豬偽狂犬病毒野毒株套式PCR檢測方法的建立和應(yīng)用

張 志，樊雅婷，吳發(fā)興，劉 爽，董雅琴，邵衛(wèi)星，段 綱，王樹雙，李曉成

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，昆明云南 650201）

豬偽狂犬病毒野毒株套式PCR檢測方法的建立和應(yīng)用

張 志1，樊雅婷2，吳發(fā)興1，劉 爽1，董雅琴1，邵衛(wèi)星1，段 綱2，王樹雙1，李曉成1

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，昆明云南 650201）

為建立能鑒別豬偽狂犬病病毒（PRV）野毒株和疫苗株的實(shí)用方法，本文以疫苗株缺失的3.5kb片段為靶基因，設(shè)計(jì)了2對PCR引物，建立了能夠特異性檢測PRV野毒株的套式PCR方法。與常規(guī)PCR相比，該方法檢測極限可達(dá)10個病毒拷貝/μL，是常規(guī)PCR的1000倍，并與豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病病毒、豬細(xì)小病毒和豬圓環(huán)病毒等不存在交叉反應(yīng)現(xiàn)象。在對臨床150份樣品檢測時，套式PCR的陽性率為21.33%，常規(guī)PCR的陽性率為10%。這表明該方法具有特異性高、敏感性強(qiáng)的特點(diǎn)，是一種值得基層推廣應(yīng)用的快速診斷技術(shù)，可用于PRV的診斷和流行病學(xué)調(diào)查等。

豬偽狂犬病病毒；野毒株；套式PCR；檢測方法

豬偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）是豬偽狂犬?。≒R）的病原，屬于皰疹病毒科，基因組為雙股DNA分子，大小約150kb左右。豬是該病毒的傳染源及長期貯存宿主[1]，PRV通常儲存于豬的三叉神經(jīng)節(jié)、嗅球和扁桃體內(nèi)，在條件適合的情況下向外排毒，這使得PR的清除非常困難[2]。目前控制偽狂犬病的主要手段是接種疫苗，特別是接種基因缺失疫苗，并由此建立相應(yīng)的野毒株與疫苗株的鑒別診斷方法，西方許多國家都依賴基因缺失疫苗進(jìn)行免疫接種而制定了根除偽狂犬病的計(jì)劃，并借此根除了PR[3]。我國從上世紀(jì)80年代開始就已經(jīng)陸續(xù)使用PRV的基因缺失疫苗進(jìn)行免疫，也陸續(xù)建立了一些PRV的血清學(xué)和病原學(xué)診斷方法，如乳膠凝集試驗(yàn)、血清中和試驗(yàn)、動物接種試驗(yàn)、

病毒分離和細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)、ELISA試驗(yàn)和PCR以及熒光PCR試驗(yàn)等[2，4-6]，盡管方法在應(yīng)用時發(fā)揮了巨大的作用，但是由于我國生豬養(yǎng)殖模式多樣，管理水平不一，診斷方法或精度不高、敏感度不夠，或昂貴難以普及和應(yīng)用，這些因素都導(dǎo)致了PRV的隱性帶毒和擴(kuò)散居高不下[7，8]。為更好地監(jiān)測生豬體內(nèi)PRV野毒的潛伏感染，提高檢測PRV的敏感性，本文以疫苗株缺失的US區(qū)3.5kb片段為靶基因，建立了檢測PRV野毒感染的套式PCR方法，并在生產(chǎn)實(shí)際使用，取得了較好的效果。

1 材料與方法

1.1 病毒與病料

PRV強(qiáng)毒株MinA，PRV疫苗毒株Bartha-K61均由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心保存；豬的臨床樣品150份，采自我國華南地區(qū)部分豬場。

1.2 主要試劑與酶

質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega公司；DNAzol購自invitrogen公司，pMD-18-T 載體、2×GC BufferⅠ、LA-Taq、Ex-Taq、rTaq等均購自Takara公司。

1.3 引物 針對PRV gE基因設(shè)計(jì)引物及探針并由上海生工生物工程有限公司合成，引物及探針序列見表1。

1.4 病毒DNA提取

表1 本試驗(yàn)所用引物

根據(jù)DNAzol說明書從PRV病毒細(xì)胞培養(yǎng)物或組織中提取總DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR反應(yīng)體系及程序

套式PCR第一次擴(kuò)增使用25 μL反應(yīng)體系：Takara Taq 0.25 μL，2×GC BufferⅠ 12.5μL，dNTP Mixture 4 μL，PRV-1F 0.5 μL，PRV-1R 0.5 μL，DNA 3 μL，H2O 4.25 μL。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性4 min； 95℃30s、59℃30s、72℃1.5min，30個擴(kuò)增循環(huán)：最后72℃延伸10min。第二次擴(kuò)增同樣為25μL反應(yīng)體系：Takara Taq 0.25 μL，2×GC BufferⅠ 12.5 μL，dNTP Mixture 4 μL，PRV-F 0.5 μL，PRV-R 0.5 μL，一擴(kuò)產(chǎn)物 1 μL，H2O 6.25 μL。 擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性4 min； 95℃30s、58℃30s、72℃30s，30個擴(kuò)增循環(huán)；最后72℃延伸10min。常規(guī)PCR反應(yīng)體系為25μL：Takara Taq 0.25 μL，2×GC BufferⅠ 12.5 μL，dNTP Mixture 4 μL，PRV-F 0.5 μL，PRV-R 0.5 μL，DNA 3 μL，H2O 4.25 μL。擴(kuò)增條件與套式PCR的第二次擴(kuò)增相同。

1.6 套式PCR檢測方法影響因素篩選和確立

以MinA株為擴(kuò)增模板，分別用rTaq、Ex-Taq、LA-Taq等3種酶配合使用其生產(chǎn)廠家自帶的10×Buffer緩沖液進(jìn)行擴(kuò)增，比較3種酶的擴(kuò)增效果差異。再更換2×GC buffer緩沖液，分別使用原來的酶和相關(guān)反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，比較緩沖液對擴(kuò)增效果的影響。然后在不同的退火溫度下（55℃、58℃、60℃、62℃、64℃）分別進(jìn)行套式PCR的擴(kuò)增，比較退火溫度對擴(kuò)增效果的影響。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品制備

以MinA株為模板，將引物PRV-1F/1R擴(kuò)增的目的片段克隆到 pMD18-T載體轉(zhuǎn)化到 DH5α中，搖菌提取質(zhì)粒，經(jīng)鑒定正確后，測定質(zhì)粒濃度（拷貝/ μL），-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 敏感性檢測

將陽性質(zhì)粒10倍梯度稀釋至1×106拷貝/ μL ～1×101拷貝/μL ，以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR、套式PCR和常規(guī)PCR檢測，比較套式PCR方法與常規(guī)PCR方法之間的敏感性差異。

1.9 特異性試驗(yàn)

分別提取CSFV、PRRSV、PCV2和TGEV的

病毒核酸，用本方法分別進(jìn)行檢測，觀察是否可以同時檢測到其他病毒，以確定套式PCR方法的特異性。

1.10 樣品檢測

對華南地區(qū)豬場送檢的150份組織樣品以及實(shí)驗(yàn)室保存的PRV強(qiáng)毒及疫苗毒的細(xì)胞培養(yǎng)物樣品進(jìn)行處理，提取總DNA，分別用套式PCR及常規(guī)PCR方法進(jìn)行檢測并對檢測結(jié)果進(jìn)行比較，檢驗(yàn)套式PCR方法在臨床應(yīng)用可行性。

2 結(jié)果

2.1 影響套式PCR檢測方法因素篩選和確立

以MinA株為擴(kuò)增模板，分別用rTaq、Ex-Taq、LA-Taq等3種酶及各廠家提供的相應(yīng)緩沖液進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ex-Taq和LA-Taq能擴(kuò)增出目的條帶，但很弱，且LA-Taq酶比Ex-Taq酶的擴(kuò)增效果略好，而 rTaq根本擴(kuò)增不出特異性條帶，顯然3種酶中以LA-Taq的效果最佳。將緩沖液更換為2×GC buffer進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果3種酶都能擴(kuò)增出特異性條帶，而且條帶比常規(guī)緩沖液擴(kuò)增的條帶更亮，表明如果用不同的酶分別與2×GC buffer緩沖液配對進(jìn)行擴(kuò)增，其效果都比較好，故此后的擴(kuò)增反應(yīng)均采用LA-Taq酶。當(dāng)使用不同的退火溫度時，使用LA-Taq酶，采用2×GC buffer緩沖液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的溫度均能擴(kuò)增出明亮的特異性條帶（圖1），表明退火溫度對擴(kuò)增結(jié)果影響不大。

2.2 敏感性試驗(yàn)

圖1 套式PCR檢測條件篩選

取用引物PRV-F5/R16制備的陽性質(zhì)粒，測定其濃度為1.61×108拷貝 /μL，按比例將其倍比稀釋 成 1×106，1×105，1×104，1×103，1×102，1×101，1×100拷貝 /μL的標(biāo)準(zhǔn)品，分別使用常規(guī)PCR與套式PCR等2種方法進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示常規(guī)PCR的檢測極限是1×104拷貝 /μL（圖2），而套式PCR能檢測出的最低濃度為1×101拷貝 / μL（圖3），可見套式PCR比常規(guī)PCR的檢測敏感性高1000倍。

2.3 特異性試驗(yàn)

圖2.常規(guī)PCR敏感性檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 套式PCR敏感性檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果

分別提取PRV、CSFV、PRRSV、PCV2和PPV等5種不同病毒核酸，并進(jìn)行套式PCR，結(jié)果只有PRV擴(kuò)增出特異性條帶，其余病毒均未擴(kuò)增出（圖略），表明建立的套式PCR方法具有良好的特異性。

2.4 臨床樣品的檢測結(jié)果

為更準(zhǔn)確比較套式PCR方法和常規(guī)PCR方法的實(shí)用性，運(yùn)用本文建立的套式PCR和常規(guī)PCR

分別對華南地區(qū)的150份屠宰場樣品進(jìn)行檢測，同時用本實(shí)驗(yàn)室保存的PRV強(qiáng)毒株樣品（MinA）及疫苗毒株樣品（BK-5）作為對照。用常規(guī)PCR方法從中檢測出陽性樣品15份（圖4），陽性率為10%，而用套式PCR方法從中檢測出32份（圖5）（含常規(guī)PCR的15份陽性樣品），陽性率為21.33%，表明套式PCR方法確實(shí)比常規(guī)PCR敏感和特異。當(dāng)樣品中濃度較低時，如8、9號樣品，常規(guī)PCR僅勉強(qiáng)能檢測到特異性條帶，但套式PCR均可以檢測到一條特異明亮的條帶，說明即使樣品中存在較低濃度的病毒，仍然可以通過方法擴(kuò)增出易于判定的明亮條帶，大大提高了診斷敏感性。

3 討論

圖4 豬場樣品的常規(guī)PCR檢測情況

圖5 豬場樣品的套式PCR檢測情況

豬偽狂犬?。≒R）是一種相對較老的疫病，其病原PRV的診斷方法較多，除了經(jīng)典的病毒中和試驗(yàn)、細(xì)胞培養(yǎng)等方法以外，近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，ELISA和PCR方法都已經(jīng)成為PRV常用的診斷方法，如針對TK、gB、gG、gE、gI等多種基因的PCR以及熒光PCR診斷技術(shù)[9-12]。但鑒于PRV特殊的組織感染嗜性以及PRV基因組中G/C含量特別高的原因，即便是常規(guī)的PCR方法想要獲得良好的試驗(yàn)結(jié)果也較為困難，尤其對于基層市縣一級的實(shí)驗(yàn)室來說，建立一種簡單特異的PCR診斷方法十分必要。

PCR是一種敏感性和特異性較高的診斷方法，其影響因素較多，如緩沖液成分、酶的成分、退火溫度等，本文在研究中發(fā)現(xiàn)，就擴(kuò)增PRV的目的基因而言，緩沖液的成分對擴(kuò)增結(jié)果影響最大，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)將酶配套的緩沖液更換為GC緩沖液后更有利于目的基因的擴(kuò)增，另外酶的選擇也影響靶基因的擴(kuò)增效果，當(dāng)選擇rTaq酶時，擴(kuò)增的條帶就稍顯模糊，而用LA-Taq時，擴(kuò)增的條帶比較清晰而特異。

本文建立的套式PCR方法，由于其擴(kuò)增的目的基因?yàn)镻RV野毒株所特有片段，因此，可以鑒別野毒株和疫苗株，利用該方法可以達(dá)到清除PR野毒的目的，具有廣闊的市場應(yīng)用前景。本文的研究結(jié)果還顯示，本文建立的套式PCR診斷方法的檢測極限可達(dá)101拷貝數(shù)/μL，與用熒光PCR方法的檢測極限同一個等級[9]，遠(yuǎn)高于常規(guī)PCR的檢測極限。在150份臨床樣品檢測中，常規(guī)PCR檢測的PRV陽性率僅為10%，而套式PCR的檢測陽性率為21.33%，顯然，套式PCR方法足以滿足常規(guī)流行病學(xué)調(diào)查和病原檢測。從特異性來看，本方法不與豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病病毒、豬細(xì)小病毒和豬圓環(huán)病毒等產(chǎn)生交叉反應(yīng)，表明本方法確實(shí)是一種特異高效的診斷方法。

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國家首席獸醫(yī)師張仲秋會見蒙古國食品與農(nóng)業(yè)部副部長巴特罩力格

農(nóng)業(yè)部新聞辦公室 4月22日，國家首席獸醫(yī)師張仲秋會見了蒙古國食品與農(nóng)業(yè)部副部長巴特罩力格，雙方就中蒙畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域的合作深入交換了意見。

張仲秋表示，中蒙兩國有著良好的農(nóng)業(yè)合作關(guān)系，雙方在畜牧業(yè)、跨境動物疫病和農(nóng)業(yè)科技等領(lǐng)域開展了富有成效的合作。希望兩國今后進(jìn)一步加強(qiáng)獸醫(yī)領(lǐng)域的合作，經(jīng)常交流口蹄疫等重大動物疫病防控經(jīng)驗(yàn)，積極探討建立雙邊跨境動物疫病防控合作機(jī)制，促進(jìn)兩國農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易健康發(fā)展。巴特罩力格完全贊同張仲秋對兩國農(nóng)業(yè)合作的評價(jià)和建議，并愿意與中方共同努力，不斷深化雙邊農(nóng)業(yè)交流與合作，共同促進(jìn)兩國農(nóng)業(yè)的發(fā)展。

亞洲豬病防控技術(shù)培訓(xùn)班在北京舉辦，國家首席獸醫(yī)師張仲秋出席會議并致辭

農(nóng)業(yè)部新聞辦公室 4月13—17日，農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局與世界動物衛(wèi)生組織（OIE）在京聯(lián)合舉辦“亞洲豬病防控技術(shù)培訓(xùn)班”，國家首席獸醫(yī)師張仲秋、OIE亞太區(qū)代表處釘田博文先生出席會議并致辭。

目前，亞洲地區(qū)生豬疫情復(fù)雜，不同國家和地區(qū)之間的防控和診斷能力差距較大，這不但影響了亞洲整體豬病的防控，也對我國生豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展形成潛在威脅。為提高區(qū)域防控水平，2014年我國倡議啟動了“亞洲豬病防控項(xiàng)目”。本次培訓(xùn)是該項(xiàng)目框架下的一項(xiàng)重要活動，旨在發(fā)揮我國高致病性豬藍(lán)耳病、口蹄疫等豬病防控技術(shù)優(yōu)勢，提高區(qū)域內(nèi)實(shí)驗(yàn)室診斷能力，為逐步控制重大生豬疫病奠定基礎(chǔ)。

張仲秋表示，希望區(qū)域內(nèi)豬病參考實(shí)驗(yàn)室和各成員國家級獸醫(yī)診斷機(jī)構(gòu)建立實(shí)驗(yàn)室信息共享平臺，逐步完善區(qū)域內(nèi)豬病診斷實(shí)驗(yàn)室合作網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)疫病診斷及整體防控能力提升。

本次培訓(xùn)由中國動物疫病預(yù)防控制中心承辦，來自農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局、中國動物疫病預(yù)防控制中心和OIE亞太區(qū)代表處、柬埔寨、印度尼西亞等9個國家和地區(qū)的代表參加了培訓(xùn)。

Construction and Application of a Nest PCR Assay for Identifi cation of Field Pseudorabies Virus Strains

Zhang Zhi1，F(xiàn)an Yating2，Wu Faxing1，Liu Shuang1，Dong Yaqin1，Shao Weixing1，Duan Gang2，Wang Shushuang1，Li Xiaocheng1
（China animal health and epidemiology center，Qingdao 266032；2. Yunnan Agricultural University，Kunming 650201）

To differentiate the fi eld and vaccine pseudorabies virus （PRV）strains，a nest PCR assay was constructed by designing two nested primers based on the 3.5 kb target gene deleted in PRV vaccine strain. The detection limit of the nest PCR assay was up to 10 virus copies/μL，without cross-action with other viruses such as classical swine fever virus，porcine reproductive and respiratory syndrome virus，porcine parvovirus and porcine circovirus，while the routine PCR detected only 104virus copies/μL. Both the developed nest PCR assay and the routine PCR assay were used to test 150 fi eld samples resulting in 21.33% and 10% positive rate respectively. The results indicated that this method was of high sensitivity and specifi city and can be widely used for PRV diagnosis and investigation.

pseudorabies virus；fi eld stain；vaccine strain；nest PCR；identifi cation

S852.65

A

1005-944X（2015）05-0073-05

科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（2012FY111000）；青島市民生計(jì)劃項(xiàng)目（13-1-3-91-nsh）