致犢牛腹瀉大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

馬長賓，陳文武，王忠山，崔 蕾，郭 文，張子榮

（新疆建設兵團第六師五家渠市畜牧獸醫(yī)工作站，新疆五家渠市 831300）

致犢牛腹瀉大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

馬長賓，陳文武，王忠山，崔 蕾，郭 文，張子榮

（新疆建設兵團第六師五家渠市畜牧獸醫(yī)工作站，新疆五家渠市 831300）

[目的]了解新疆第六師規(guī)模奶牛場犢牛腹瀉大腸桿菌致病性、血清型分布及藥物敏感性。[方法]對從第六師部分奶牛場采集的296份腹瀉犢牛肛拭樣品，進行了鑒別培養(yǎng)、一系列生化試驗、血清型鑒定、藥敏試驗等。[結果]分離到的192株埃希氏大腸桿菌中，表現(xiàn)β型溶血的83株；83株β型溶血大腸桿菌中，造成小鼠發(fā)病死亡的74株；對頭孢他啶、阿奇霉素、諾氟沙星、恩諾沙星、氟苯尼考敏感性分別為100%、85.14%、70.27%、64.86%、63.51%；101團、103團、共青團農(nóng)場、軍戶農(nóng)場、奇臺農(nóng)場優(yōu)勢血清型分別為O101、O78、O141、O44、O15。[結論]該地區(qū)分離出的致病性大腸桿菌對頭孢他啶、阿奇霉素、諾氟沙星、恩諾沙星、氟苯尼考有較大的敏感性，對其他抗生素均產(chǎn)生不同程度的耐藥性，不同地區(qū)具有不同的優(yōu)勢血清型。

犢牛腹瀉；大腸桿菌；生化鑒定；致病性；藥物敏感性

近幾年來，隨著養(yǎng)牛業(yè)規(guī)模擴大和集約化生產(chǎn)程度的提高，犢牛腹瀉的發(fā)病率和死亡率也呈上升趨勢[1]。犢牛腹瀉（又稱為犢牛白?。┦菭倥３Ｒ姷囊环N臨床疾病，其中由致病性大腸桿菌引起的占90%[2]。新生犢牛多表現(xiàn)為暴發(fā)性腹瀉，病程短、死亡率高，確診困難，往往在一個時期內(nèi)發(fā)病率可達80%，給養(yǎng)牛業(yè)帶來較大的經(jīng)濟損失[3]。目前，對犢牛腹瀉病的治療，主要采用抗生素治療并結合支持療法，雖然具有較好療效，但易產(chǎn)生耐藥性及畜產(chǎn)品藥物殘留超標等，易引起食品安全和公共衛(wèi)生問題[4]，因此，迫切需要對犢牛腹瀉大腸桿菌及其耐藥情況進行檢測。

當前，新疆牛源大腸桿菌分離鑒定及耐藥情況

檢測已陸續(xù)展開，喻華英等[5]研究報道，新疆部分地區(qū)引起犢牛腹瀉大腸桿菌優(yōu)勢血清型均存在地域差異，夏利寧等[6]和南海辰等[7]對不同地區(qū)牛場大腸桿菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥情況進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)不同地域牛源大腸桿菌耐藥情況有較大的差異，郝彥龍[8]等分離的致病性大腸桿菌，產(chǎn)生典型的β溶血的占分離株的60.29%，喻華英等、郝彥龍等和元振杰等[9]從大腸桿菌血清型、粘附素及腸毒素測定、對小鼠致病性等方面，研究了致犢牛腹瀉大腸桿菌的致病性。而新疆生產(chǎn)建設兵團第六師規(guī)模化奶牛場犢牛腹瀉大腸桿菌的致病性、血清型分布及耐藥情況卻鮮見報道，致病情況、耐藥情況及優(yōu)勢血清型不明。本試驗主要通過對臨床上犢牛腹瀉病例進行細菌分離鑒定及藥物敏感試驗，測定分析不同來源大腸桿菌致病性和常用抗菌素的敏感性以及血清型，掌握規(guī)?；膛鰻倥８篂a大腸桿菌的耐藥情況及血清型分布，獲取的耐藥性數(shù)據(jù)及優(yōu)勢血清型可指導該地區(qū)養(yǎng)殖場臨床合理用藥及自家滅活苗的研制。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集。從新疆西部準格爾牧業(yè)、101團、奇臺農(nóng)場、軍戶農(nóng)場、103團農(nóng)場等地部分規(guī)?；霾杉篂a犢牛肛拭，共296份。

1.1.2 主要儀器設備。生物安全柜、恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡、無菌操作臺等。

1.1.3 主要藥品和試劑。大腸埃希氏菌ATCC 25922標準菌株、 磷酸對硝基苯酚，鹽酸二甲基對苯撐二胺，a-甲基-D葡萄糖甙，L-A-賴氨酸等均購自Sigma公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析提純；大腸桿菌科11種常規(guī)抗生素藥敏紙片和生化微量發(fā)酵管均購自杭州天和微生物試劑有限公司；大腸桿菌標準抗“O”血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.4 細菌分離及生化鑒定培養(yǎng)基。普通營養(yǎng)瓊脂平板、普通營養(yǎng)肉湯、5%兔鮮血營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、伊紅美藍瓊脂平板自行配制；氧化酶試驗紙片、苯丙氨酸脫氨酶、賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基均參照文獻[10]方法制備。

1.1.5 健康小白鼠購自新疆醫(yī)科大學動物實驗室，共300只，公母各半。

1.2 方法

1.2.1 受檢菌株分離鑒定。將采集的犢牛肛拭，放入內(nèi)含1mL滅菌營養(yǎng)肉湯的EP管中，37℃恒溫培養(yǎng)18-24h，用接種環(huán)將菌液接種于麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18-24h，再從麥康凱瓊脂平板上挑取孤立的紅色菌落，接種于伊紅美蘭平板，再從伊紅美蘭平板上挑取單個黑色金屬光澤的菌落。疑似菌株經(jīng)革蘭氏染色及生化鑒定后，確定為大腸桿菌者保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 溶血及動物致病性實驗。將分離鑒定出來的埃希氏大腸桿菌單個菌落無菌接種于5%兔血平板，置于37℃溫箱中培養(yǎng)18～24h后，觀察并記錄溶血情況；將溶血實驗中呈現(xiàn)β型溶血的所有菌株分別接種普通斜面，37℃培養(yǎng)18 h，然后用PBS洗脫，并用麥氏比濁管確定菌液濃度為3×108個細菌/mL，腹腔接種于4只健康小白鼠（公母各半），每只接種0.5 mL，同時設1只健康小白鼠注射等量無菌PBS液作為對照。接種后觀察并記錄小鼠在72 h內(nèi)的變化情況，如小鼠發(fā)生死亡，則從小鼠心、肝、脾等臟器分離回收細菌。

1.2.3 藥物敏感性試驗。將分離鑒定后確定為致病性大腸桿菌的菌落無菌接種于營養(yǎng)肉湯37℃搖床培養(yǎng)18h，用生理鹽水校正至0.5麥氏單位標準比濁管相同，備用；在15 min內(nèi)，用無菌棉拭子蘸取菌液涂布于烘干好的MH瓊脂平板整個表面，反復涂布均勻。用滅菌的鑷子貼藥敏紙片，要求紙片之間中心距離不小于24 mm，紙片邊距平皿邊不小于15 mm[11]，置37℃溫箱，培養(yǎng)24h后測量抑菌環(huán)直徑（單位為mm），結果按照NCCLS藥敏試驗國際標準（第8版）進行判定[12]。

1.2.4 血清型鑒定。對初步鑒定為致病性埃希氏大腸桿菌的菌株，培養(yǎng)處理制成凝集抗原，分別與O抗原定型血清進行試管凝集試驗，并按規(guī)定標準判定其血清型。

2 結果及分析

2.1 受檢菌株分離鑒定結果

根據(jù)病原菌的形態(tài)特性（圖1）、生長特性（圖2），確定所分離到的296株菌中有241株均為疑似大腸桿菌。 參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》及《伯杰細菌鑒定手冊》要求[10，13]，將241株紅色菌落中的細菌，分別進行生化試驗，有14株產(chǎn)H2S，9株VP試驗為陽性，26株吲哚試驗為陰性，予以剔除；其余菌株（192株）均能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸，均不產(chǎn)生H2S，符合大腸桿菌的生化特性。（詳見表1）

圖1 大腸桿菌革蘭氏染色的鏡檢形態(tài)（10×100）

圖2 麥康凱平板上菌落形態(tài)

表1 受檢疑似大腸桿菌生化試驗結果

表2 致犢牛腹瀉大腸桿菌藥物敏感性試驗結果

2.2 受檢菌溶血特征及小鼠致病性試驗結果

將生化鑒定的192株菌落接種于5%兔全血瓊脂平板，進行提純37℃培養(yǎng)24h后，觀察到中等大小、凸起、邊緣整齊、表面光滑、濕潤的乳白色菌落，有83株菌表現(xiàn)為β型溶血，周圍出現(xiàn)明顯的透明溶菌環(huán)。選取83株有典型β型溶血的埃希氏大腸桿菌接種小白鼠，實驗結果顯示：有89.2%（74/83）的菌株能致各試驗組健康小白鼠在18～72h全部死亡，剖檢死亡小鼠，其肝臟或腸出現(xiàn)嚴重出血，脾有梗死，而對照組小鼠沒有異常反應，健活。無菌取病變肝臟或腸管作細菌分離、鑒定，回收得到的細菌培養(yǎng)特性、形態(tài)、生化反應均符合大腸桿菌的特性。

2.3 藥物敏感性試驗結果

從鑒定出的192株大腸桿菌中，挑取74株致病性大腸桿菌做了藥敏試驗，所檢測出來的大腸桿菌100%敏感的藥物只有頭孢他啶，敏感率≥50%的由高到低依次是頭孢他啶（100%）、阿奇霉素（85.14%）、諾氟沙星（70.27%）、恩諾沙星（64.86%）、氟苯尼考（63.51%），其余的均有不同程度的耐藥。（詳見表2）

2.4 新疆第六師不同地區(qū)致犢牛腹瀉大腸桿菌O抗原血清型

分離鑒定的74株致病性大腸桿菌，涵蓋了18種病原性大腸桿菌O抗原血清型。各個地區(qū)致犢牛腹瀉大腸桿菌O抗原血清型的種類較多，但基本都有主要的優(yōu)勢血清型，101團、103團、共青團農(nóng)場、軍戶農(nóng)場、奇臺農(nóng)場優(yōu)勢血清型分別為O101、O78、O141、O44、O15。（詳見表3）

3 討論與小結

表3 新疆第六師不同地區(qū)致犢牛腹瀉大腸桿菌O抗原血清型分布表

3.1 致犢牛腹瀉大腸桿菌對腸桿菌科11種常規(guī)抗生素藥敏試驗結果顯示，頭孢他啶敏感率為100%，這說明本實驗分離的犢牛致病性大腸桿菌菌株，對頭孢類藥物無耐藥性，這與元振杰等[9]報道一致，而與方光遠等[2]報道相反，原因可能與奶牛場長期使用抗生素有關。Tadesse等[14]報道了人和各種畜禽大腸桿菌耐藥性的產(chǎn)生與長期使用各種抗生素有關。本實驗藥敏試驗結果還顯示，11種臨床常用抗菌素，除頭孢他啶、阿奇霉素、諾氟沙星表現(xiàn)出較強的抑菌性，其余都有不同程度的耐藥性，抑菌效果相對較弱。這些耐藥性的產(chǎn)生可能與這些奶牛場近年來的預防和治療用藥習慣有關。因此，各個牛場，特別是規(guī)模奶牛場，應配備技術過硬的獸醫(yī)技術人員，同時，還應增強合理用藥、科學管理的意識，不斷提高用藥技能，避免病原菌耐藥性的產(chǎn)生，才能從根本上解決問題，降低發(fā)病率，降低經(jīng)濟損失。

3.2 致病性大腸桿菌和非致病性大腸桿菌在培養(yǎng)特性和生化反應等方面相似，但致病性大腸桿菌具有特殊的血清型、腸毒素或毒力因子，其溶血性及對實驗動物致病性也是其致病性特性。郝彥龍等[8]報道，大多數(shù)能表達F41和K99的致犢牛腹瀉大腸桿菌能產(chǎn)生溶血，它們能在含有動物血的平板上于菌落周圍呈現(xiàn)典型的β溶血環(huán)，盡管溶血性可用于腸毒素大腸埃希菌的初步篩選，但還有近10%的溶血大腸桿菌對小白鼠沒有致病性。本實驗中呈典型β溶血占分離大腸桿菌菌株的44%（83/192），同時發(fā)現(xiàn)有89.92%（74/83）分離株有明顯的β溶血環(huán)，可致小鼠死亡[15-16]。本實驗通過對分離大腸桿菌血清型、溶血性及對試驗動物致病性，對致病性大腸桿菌進行了鑒定，但還需通過測定分離菌株黏附素及腸毒素基因片段，來進一步研究大腸桿菌致病性與溶血性的相關性。因此，致病性大腸桿菌的鑒定，應在常規(guī)培養(yǎng)和生化鑒定的基礎上結合動物實驗，有條件的情況下，還可以借助分子生物學方法，以減輕工作量和提高試驗準確性。

3.3 由于犢牛腹瀉大腸桿菌O抗原血清型存在一定的地區(qū)差異性，近幾年來張艷英等[17]、羅甜甜等[18]、夏利寧等[6]在不同地區(qū)分離到各種血清型的犢牛腹瀉大腸桿菌。本實驗分離出的O15和O141病原性大腸桿菌血清型鮮見報道，而O101、O44和O78病原性大腸桿菌血清型與郝彥龍等[8]和喻華英等[5]報道的新疆不同地區(qū)犢牛腹瀉大腸桿菌優(yōu)勢血清型（O101、O44、O78）相符合。本試驗分離出的O15和O141血清型雖報道少，但同樣可引起犢牛腹瀉疾病。大量研究報道表明，病原性大腸桿菌血清型復雜多樣，不同地區(qū)、不同牛場的血清型有較大差異且血清型在不斷變化，這可能是商品疫苗不能提供穩(wěn)定有效免疫力的主要原因。因此，通過本試驗掌握了新疆第六師不同團（場）致犢牛腹瀉大腸桿菌優(yōu)勢血清型分布，可為該地區(qū)犢牛腹瀉病自家苗的研制奠定基礎。

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Isolation，Identifi cation and Drug susceptibility Test of E.coli strains Isolated from Calves with Diarrhea

Ma Changbin，Chen Wenwu，Wang Zhongshan，Cui Lei，Guo Wen，Zhang Zirong
（Sixth Agricultural Division Wujiaqu City Animal husbandry andVeterinary Station，Wujiaqu ，Xinjiang 831300）

In order to understand pathogenicity，serotype distribution and drug sensitivity of E.coli strains isolated from calves with diarrhea in scale dairy farms in the sixth division of Xinjiang Construction Corps，296 anal swab samples were taken from calves with diarrhea in part scale dairy farms in the sixth division of Xinjiang Construction Corps for differential cultivation，biochemical test，serotyping，and drug sensitivity test. The results showed 241 E. coli strains were isolated with 83 strains as beta hemolytic type and 74 out of 83 beta hemolytic Escherichia coli strains caused mice sick and dead. The sensitivities of the isolated strains to ceftazidime，azithromycin，norfloxacin，enrofloxacin and fluorine benzene nicol were 100%，85.14%，70.27%，64.86%，and 63.51% respectively；the dominant serotypes were O101，O78，O141，O44 and O15 respectively in Regiment 101，Regiment 103，the Communist Youth League Farm，Junhu Farm and Qitai Farm. It was concluded that the pathogenic Escherichia coli strains isolated in the region were relatively sensitive to cephalosporin，azithromycin，norfloxacin，enrofloxacin and fluorine benzene nicol，but showed different degrees of resistance to other antibiotics. Different regions had different dominant serotypes.

calf diarrhea；E. coli；biochemical identification；pathogenicity；drug sensitivity

S858.23

B 章編號：1005-944X（2015）03-0078-05

兵團青年科技創(chuàng)新資金專項（2014CB021）