集720份樣品。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與運(yùn)送。從養(yǎng)雞場(chǎng)采集被檢雞泄殖腔拭子樣品420份，從屠宰場(chǎng)和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)雞肉產(chǎn)品表面拭子采集表面拭子樣品300份，合計(jì)720份。

1.2.2 細(xì)菌分離與鑒定

1.2.2.1 細(xì)菌分離與純化 將拭子樣品直接在空腸彎曲菌SKIRROW選擇培養(yǎng)基上劃線，再用接種環(huán)劃開(kāi)，42 ℃微需氧培養(yǎng)48 h后；選擇灰白色、扁平、濕潤(rùn)，沿接種線向外擴(kuò)散的傾向的菌落，接種于哥倫比血平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)，同時(shí)，涂片、染色鏡檢。

1.2.2.2 細(xì)菌鑒定 將純化菌落采用煮沸法提取模板后，應(yīng)用建立的雙重PCR方法對(duì)本次分離到的空腸彎曲菌進(jìn)行鑒定。選取hipO，mapA基因作為檢測(cè)引物，具體引物序列如下hipO上：ACT GCA AAA TTA GTG GCG，hipO下：GAG CTT TAG CAA ACC TTC C，片段長(zhǎng)度為1028 bp；mapA上：CTA TTT TAT TTT TGA GTG CTT GTG，mapA下：GCT TTA TTT GCC ATT TGT TTT ATT A，片段長(zhǎng)度為589 bp。

1.2.3 ERIC-PCR分型。參照文獻(xiàn)方法[2-3]，設(shè)計(jì)空腸彎曲桿菌ERIC-PCR引物。上游引物ERIC1：5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCA-3’； 下 游引 物ERIC2：5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGC-3’，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30s，35℃退火1 min，72℃延伸4 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.4 毒力基因檢測(cè)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[4-5]合成fl aA，cadF，racR，ceuE，VirBII基因的引物，其他引物根據(jù)GenBank公布的基因序列設(shè)計(jì)，引物序列、片段大小和PCR擴(kuò)增條件見(jiàn)表1。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

利用建立起來(lái)的雙重PCR方法對(duì)分離到的疑似空腸彎曲菌進(jìn)行PCR鑒定，在720份樣品中，檢出311份空腸彎曲菌陽(yáng)性，其中在農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和養(yǎng)殖場(chǎng)檢出209份，肉雞生產(chǎn)鏈檢出102份，雞源空腸彎曲菌的平均陽(yáng)性率為43.2%，對(duì)部分分離株的鑒定結(jié)果如圖1所示。

2.2 ERIC-PCR 分型結(jié)果

2.2.1 各養(yǎng)殖場(chǎng)的ERIC-PCR分型結(jié)果。應(yīng)用ERIC-PCR分型方法對(duì)3家蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)和2家肉雞

養(yǎng)殖場(chǎng)的空腸彎曲菌分離株進(jìn)行分型，均可產(chǎn)生清晰的指紋圖譜，擴(kuò)增產(chǎn)物有多條特異性片段，大小約在100 bp～2000 bp之間，構(gòu)成不同的基因圖譜，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn)空腸彎曲桿菌的傳播規(guī)律：同一來(lái)源的空腸彎曲菌分離株存在相同的基因圖譜，不同來(lái)源的菌株差異較大，同一場(chǎng)內(nèi)的空腸彎曲菌分離株存在相同的圖譜，不同場(chǎng)的分離株沒(méi)有相同的圖譜，說(shuō)明空腸彎曲菌主要是水平傳播，具有局限性和多型性（圖2）。

表1 毒力基因PCR引物

圖1 樣品的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2.2 肉雞生產(chǎn)鏈空腸彎曲菌分離株的ERICPCR分型結(jié)果。本次對(duì)肉雞場(chǎng)A所屬企業(yè)的肉雞生產(chǎn)鏈不同環(huán)節(jié)分離到的空腸彎曲菌進(jìn)行了ERICPCR分型分析，分型得到的結(jié)果與從肉雞場(chǎng)空腸彎曲菌分離株的分型結(jié)果一致（表2），得到的分離圖譜都包含在肉雞場(chǎng)A分離株的4種基因型中，其中盲腸分離株有4型，胴體體表分離株有3型，屠宰場(chǎng)儲(chǔ)藏雞肉分離株有2型，市場(chǎng)雞肉分離株有1種基因型，胴體體表和雞肉樣分離株得到的基因型都包含在泄殖腔分離株的四種基因型中。結(jié)合A肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)的分型結(jié)果，說(shuō)明肉雞生產(chǎn)鏈中空腸彎曲菌存在水平傳播現(xiàn)象，且沒(méi)有出現(xiàn)外源污染現(xiàn)象。4種基因型中，BA1型同時(shí)存在于肉雞整個(gè)生產(chǎn)鏈中，說(shuō)明BA1型是優(yōu)勢(shì)菌株。

2.3 毒力基因檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 毒力基因擴(kuò)增結(jié)果。16種毒力基因中，除virBⅡ的檢出率為0外，其他毒力基因均可在分離菌株中擴(kuò)增出與預(yù)期目的片段大小一致的特異性片段，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖3。

表2 肉雞生產(chǎn)鏈空腸彎曲菌ERIC-PCR分型情況

2.3.2 空腸彎曲菌分離株毒力基因分析

圖3 空腸彎曲菌毒力基因PCR檢測(cè)圖

如圖4所示，除neuB和virBⅡ較低，其他14種毒力因子攜帶率都較高，有11種達(dá)到90%以上。針對(duì)所檢測(cè)的16種毒力因子，311株空彎分離株中4株含有除vir BⅡ以外的15種毒力因子，占總分離數(shù)的1.3%；97株含有14種毒力因子，占總數(shù)的31.2%；110株含有13種毒力因子，占總數(shù)的35.4%；92株含有12種毒力因子，占總數(shù)的29.6%；還有5株含有11種毒力因子，占總數(shù)的1.6%；只有3株含有5種毒力因子。

對(duì)自己設(shè)計(jì)合成的10對(duì)毒力基因引物的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，采用直接測(cè)序法進(jìn)行核苷酸的測(cè)定，比較質(zhì)控菌株和分離株的同源性。分離株的flaA，cdtA，cheW，grpE，dnaK，cheY，cdtB，pldA的序列與質(zhì)控菌株的同源性在93%～99%之間，neuB1的擴(kuò)增序列與GenBank上公布的序列同源性為99%，cfrA的與GenBank上公布的序列同源性為98%。

2.4 分析

圖4 311株空腸彎曲菌毒力因子檢出情況

本實(shí)驗(yàn)利用ERIC-PCR技術(shù)對(duì)不同養(yǎng)殖場(chǎng)和肉雞生產(chǎn)鏈的空腸彎曲菌分離株進(jìn)行了分型，顯示了良好的分型能力。不同來(lái)源的空腸彎曲菌的ERICPCR分型結(jié)果得到不同的基因圖譜，說(shuō)明空腸彎曲菌基因具有多態(tài)性。同一雞場(chǎng)的不同個(gè)體會(huì)存在相同的基因型，并且同一雞場(chǎng)存在優(yōu)勢(shì)基因型。同時(shí)相對(duì)于蛋雞場(chǎng)，肉雞場(chǎng)得到的基因型數(shù)量較少，說(shuō)明在商業(yè)化的肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)，空腸彎曲菌具有相對(duì)較低的異質(zhì)性，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[6-8]相符。

肉雞生產(chǎn)鏈的分型結(jié)果表明，該廠肉雞生產(chǎn)鏈中空腸彎曲菌存在水平傳播現(xiàn)象，且沒(méi)有出現(xiàn)外源污染現(xiàn)象。市場(chǎng)上的雞肉中的空腸彎曲菌多是來(lái)源于生產(chǎn)源頭，在養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)肉雞就由于多種原因自身帶有了空腸彎曲菌，而這些帶有空腸彎曲菌的肉雞在加工過(guò)程中，沿著生產(chǎn)鏈進(jìn)行水平傳播，這一過(guò)程中存在優(yōu)勢(shì)菌株，而優(yōu)勢(shì)菌株在環(huán)境中的生存能力要強(qiáng)于其他菌株，應(yīng)引起重視。

通過(guò)進(jìn)一步對(duì)蛋雞與肉雞的毒力因子攜帶情況，以及不同規(guī)模雞場(chǎng)空腸彎曲菌的毒力因子攜帶情況的比較，主要在neuB1、cfrA、cdtA和grpE 4種毒力基因上存在差異，其他幾種毒力因子的差異不明顯，蛋雞和中等規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)的毒力因子攜帶率較高，可能與飼養(yǎng)條件和雞的品種有關(guān)。

3 討論

從720份樣品中分離出的311株雞源空腸彎曲菌毒力基因攜帶率較高，所分離到的菌株所攜帶的毒力基因數(shù)都超過(guò)10種，表明這些毒力基因廣泛存在于空腸彎曲桿菌中，且與菌株的分布無(wú)關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)健康動(dòng)物分離到的空腸彎曲具有一定的致病性，但致病性較弱，說(shuō)明空腸彎曲菌的致病性還有其他原因?？漳c彎曲菌的毒力因子高攜帶率及致病性，對(duì)公共安全具有一定的風(fēng)險(xiǎn)，需要加強(qiáng)監(jiān)測(cè)。

盡管雞源空腸彎曲菌的毒力基因攜帶率很高，但是對(duì)宿主并沒(méi)有致病，說(shuō)明其致病性受多種因素影響，所以關(guān)于毒力因子在空腸彎曲菌致病過(guò)程中的作用還需進(jìn)一步研究。但菌株毒力基因分布的相似性提示人們，這些菌株無(wú)論是分離自何種環(huán)境，都具有引起空腸彎曲桿菌病的潛在能力，如果人們接觸到被這些菌污染的沒(méi)有加工成熟的食品，很容易造成感染，應(yīng)加強(qiáng)各生產(chǎn)環(huán)節(jié)的安全控制，保證食品安全；同時(shí)，加強(qiáng)空腸彎曲菌及其毒力基因的檢測(cè)對(duì)空腸彎曲菌病的防控具有重要意義。

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Study on ERIC-PCR Typing and Virulence Genes of Avian Campylobacter jejuni

Wang Juan1，Huang Xiumei1，Cui Xiaona2，Zhai Haihua1，Qu Zhina1，Zhao Sijun1，Wang Yudong1，Gai Wenyan1，Wang Junwei1
（1. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032; 2. Shandong Vocational Animal Science and Veterinary College，Weifang，Shandong 261061）

To understand the main transmission route and pathogenic factors of Campylobacter jejuni （C. jejuni）during poultry production process，720 samples were collected from poultry cloaca and chicken meat for isolation and identifi cation of C. jejuni resulting in 311 C. jejuni isolates. ERIC-PCR typing and virulence of the 311 C. jejuni isolates were analyzed with PCR assay. The result revealed that more than 90% isolates carried 11 virulence genes. C. jejuni was spread along the broiler production chain，and there existed dominant strains. In conclusion C. jejuni was horizontally transmitted in broiler production chain without exogenous contamination. 50% or more C. jejuni isolates carried 14 virulence genes. It is signifi cant for public health to strengthen the monitoring and control of C. jejuni from avian.

poultry source；Campylobacter jejuni；ERIC-PCR typing；virulence genes

R378.3

A

1005-944X（2015）05-0069-04

農(nóng)業(yè)部“農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估項(xiàng)目”（NO. GJFP2014007）資助

王君瑋