豬源性blaNDM-1陰性雷氏普羅威登斯菌的分離鑒定

王建昌，姜彥芬，王金鳳，陳志敏，李 靜

（河北出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，河北石家莊 050051）

豬源性blaNDM-1陰性雷氏普羅威登斯菌的分離鑒定

王建昌，姜彥芬，王金鳳，陳志敏，李 靜

（河北出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，河北石家莊 050051）

為了解美國進(jìn)口種豬人畜共患性致病菌的攜帶情況，本研究采集種豬新鮮糞便樣品，進(jìn)行常見致病菌的分離。結(jié)果在120份樣品中分離到1株普羅威登斯菌，命名為HBA13。通過不同選擇性培養(yǎng)基、常規(guī)生化鑒定及16S rRNA基因序列同源性比對(duì)分析，鑒定HBA13為雷氏普羅威登斯菌（Providencia rettgeri）。鑒于雷氏普羅威登斯菌在細(xì)菌耐藥性方面的重要意義，進(jìn)行了NDM-1表型檢測(cè)，并利用PCR方法進(jìn)行blaNDM-1耐藥基因的檢測(cè)，結(jié)果表明所分離雷氏普羅威登斯菌blaNDM-1耐藥基因?yàn)殛幮?。豬源性blaNDM-1陰性雷氏普羅威登斯菌的分離，為今后相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

豬；雷氏普羅威登斯菌；分離；鑒定；blaNDM-1基因

雷氏普羅威登斯菌（Providencia rettgeri）屬于腸桿菌科，普羅威登斯菌屬，流行病學(xué)研究表明，雷氏普羅威登斯菌主要與旅行者的腹瀉有關(guān)，感染雷氏普羅威登斯菌后可引發(fā)腹瀉、腦部、肺部、尿道等多種疾病[1]，2006 年衛(wèi)生部將該菌列入人間傳染的病原微生物名錄[2]。該菌屬于人畜共患病病原，食物伴侶菌，可以污染食物造成中毒，同時(shí)該菌極易產(chǎn)生耐藥性，特別是blaNDM-1導(dǎo)致的耐藥性。目前大部分常用抗生素都含有β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)，因此攜帶blaNDM-1的細(xì)菌可以使幾乎所有臨床常用抗生素失效[3]。

目前雷氏普羅威登斯菌引起人或動(dòng)物感染情況在國內(nèi)外均有報(bào)道。1997年，戰(zhàn)文斌等[4]從患有敗血病的中國對(duì)蝦體內(nèi)分離到三株P(guān)rovidencia rettgeri，并證實(shí)為引起對(duì)蝦白血病的病原。2005年，章根華[5]報(bào)道了一起由Providencia rettgeri污染食物引起的食物中毒事件。2010年，昆山口岸從來自臺(tái)灣的集裝箱中截獲兩只京都亞洲蠊，并從中分離到Providencia rettgeri[6]。2012年，王建

峰等[7]從外來船舶壓艙水中，蔣瑩等[8]在新疆地區(qū)183例以急性腹瀉為首發(fā)癥狀的病例中，Ayaka Shima等[1]在日本345份腹瀉兒童糞便樣品中，均分離到Providencia rettgeri。2013年，Marti T K等[9]首次報(bào)道了雷氏普羅威登斯菌在印度引起病人的醫(yī)院獲得性或社區(qū)獲得性腦膜炎和硬腦膜下積膿；Kycko A等[10]從鱷魚巨蜥的肺組織中分離到Providencia rettgeri。近年來，國內(nèi)外對(duì)廣泛耐藥及blaNDM-1基因陽性的Providencia rettgeri的分離報(bào)道屢見不鮮。2013年，Nachiket P. Marathe等[11]從抗生素生產(chǎn)企業(yè)的污水處理廠中分離到93株廣譜耐藥菌，其中一株P(guān)rovidencia rettgeri對(duì)12大類的35種抗生素耐藥；Barrios H等[12]在墨西哥，Carvalho-Assef AP等[13]在巴西，Shiraz Gefen-Halevi等[14]在以色列，夏淑等[15]在我國廣州均分離到blaNDM-1基因陽性的Providencia rettgeri。

本文首次報(bào)道了從進(jìn)口美國種豬新鮮糞便樣品中分離到一株blaNDM-1基因陰性的雷氏普羅威登斯菌。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

本研究使用的培養(yǎng)基購自北京陸橋有限公司；API 20E、VITEK GNI 陰性菌鑒定卡，購自法國梅里埃公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購自北京天根；pMD? 19-T Simple Vector（CK1101CA），購自寶生物生物工程公司；藥敏紙片、NDM-1（Ⅰ型新德里金屬β－內(nèi)酰胺酶）檢測(cè)盒（C073），購自杭州濱河微生物試劑有限公司；2×Taq PCR MasterMix、Wizard? SV Gel and PCR Clean-Up System，購自美國Promega公司。本研究所用新鮮糞便樣品共計(jì)120份，采自進(jìn)口美國杜洛克、長(zhǎng)白和大約克種豬。

1.2 主要設(shè)備

MIR-254-PC恒溫培養(yǎng)箱（日本松下）；VITEK2 Compact（法國梅里埃）；OLYMPUS CX31顯微鏡（日本 OLYMPUS）；普通PCR儀（德國Biometra）。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)文獻(xiàn)[16，17]設(shè)計(jì)擴(kuò)增細(xì)菌16sRNA基因、細(xì)菌耐藥性基因blaNDM-1的引物，由上海生工合成。

1.4 細(xì)菌分離純化

將采集的新鮮糞便樣品于PBS緩沖液中4 ℃保存，分離前用渦旋振蕩器震蕩1 min，用接種環(huán)劃線分離培養(yǎng)于XLD瓊脂平板，36 ℃，培養(yǎng)18 h，挑取平板上的優(yōu)勢(shì)菌落分離純化。同時(shí)挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色觀察細(xì)菌形態(tài)。將獲得的純菌種分別接種于血瓊脂平板、EMB瓊脂和SS瓊脂平板，36 ℃培養(yǎng)18 h，分別觀察生長(zhǎng)情況及菌落特征。

1.5 細(xì)菌生化鑒定

1.5.1 初步生化鑒定。將分離純化菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、穿刺接種于三糖鐵瓊脂斜面，苯丙氨酸瓊脂斜面。

1.5.2 API 20E生化鑒定。根據(jù)革蘭氏染色及初步生化反應(yīng)結(jié)果選用API 20E進(jìn)行生化鑒定。將接種血平板純培養(yǎng)24 h的菌，在塑料管中加入3 mL 0.85% NaCl鹽水，挑取少量純菌，用比濁儀測(cè)定濁度，調(diào)節(jié)菌懸液濃度在0.50麥?zhǔn)蠁挝?，將菌懸液滴入鑒定卡，36 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1.5.3 VITEK 2 Compact細(xì)菌全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)。根據(jù)革蘭氏染色結(jié)果選用VITEK GNI陰性菌鑒定卡，將接種血平板純培養(yǎng)24 h的菌，在塑料管中加入3mL 0.45% NaCl鹽水，挑取少量純菌，用比濁儀測(cè)定濁度，調(diào)節(jié)菌懸液濃度在0.50～0.63麥?zhǔn)蠁挝?，插入鑒定卡，VITEK2 Compact細(xì)菌全自動(dòng)鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

1.6 細(xì)菌16sRNA基因序列分析

根據(jù)文獻(xiàn)[16]介紹的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行16sRNA基因的PCR擴(kuò)增檢測(cè)，回收目的片段，連接PMD19-T載體，將菌液送上海生工測(cè)序，最后在NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)。同時(shí)在NCBI下載多個(gè)已公布的16srRNA基因序列進(jìn)行相似性比較，用MEGA5.2軟件采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.7 細(xì)菌NDM-1表型及耐藥基因blaNDM-1檢測(cè)

根據(jù)細(xì)菌NDM-1表型檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行所分離細(xì)菌的NDM-1表型檢測(cè)，同時(shí)根據(jù)文獻(xiàn)[17]

介紹的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行分離菌株blaNDM-1基因檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌形態(tài)及培養(yǎng)特征

該菌在顯微鏡下觀察，為革蘭陰性桿菌，兩端鈍圓，無芽孢，無莢膜。在EMB和SS瓊脂平板上均形成濕潤(rùn)、凸起、半透明中心暗色的光滑菌落（圖1A、B） ；在血瓊脂平板上形成中等大小、濕潤(rùn)凸起、無蔓延生長(zhǎng)的灰白色菌落（圖1C）；在XLD上形成濕潤(rùn)、凸起、半透明無暗色中心的光滑菌落（圖1D）。

圖1 分離菌株在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

2.2 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

初步生化鑒定該菌為革蘭陰性桿菌，在三糖鐵斜面產(chǎn)堿，底層產(chǎn)酸，無產(chǎn)氣，無動(dòng)力，氧化酶陰性，觸酶陽性，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，苯丙氨酸脫羧酶試驗(yàn)陽性。根據(jù)API 20E生化分析結(jié)果和VITEK2 Compact陰性菌鑒定卡結(jié)果，所分離細(xì)菌鑒定為雷氏普羅威登斯菌。

2.3 16srRNA基因序列分析

以菌株HBA13的基因組DNA為模板，16sr-RNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終得到長(zhǎng)度約為1.5kb的擴(kuò)增產(chǎn)物。16srRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示（圖2），菌株HBA13與Providencia rettgeri 序列相似性最高，同源性為99%。

圖2 鄰接法構(gòu)建的普羅威登斯菌系統(tǒng)進(jìn)化樹

綜合該菌的生化鑒定結(jié)果和16srRNA基因序列分析結(jié)果，將所分離菌株HBA13確定為雷氏普羅威登斯菌。

2.4 細(xì)菌NDM-1表型及耐藥基因blaNDM-1檢測(cè)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，美羅培南和亞胺培南對(duì)該菌的抑菌圈直徑分別為27mm和29mm，均大于22mm，說明細(xì)菌NDM-1表型初篩為陰性；含有EDTA的復(fù)合紙片同不含EDTA的單獨(dú)紙片抑菌圈直徑均為27mm，無明顯區(qū)別，確認(rèn)細(xì)菌為NDM-1表型陰性；以分離菌株基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，未檢測(cè)到blaNDM-1286bp特異性片段。結(jié)果表明菌株HBA13未攜帶blaNDM-1耐藥基因，所分離到的雷氏普羅威登斯菌為NDM-1表型陰性菌株。

3 討論

3.1 目前條件性致病菌的污染及其在環(huán)境、食品中的存在狀況越來越受到重視。雷氏普羅威登斯菌作為條件致病菌，在國內(nèi)外有關(guān)報(bào)道中對(duì)其來源和感染途徑的研究也在逐年增加。本文通過API 20E生化鑒定、VITEK 2 Compact細(xì)菌全自動(dòng)微生物鑒定、藥敏試驗(yàn)、16S rRNA 基因序列分析，從美國進(jìn)口種豬糞拭子中成功分離到一株雷氏普羅威登斯菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雷氏普羅威登斯菌對(duì)營養(yǎng)要求不高，在SS瓊脂和麥康凱瓊脂上均生長(zhǎng)良好，且具有不發(fā)酵乳糖或遲緩發(fā)酵乳糖的特性，在其平板上

形成的濕潤(rùn)、凸起、半透明中心暗色光滑菌落。這明顯區(qū)分于發(fā)酵乳糖的大腸埃希氏菌屬。該菌與其它常見腸桿菌科的區(qū)別是，變形桿菌屬產(chǎn)硫化氫而該菌屬不產(chǎn)生硫化氫，摩根菌屬不產(chǎn)生鳥氨酸脫羧酶而該菌屬鳥氨酸脫羧酶陽性。該菌屬間的鑒別要點(diǎn)是雷氏普羅威登斯菌脲酶和阿拉伯醇陽性；斯氏普羅威登斯菌海藻糖陽性；產(chǎn)堿普羅威登斯菌半乳糖陰性；拉氏普羅威登斯菌枸櫞酸鹽陰性。

3.2 目前的流行病學(xué)調(diào)查表明，源自印度、巴基斯坦的blaNDM-1超級(jí)細(xì)菌，在短短數(shù)月內(nèi)，隨著人口流動(dòng)就已經(jīng)蔓延至歐洲、美洲、大洋洲。目前發(fā)現(xiàn)攜帶blaNDM-1耐藥基因的雷氏普羅威登斯菌在墨西哥、巴西、以色列、中國等國家均有報(bào)道[12-15]。qnrD是一種發(fā)現(xiàn)于上世紀(jì)90年代的編碼喹諾酮類抗性基因。Thomas Guillard等[18]分離到兩株雷氏普羅威登斯菌，均攜帶能夠編碼qnrD基因的大小為2863bp的質(zhì)粒。這些數(shù)據(jù)都表明，雷氏普羅威登斯菌在細(xì)菌耐藥性，特別是多重耐藥性以及在細(xì)菌間耐藥性傳播方面具有重要意義。

目前國內(nèi)外對(duì)雷氏普羅威登斯菌的研究主要集中在人類及動(dòng)物臨床樣本、污水處理廠、船舶壓倉水等方面，對(duì)該菌在食物中存在情況的研究較少，也沒有在食品原材料及加工環(huán)節(jié)污染該菌的報(bào)道，同時(shí)尚未發(fā)現(xiàn)相對(duì)明確的動(dòng)物宿主和食源性載體。鑒于雷氏普羅威登斯菌在引起人類及動(dòng)物致病，以及其易產(chǎn)生多重耐藥性的特點(diǎn)，開展該菌在食品領(lǐng)域的存在情況調(diào)研具有十分重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

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Isolation and Identif cation of blaNDM-1-Negative Providencia rettgeri from Pigs

Wang Jianchang，Jiang Yanfen，Wang Jinfeng，Chen Zhimin，Li Jing
（Inspection and Quarantine Center，Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shijiazhuang，Hebei 050051）

To investigate the zoonotic pathogen-carrying situation of pigs imported from the United States，120 fresh

Providencia rettgeri；isolation；identification；blaNDM-1gene

S851.34

B

1005-944X（2015）04-0022-04

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目（201210128）；河北局自主科研項(xiàng)目（HE2013K030）

feces samples were taken from pigs imported from the United States for common bacterial pathogen isolation. One Providencia strain was isolated，named as HBA13. By means of different selective media culture，biochemical tests and homology analysis based on bacteria 16sRNA，HBA13 was identified to be Providencia rettgeri. Considering the importance of Providencia rettgeri in the drug resistance，the NDM-1 phenotype assay was made and the blaNDM-1gene was detected by PCR，resulting in blaNDM-1gene negative. The successful isolation of blaNDM-1negative Providencia rettgeri provided the basis for future research.