消化法檢驗(yàn)旋毛蟲(chóng)病最適條件的篩選

吳秀萍，王 迪，李庶東，孫召金，劉明遠(yuǎn)

（1.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制所，衛(wèi)生部寄生蟲(chóng)與病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，世界衛(wèi)生組織瘧疾、血吸蟲(chóng)和絲蟲(chóng)病合作中心，上海 200025；2.吉林大學(xué)人獸共患病研究所，人獸共患病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130062；3.中國(guó)96423部隊(duì)，陜西 721012）

消化法檢驗(yàn)旋毛蟲(chóng)病最適條件的篩選

吳秀萍1，2，王 迪2，李庶東3，孫召金2，劉明遠(yuǎn)2

（1.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制所，衛(wèi)生部寄生蟲(chóng)與病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，世界衛(wèi)生組織瘧疾、血吸蟲(chóng)和絲蟲(chóng)病合作中心，上海 200025；2.吉林大學(xué)人獸共患病研究所，人獸共患病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130062；3.中國(guó)96423部隊(duì)，陜西 721012）

[目的] 篩選出“消化法”檢測(cè)旋毛蟲(chóng)病的最適檢測(cè)條件，即消化后收集蟲(chóng)體所需要的沉降溫度和沉降時(shí)間，為改善現(xiàn)有屠宰動(dòng)物旋毛蟲(chóng)病“消化法”檢驗(yàn)技術(shù)提供重要的參考數(shù)據(jù)。[方法] 將12個(gè)旋毛蟲(chóng)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)蟲(chóng)株（8個(gè)種和4個(gè)基因型）感染Balb/c小鼠，感染40天后剖殺，分別在4℃和25℃條件下計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)的回收肌幼蟲(chóng)百分比，計(jì)算不同溫度不同時(shí)間點(diǎn)收集到的肌幼蟲(chóng)數(shù)目與消化液原液總的肌幼蟲(chóng)數(shù)目的比值及沉降速率。[結(jié)果] 比較發(fā)現(xiàn)旋毛蟲(chóng)不同種及基因型在不同溫度和沉降時(shí)間上回收的肌幼蟲(chóng)百分比存在明顯差異，確定出適合已知旋毛蟲(chóng)每個(gè)種和基因型的消化法檢驗(yàn)最適條件，篩選出最適條件為4℃沉淀、至少沉降45分鐘。[結(jié)論] 現(xiàn)有消化法檢驗(yàn)旋毛蟲(chóng)病的國(guó)際“金標(biāo)準(zhǔn)”確實(shí)存在一定的偏差和不足，在實(shí)際應(yīng)用中有可能造成旋毛蟲(chóng)病的漏檢。本研究結(jié)果篩選出適合消化法檢驗(yàn)旋毛蟲(chóng)病的最適條件，為進(jìn)一步完善消化法檢測(cè)旋毛蟲(chóng)病的國(guó)際“金標(biāo)準(zhǔn)”提供參考。

旋毛蟲(chóng)??；消化法；最適條件；篩選

旋毛蟲(chóng)病是一種重要的食源性人獸共患寄生蟲(chóng)病，呈世界性分布，目前在一些發(fā)展中國(guó)家（如泰國(guó)、 阿根廷及中國(guó)等）仍常有暴發(fā)，不但危害人類公共衛(wèi)生，而且成為影響豬肉生產(chǎn)和食品安全的重大經(jīng)濟(jì)問(wèn)題之一。鑒于其暴發(fā)頻率、感染人數(shù)及危害性，在歐盟2006年公布15種重要新發(fā)與再發(fā)性人獸共患病病種中，旋毛蟲(chóng)病作為唯一的食源性寄生蟲(chóng)病名列其中，已成為世界各國(guó)更是世界衛(wèi)生組織（WHO）法規(guī)規(guī)定的屠宰動(dòng)物強(qiáng)制性、首檢和必檢病種（我國(guó)始于1956年）[1-3]。

旋毛蟲(chóng)國(guó)際消化法采用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)定[4]，但實(shí)際上旋毛蟲(chóng)不同種與基因型存在不同的生物學(xué)特征[5，6]，因此理論上在消化和收集方法上應(yīng)存在一定的差異?！跋ā笔悄壳巴涝讋?dòng)物旋毛蟲(chóng)病檢驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)方法，統(tǒng)一規(guī)定在室溫（25℃左右）沉降30分鐘。但某些種或基因型可能會(huì)因沉降溫度不適、沉降時(shí)間不足導(dǎo)致無(wú)法全部回收消化后的所有幼蟲(chóng)，這不但可導(dǎo)致旋毛蟲(chóng)感染程度的誤判，更為嚴(yán)重的是可能導(dǎo)致旋毛蟲(chóng)病的漏檢（幼蟲(chóng)沒(méi)有沉下來(lái)，誤判為陰性）。

本研究以Balb/c小鼠為動(dòng)物模型，利用實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)鞔男x(chóng)12個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株（8個(gè)種和4個(gè)基因型）感染Balb/c小鼠，按照旋毛蟲(chóng)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)集樣消化法，分別在4℃和25℃條件下，計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)的肌幼蟲(chóng)的回收率及沉降速率，針對(duì)已知的旋毛蟲(chóng)8個(gè)種和4個(gè)基因型，通過(guò)系統(tǒng)比較和分析消化法檢測(cè)條件上的差異，篩選出適合消化法檢驗(yàn)旋毛蟲(chóng)的最佳條件，以期改善現(xiàn)有旋毛蟲(chóng)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)消化方法可能存在的弊端。因此，本研究項(xiàng)目的開(kāi)展對(duì)進(jìn)一步完善屠宰動(dòng)物旋毛蟲(chóng)病檢驗(yàn)“金標(biāo)準(zhǔn)”具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

傳代小鼠用昆明小鼠，購(gòu)自白求恩醫(yī)學(xué)院；計(jì)數(shù)小鼠購(gòu)自白求恩醫(yī)學(xué)院的6～8周齡的Balb/c小鼠。

1.2 旋毛蟲(chóng)蟲(chóng)株

旋毛蟲(chóng)12個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株 ：本實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)鞔?，分別是：T1（ISS004）、T2（ISS042）、T3（ISS100）、T4（ISS013）、T5（ISS415）、T6（ISS034）、T7（ISS037）、T8（ISS124）、T9（ISS408）、T10（ISS572）、T11（ISS1029）、T12（暫未明確）

1.3 主要試劑和儀器

胃蛋白酶（1∶10000）和胃蛋白酶（1∶3000）購(gòu)自 AMRESCO公司；濃鹽酸、醫(yī)用低溫冰箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱、高速自控組織搗碎機(jī)、恒溫磁力攪拌器和顯微鏡。

2 方法

2.1 感染性實(shí)驗(yàn)

取實(shí)驗(yàn)室保種傳代的昆明小鼠剖殺，通過(guò)消化法分別收集12個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蟲(chóng)株的肌幼蟲(chóng)，按照300條/只的劑量接種Balb/c小鼠，每個(gè)旋毛蟲(chóng)蟲(chóng)株接種15只，接種后每天觀察其狀況。

2.2 沉降溫度和沉降時(shí)間對(duì)各蟲(chóng)株肌幼蟲(chóng)回收率的影響

旋毛蟲(chóng)國(guó)際消化法：小鼠剝皮去內(nèi)臟，用絞肉機(jī)絞碎，集樣稱取100g鼠肉消化。用燒杯裝2L的46℃胃蛋白酶消化液，將絞碎的鼠肉倒進(jìn)消化液里，在46℃溫箱內(nèi)攪拌消化30min，將消化液通過(guò)80目篩網(wǎng)過(guò)濾到2L的分液漏斗內(nèi)，沉降半小時(shí)，用小燒杯收集40mL的沉降液在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)感染40天的小鼠，每個(gè)蟲(chóng)株取15只，分成三組剖殺（即重復(fù)三次），先按照標(biāo)準(zhǔn)消化法進(jìn)行消化并抽取消化原液計(jì)數(shù)，計(jì)算出每一個(gè)蟲(chóng)株所收集到的肌幼蟲(chóng)總數(shù)；重懸混勻蟲(chóng)體，進(jìn)一步通過(guò)改變沉降溫度和沉降時(shí)間，檢測(cè)其肌幼蟲(chóng)回收率，具體方法如下：

2.2.1 抽取消化原液計(jì)數(shù)。首先在消化完全后，在消化液混勻的狀態(tài)下，抽取10mL消化液，分裝在24孔板上，每一毫升要分為4個(gè)孔。因?yàn)槊總€(gè)孔在低于250uL液體的時(shí)候才能看清楚。在顯微鏡下計(jì)數(shù)，得出每毫升消化液里的肌幼蟲(chóng)數(shù)目。然后用計(jì)算得到的每毫升肌幼蟲(chóng)數(shù)目×消化液體積=肌幼蟲(chóng)總數(shù)。

2.2.2 沉降溫度和時(shí)間。沉降溫度分為4℃和25℃；沉降時(shí)間分為20min、30min、45min、

60min、75min 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取40mL沉降液體，計(jì)數(shù)。

2.2.3 計(jì)算沉降速率和統(tǒng)計(jì)沉降最適條件。在各個(gè)溫度的時(shí)間點(diǎn)上計(jì)算沉降肌幼蟲(chóng)占肌幼蟲(chóng)總數(shù)的百分比，確定旋毛蟲(chóng)不同種及基因型的最佳沉降溫度時(shí)間條件。用分液漏斗裝入2L消化液后的液體高度，除以沉降肌幼蟲(chóng)百分比達(dá)100%時(shí)的時(shí)間，得到沉降速率。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，按照標(biāo)準(zhǔn)的旋毛蟲(chóng)國(guó)際消化法統(tǒng)計(jì)出在室溫條件下沉降30min，旋毛蟲(chóng)不同種和基因型回收率情況；回收率達(dá)到99%以上所需要的沉降條件；不同種和基因型在不同沉降溫度和沉降時(shí)間回收率到達(dá)99%以上的平均沉降速率；通過(guò)消化法收集肌幼蟲(chóng)回收率達(dá)到95%以上所需要的沉降條件。

3 結(jié)果

3.1 不同溫度和沉降時(shí)間對(duì)肌幼蟲(chóng)回收率的影響

回收率是指在集樣消化法中不同沉降時(shí)間收集到的肌幼蟲(chóng)數(shù)目與利用原消化液計(jì)算的總肌幼蟲(chóng)數(shù)目的百分比。旋毛蟲(chóng)8個(gè)種和4個(gè)基因型在4℃和25℃條件下，不同時(shí)間點(diǎn)即20min，30min，45min，60min，75min回收率明顯不同，在25℃大多數(shù)回收率都低于99%，只有T11達(dá)到99%以上，本實(shí)驗(yàn)12個(gè)旋毛蟲(chóng)蟲(chóng)株的回收率情況如下：

（1）T1、T3、T4、T11的肌幼蟲(chóng)回收率受溫度影響不大：T1在4℃或者25℃下沉降60分鐘，回收率達(dá)99%以上；T3沉降時(shí)間從45分鐘至75分鐘，回收率基本維持在93%～94%之間；T4在4℃和 25℃沉降45-75分鐘，回收率均維持在95-98%之間；T11在4℃和25℃沉降30分鐘，回收率均可達(dá)99%以上；

（2）T2、T5、T6、T7、 T8、T9、T12均在4℃沉降回收為佳：T2沉降時(shí)間延長(zhǎng)至75分鐘回收率也僅為97.08%；T5延長(zhǎng)沉降時(shí)間至75分鐘，回收率達(dá)到99.41%；T6沉降時(shí)間在45分鐘，回收率可達(dá)99%以上；T7在 4℃比25℃回收率偏高，在4℃沉降45分鐘，回收率可達(dá)99.54%，在25℃延長(zhǎng)至75分鐘回收率為98.39%；T8沉降時(shí)間為30分鐘，回收率可達(dá)99.57%；T9肌幼蟲(chóng)回收率在4℃比25℃偏高，在4℃沉降60分鐘，回收率可達(dá)99.17%，而在25℃需要75分鐘；T12沉降時(shí)間延伸到75分鐘以上，回收率仍低于90%。

（3）T10肌幼蟲(chóng)回收率在25℃回收率稍有偏高，但沉降時(shí)間延長(zhǎng)至75分鐘回收率仍低于99%；

3.2 按照國(guó)際消化法室溫沉降30min能收集到的T1-T12的肌幼蟲(chóng)數(shù)目百分比

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，按照標(biāo)準(zhǔn)的旋毛蟲(chóng)國(guó)際消化法，在室溫條件下沉降30min，不同種回收率有明顯差異，并且只有T11的回收率可達(dá)到99%以上，甚至T10和T12的回收率還達(dá)不到80%，詳見(jiàn)表1。

表1 國(guó)際消化法回收到的肌幼蟲(chóng)百分比

3.3 本實(shí)驗(yàn)中T1-T12消化法收集肌幼蟲(chóng)回收率達(dá)到99%以上的沉降條件

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)出旋毛蟲(chóng)8個(gè)種和4個(gè)基因型通過(guò)消化法收集肌幼蟲(chóng)回收率達(dá)到99%以上所需要的沉降條件明顯不同，僅有T8和T11在沉降時(shí)間為30分鐘時(shí)回收率達(dá)到99%以上，其它都需要延長(zhǎng)沉降時(shí)間且多在4℃沉降為佳，對(duì)于T2、T3、T4、T10和T12沉降時(shí)間延長(zhǎng)至75分鐘回收率也無(wú)法達(dá)到99%以上，詳見(jiàn)表2。

3.4 T1-T12沉降速率

沉降速率：分液漏斗高度與T1-T12回收率達(dá)到99%以上所需時(shí)間的比值。在本實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)一步系統(tǒng)地計(jì)算出旋毛蟲(chóng)8個(gè)種和4個(gè)基因型在不同沉降溫度和沉降時(shí)間回收率到達(dá)99%以上的平均

沉降速率（除了T2、T3、T4和T12），結(jié)果表明T11沉降最快，T5和 T10較慢，其他幾個(gè)種和基因型沉降速率沒(méi)有太大差異，詳見(jiàn)表3。

表2 T1-T12肌幼蟲(chóng)回收率到達(dá)99%以上所需沉降條件

表3 T1-T12沉降速率表

3.5 T1-T12回收率達(dá)到95%以上時(shí)的溫度和時(shí)間條件

在屠宰場(chǎng)檢驗(yàn)時(shí)，要求時(shí)效性，以節(jié)省時(shí)間和以實(shí)際應(yīng)用為目的，故統(tǒng)計(jì)出在沉降百分比達(dá)到95%以上的最適沉降溫度和時(shí)間。結(jié)果表明：除了T3、T10和T12，其他種和基因型均在低于45min回收率可達(dá)到95%以上，其中T3和T11僅需要20min，沉降溫度多在4℃為佳，詳見(jiàn)表4。

4 討論

旋毛蟲(chóng)的檢測(cè)方法主要包括：鏡檢法、集樣消化法和血清學(xué)檢測(cè)[4]。鏡檢法和集樣消化法屬于直接檢測(cè)法，目前旋毛蟲(chóng)檢驗(yàn)“金標(biāo)準(zhǔn)”是集樣消化法。對(duì)于常規(guī)屠宰豬尸體檢驗(yàn)，用消化法消化至少1g最佳部位的肉來(lái)檢查；為達(dá)到更高的診斷敏感性，對(duì)于馬肉和野味肉，應(yīng)選取至少5-10g的最佳部位肌肉分別進(jìn)行消化；人工消化法允許檢測(cè)100克尸體碎塊。盡管人工消化法需要更多的技術(shù)設(shè)備，但它滿足了成本效益和敏感性、效率的要求，沒(méi)有包囊的旋毛蟲(chóng)在液態(tài)消化液里也可以被檢測(cè)出來(lái)。通過(guò)消化液（含有1%胃蛋白酶和1%濃鹽酸）使肌幼蟲(chóng)釋放出來(lái)，經(jīng)過(guò)濾和沉降過(guò)程，在顯微鏡下檢測(cè)肌幼蟲(chóng)[4]，目前旋毛蟲(chóng)檢驗(yàn)國(guó)際“金標(biāo)準(zhǔn)”的集樣消化法采用統(tǒng)一的沉降條件，即消化后在室溫（25℃左右）沉降30分鐘，鏡檢肌幼蟲(chóng)。

表4 T1-T12肌幼蟲(chóng)回收率到達(dá)95%以上所需沉降條件

根據(jù)旋毛蟲(chóng)國(guó)際消化法的“金標(biāo)準(zhǔn)”，本研究結(jié)果表明已知12個(gè)旋毛蟲(chóng)蟲(chóng)種的肌幼蟲(chóng)回收率均未能達(dá)到100%，只有T8和T11的肌幼蟲(chóng)回收率可以達(dá)到99%以上且沉降速率較快，其他在75%～98%之間，且多數(shù)在4℃沉降為佳，因此本研究證實(shí)了旋毛蟲(chóng)國(guó)際消化法的金標(biāo)準(zhǔn)的確存在一定的偏差和不足，表明現(xiàn)有旋毛蟲(chóng)消化法的國(guó)際“金標(biāo)準(zhǔn)”在實(shí)際應(yīng)用中有可能造成旋毛蟲(chóng)病的漏檢。另外，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)沉降溫度對(duì)T2的肌幼蟲(chóng)回收率影響很大，在低溫環(huán)境下沉降速度較快，這可能與其地理分布有關(guān)，T2主要分布在低溫地區(qū)，是最耐冷的旋毛蟲(chóng)蟲(chóng)種，在冰凍的肌肉中甚至能存活幾年；而T10肌幼蟲(chóng)整體上沉降速度都很慢，這可能與其形態(tài)有關(guān)，T10是無(wú)包囊旋毛蟲(chóng)，在肌肉中呈伸展長(zhǎng)條狀，消化后肌幼蟲(chóng)劇烈運(yùn)動(dòng)及不卷曲形態(tài)影響了其沉降速度；T5多數(shù)成松散卷曲或曲線、運(yùn)動(dòng)緩慢、在液體中懸浮，這些形態(tài)特征極大地影響了其沉降速度；T12的肌幼蟲(chóng)體型最細(xì)小，多數(shù)都成漂浮狀態(tài)，也許因其比重較低導(dǎo)致其沉降很慢、肌幼蟲(chóng)回收率很低，即使沉降時(shí)間延長(zhǎng)到75分鐘，也僅僅達(dá)到89%左右的回收率。因此，旋毛蟲(chóng)不同種及基因型的生物學(xué)特性的差異[5-9]，如地理分布、耐冷耐熱、形態(tài)大小、運(yùn)動(dòng)形態(tài)、有無(wú)包囊、宿主及繁殖能力等可能與肌幼蟲(chóng)回收率的高低密切相關(guān)。

本研究成功篩選出適合消化法檢驗(yàn)旋毛蟲(chóng)病的最適條件，為進(jìn)一步完善現(xiàn)有旋毛蟲(chóng)病檢驗(yàn)“金標(biāo)準(zhǔn)”（即“集樣消化法”）的提供了重要實(shí)驗(yàn)參考數(shù)據(jù)，對(duì)規(guī)范旋毛蟲(chóng)病診斷方法具有重要意義。

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The Screening of Optimum Conditions of Digestion Method for Detecting Trichinellosis

Wu Xiuping1，2，Wang Di2，Li Shudong3，Sun Zhaojin2，Liu Mingyuan2
（1.National Institute of Parasitic Diseases，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Laboratory of Parasite and Vector Biology，Ministry of Health，WHO Collaborating Centre for Malaria，Schistosomiasis and Filariasis，Shanghai 200025；2.Institute of Zoonoses，Key Laboratory of Zoonoses，Ministry of Education，Jinlin University，Changchun，Jilin 130062；3.PLA Unit 96423，Shaanxi 721012）

[Objective] To screen the optimum conditions including sedimentation temperature and sedimentation coefficient in collecting larvae after digestion，providing important reference data to improve the current “digestion method” for detecting trichinellosis in slaughtering animals.[Methods] 12 international reference Trichinella strains including 8 species and 4 genotypes were used experimentally to infect Balb/c mice，which were killed 40 dpi. The ratio of recovered muscle larvae and total muscle larvae in the digesting fluid were calculated respectively at 4 ℃ and 25 ℃and at different time points，and then the sedimentation coefficient of different Trichinella species and genotypes were compared and analyzed. [Results] It was found through comparison that the muscle larvae recovery rates differed significantly in different Trichinella species and genotypes at different sedimentation temperature and time. The optimum conditions of digestion method for the known Trichinella species and genotypes were screened：the digested larvae should be settled at 4℃ for at least 45min. [Conclusion] This study demonstrated the current international gold method for detection of Trichinellosis by means of digestion had certain bias resulting in misdetection. The screening optimum conditions of digestion method for detecting different Trichinella species and genotypes in the study provided the reliable experimental data and reference value to improve international gold digestion method for detecting Trichinella.

Trichinellosis；Digestion Method；Optimum Conditions；Screening

R383.15

B

1005-944X（2015）03-0062-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（NSFC31030064）

吳秀萍，劉明遠(yuǎn)