多壁碳納米管凈化－超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)同時測定牛奶中青霉素類藥物殘留

曹 慧，陳小珍，朱 巖，李祖光，祝 穎，鄭軍科

（1．浙江省質(zhì)量檢測科學(xué)研究院，浙江杭州 310030；2．浙江大學(xué)化學(xué)系，浙江杭州 310028；3．浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程與材料學(xué)院，浙江杭州 310014）

多壁碳納米管凈化－超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)同時測定牛奶中青霉素類藥物殘留

曹 慧1，2，陳小珍1，朱 巖2，李祖光3，祝 穎1，鄭軍科1

（1．浙江省質(zhì)量檢測科學(xué)研究院，浙江杭州 310030；2．浙江大學(xué)化學(xué)系，浙江杭州 310028；3．浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程與材料學(xué)院，浙江杭州 310014）

研究了多壁碳納米管凈化－超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)同時測定牛奶中的羥氨芐青霉素、青霉素V、氨芐青霉素、苯咪青霉素、甲氧苯青霉素、青霉素G、苯咪青霉素、鄰氯青霉素、乙氧萘青霉素和雙氯青霉素藥物殘留。樣品用乙腈沉淀蛋白，提取液用磷酸緩沖液稀釋后，經(jīng)改性的多壁碳納米管材料凈化，通過Waters C18色譜柱分離，以乙腈和10mmol／L乙酸銨（pH 4．5）溶液為流動相進行梯度洗脫，采用電噴霧－正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。10種青霉素藥物在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)的線性相關(guān)系數(shù)均大于0．99，方法的定量限在0．1～10．0μg／kg之間。在低、中、高3個濃度添加水平下，10種青霉素藥物的平均回收率為72．0％～110％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1．83％～9．33％之間。多壁碳納米管材料具有較好的凈化效果，該方法可以快速、準(zhǔn)確地測定牛奶中的青霉素類藥物殘留。

多壁碳納米管；固相萃取；超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－MS／MS）；牛奶；青霉素

青霉素是一類廣譜抗生素，具有消炎抗感染等作用，被廣泛應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)［1］。由于不合理使用、不遵守休藥期等原因，其殘留問題逐漸成為人們關(guān)注的社會焦點，并成為引起畜禽產(chǎn)品消費安全和食品貿(mào)易爭端的主要原因之一。

青霉素類藥物殘留的分析方法有微生物法、高效液相色譜法和液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法。微生物法和高效液相色譜法的基質(zhì)干擾嚴(yán)重，容易產(chǎn)生假陽性。超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－MS／MS）技術(shù)是利用液相色譜的高分離能力與質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度及豐富的結(jié)構(gòu)信息相結(jié)合的強有力的分析工具，以其操作簡便、準(zhǔn)確度和靈敏度高、選擇性強等優(yōu)點成為藥物殘留檢測的有效手段，是目前常用的檢測方法［2－5］。國家標(biāo)準(zhǔn)GB／T 21315—2007中關(guān)于青霉素的檢測不僅前處理復(fù)雜，且需要以固相萃取小柱凈化來消除雜質(zhì)干擾，由于商品化的固相萃取小柱價格昂貴，導(dǎo)致檢測成本較高，而且長時間的前處理操作致使部分穩(wěn)定性差的青霉素藥物回收率不理想。

多壁碳納米管（MWCNTs）是一種具有較強吸附性能的納米材料，一般由2～50層石墨片組成，直徑在幾到幾十納米之間，長度可達幾十甚至上百微米。由于其比表面積大，吸附能力強，對有機化合物、金屬離子和有機金屬化合物等具有較高的富集能力，可用作固相萃取吸附劑［6］。近年來，MWCNTs及其改性材料開始應(yīng)用于揮發(fā)性物質(zhì)［7］、農(nóng)藥［8－9］、獸藥［10－13］的吸附研究，并作為新型材料應(yīng)用于不同基質(zhì)的凈化［14－15］。

本工作利用改性后的MWCNTs固相萃取小柱凈化牛奶基質(zhì)，建立超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜同時測定牛奶中青霉素類藥物殘留的方法，采用內(nèi)標(biāo)法定量，旨在為日常牛奶的檢測提供方法參考和技術(shù)支持。

1 實驗部分

1．1 主要儀器與裝置

超高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀為XevoTMTQ－MS質(zhì)譜儀，配備AcquityTM超高效液相色譜：美國Waters公司產(chǎn)品，配有電噴霧電離接口（ESI）及Masslynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Milli－Q超純水器：美國Millipore公司產(chǎn)品；高速離心機：美國Thermo公司產(chǎn)品；氮氣吹干儀：天津市恒奧科技有限公司產(chǎn)品；渦旋混合器：太倉市華利達實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；固相萃取裝置：美國Waters公司產(chǎn)品。

1．2 主要材料與試劑

乙腈（色譜純）：德國Merck公司產(chǎn)品；甲酸（色譜純）：美國Tedia公司產(chǎn)品；磷酸氫二鉀（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；水為Milli－Q系統(tǒng)純化水；MWCNTs（純度大于97％，直徑40～60nm，長度5～15μm）：深圳市納米港有限公司產(chǎn)品。

羥氨芐青霉素（純度≥98．0％），青霉素V（純度≥98．8％），氨芐青霉素（純度≥99．0％），苯咪青霉素（純度≥99．8％），甲氧苯青霉素（純

度≥85．0％），青霉素G（純度≥99．6％），苯唑青霉素（純度≥92．0％），鄰氯青霉素（純度≥99．5％），乙氧萘青霉素（純度≥86．0％），雙氯青霉素（純度≥99．0％），青霉素G－D7（純度≥99．7％）標(biāo)準(zhǔn)品：均為德國Dr．Ehrenstorfer GmbH公司產(chǎn)品。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取10mg上述標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1g／L儲備液，密封儲存于－18℃冰箱中。分別吸取50μL 1g／L標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成5mg／L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用時稀釋成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，待測。

0．05mol／L磷酸緩沖溶液的配制：稱取8．7g磷酸氫二鉀，超純水溶解，稀釋至1 000mL，調(diào)節(jié)pH 8．5。

1．3 實驗條件

1．3．1 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity BEH C18柱（2．1mm×100mm×1．7μm）；柱溫35℃；樣品溫度25℃；進樣體積5μL；流速0．2mL／min；流動相：pH 4．5的10mmol／L乙酸銨溶液（A），乙腈（B）；梯度洗脫程序：0～1．5min、20％B，1．5～2min、20％～40％B，2～7．2min、40％B，7．2～7．6min、40％～95％B，7．6～9．5min、95％B，9．5～10min、95％～20％B。

1．3．2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，毛細(xì)管電壓2．50kV，離子源溫度150℃，脫溶劑氣溫度500℃，脫溶劑氣流量1 000L／h。青霉素類藥物的質(zhì)譜參數(shù)列于表1。

表1 青霉素類藥物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 The mass spectrometry conditions of penicillins

1．4 多壁碳納米管材料的處理

稱取2g多壁碳納米管粉末于250mL單口燒瓶中，分別加入50mL濃硫酸和100mL濃硝酸，超聲振蕩1h，靜置后除去上層酸液，反復(fù)水洗至中性，烘箱烘干后研磨成細(xì)粉末。稱取150mg多壁碳納米管細(xì)粉末于6mL固相萃取空管中，墊上柱篩板壓實，使用前用5mL甲醇、5mL水和5mL磷酸緩沖液活化。

1．5 前處理方法

稱取5g牛奶于50mL離心管中，加入5mL乙腈，渦旋2min，混勻，離心后將上清液轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用0．05mol／L磷酸緩沖液定容，混勻后轉(zhuǎn)移至MWCNTs固相萃取小柱上，用10mL水淋洗，抽至近干后，用5．0mL乙腈洗脫，整個過程控制流速小于1mL／min，洗脫液于45℃下氮吹至干，加入1mL乙腈水溶液（2∶8，V／V）溶解，渦旋1min，過0．22μm微孔濾膜后，待UPLCMS／MS分析。

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜條件的優(yōu)化

選擇高效的色譜柱是多組分分析的前提條

件。本實驗選用Waters公司的UPLC BEH C18（2．1mm×100mm×1．7μm）色譜柱分離青霉素類藥物，此色譜柱對10種青霉素類藥物具有較強的保留，各色譜峰能得到有效地分離，干擾較小。由于乙腈的離子化效率優(yōu)于甲醇，本實驗采用乙腈作為強洗脫流動相，用甲酸調(diào)節(jié)流動相溶液為pH 4．5，這可以有效改善峰形，提高離子化效率，且避免部分青霉素產(chǎn)生雙峰，其總離子流圖示于圖1。

圖1 10種青霉素類藥物的總離子流圖Fig．1 Total ion chromatogram of 10 penicillins

2．2 前處理方法的優(yōu)化

本實驗分別采用乙腈、甲醇、三氯乙酸、醋酸鋅與亞鐵氰化鉀溶液（1∶1，V／V）沉淀牛奶中的蛋白質(zhì)，比較其提取效果。雖然醋酸鋅和亞鐵氰化鉀沉淀蛋白的效果很好，但部分青霉素類藥物被沉淀物包裹，嚴(yán)重影響回收率。由于青霉素類藥物在酸性條件下穩(wěn)定性較差，故三氯乙酸不適合作為提取溶液。乙腈沉淀蛋白的能力較甲醇強，沉淀效果好，且易于分離，故采用乙腈作為提取溶劑。

牛奶成分復(fù)雜，通常采用固相萃取方式進行凈化處理，由于提取溶劑極性強，直接過柱凈化藥物不能被保留，因此本實驗分別考察了濃縮提取液后凈化和稀釋提取液后凈化兩種方式。結(jié)果表明：由于提取液中含有大量水，濃縮速度慢，部分目標(biāo)化合物損失率大，而采用0．05mol／L磷酸緩沖溶液稀釋提取液，使乙腈含量控制在5％左右，目標(biāo)化合物在凈化柱上都能得到保留。因此，本實驗選擇將提取液稀釋后過柱。

2．3 凈化條件的選擇

多壁碳納米管填料是影響凈化效果的直接因素，為了保證萃取小柱填料的均勻性，減少萃取柱中氣泡的產(chǎn)生，本實驗采用濕法裝柱。與干法裝柱相比，多壁碳納米管填料更緊密結(jié)實，凈化效果較好。分別稱取30、60、150mg多壁碳納米管，以濕法方式裝柱，考察不同柱容量的凈化效果。結(jié)果表明：奶粉基質(zhì)成分復(fù)雜，60mg填充量的除雜效果優(yōu)于30mg填充量，且60mg填充量已完全滿足分析的要求，故本實驗采用60mg多壁碳納米管以濕法填充萃取柱。

2．4 方法學(xué)驗證

2．4．1 線性范圍和定量限 本實驗采用空白基質(zhì)溶液配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各分析物的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，10種青霉素類藥物在各自的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，各藥物的相關(guān)系數(shù)r均在0．99以上，以10倍信噪比（S／N＝10）計算10種青霉素類藥物的最低定量限，結(jié)果列于表2。

表2 青霉素類藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限Table 2 The linear equation，correlation coefficient and LOQs of penicillins

2．4．2 回收率和精密度 在陰性的牛奶樣品中分別添加低、中、高3種不同濃度水平（青霉素V和甲氧苯青霉素的濃度分別為1、5、10μg／kg，其余青霉素的濃度分別為10、50、100μg／kg）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度做3次平行實驗，按1．5方法進行預(yù)處理，青霉素類藥物的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差列于表3。

由表3可知，青霉素類藥物的回收率為72．0％～110％，精密度為1．83％～9．33％，能滿足日常檢測的要求。

表3 青霉素類藥物的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations of penicillins

2．5 國家標(biāo)準(zhǔn)方法比較

在陰性的牛奶樣品中添加青霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（青霉素V和甲氧苯青霉素的濃度為5μg／kg，其余青霉素的濃度為50μg／kg），分別進行3次平行實驗，按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB／T 21315—2007中的方法進行前處理，10種青霉素類藥物的回收率為61．4％～84．1％，精密度為2．48％～12．4％。

國家標(biāo)準(zhǔn)所采用的前處理方法為乙腈水溶液提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除高濃度的乙腈，但存在速度較慢，部分青霉素穩(wěn)定性差，在前處理過程中容易損失和降解，造成回收率較低等問題。而本實驗的前處理過程較國家標(biāo)準(zhǔn)簡單，并采用內(nèi)標(biāo)法進行定量，實驗結(jié)果更準(zhǔn)確。此外，國家標(biāo)準(zhǔn)采用HLB固相萃取小柱對樣品進行凈化，價格昂貴、檢測成本高。因此，采用改性后的多壁碳納米管進行凈化，不僅前處理簡單，而且價格低廉，在一定程度上降低了檢測成本。

3 結(jié)論

本實驗建立了改性多壁碳納米管固相萃取技術(shù)凈化牛奶樣品中青霉素類藥物的分析方法，用酸將多壁碳納米管材料表面羧酸化，處理后的材料純度高，在溶液中分散均勻，凈化效果更好。該方法的回收率為72．0％～110％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1．83％～9．33％。與國家標(biāo)準(zhǔn)GB／T 21315—2007相比，該方法具有前處理簡單、操作成本低、回收率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，適合日常樣品的檢測分析。

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Determination of Penicillin Residues in Milk by Multiwalled Carbon Nanotubes Cleaning and UPLC－MS／MS

CAO Hui1，2，CHEN Xiao－zhen1，ZHU Yan2，LI Zu－guang3，ZHU Ying1，ZHENG Jun－ke1

（1．Zhejiang Institute of Quality Inspection Science，Hangzhou310030，China；2．Department of Chemistry，Zhejiang University，Hangzhou310028，China；3．College of Chemical Engineering and Materials Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou310014，China）

A method was established for determining penicillin residues in milk by ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry（UPLC－MS／MS）and multiwalled carbon nanotubes cleaning．The samples were extracted by acetonitrile and diluted by phosphate buffer solution，a step for clean－up and proconcentration of the analytes by solid phase extraction cartridge packed with multi－walled carbon nanotubes

multiwalled carbon nanotubes（MWCNTs）；solid phase extraction；ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry（UPLC－MS／MS）；milk；penicillin

O 657．63

A

1004－2997（2015）01－0023－06

10．7538／zpxb．youxian．2014．0043

2014－01－05；

2014－04－07

科技部國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項（2012YQ09022903）；浙江省科技廳錢江人才科技計劃項目（2010R10044）；浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督系統(tǒng)科研計劃項目（20110203）資助

曹 慧（1980—），女（漢族），浙江湖州人，高級工程師，從事色譜和質(zhì)譜檢測與科研工作。E－mail：ch＿zj＿cn＠163．com

陳小珍（1960—），女（漢族），浙江杭州人，教授級高級工程師，從事食品檢測與研究工作。E－mail：cxz730＠163．com

時間：2014－08－20；

http：∥www．cnki．net／kcms／doi／10．7538／zpxb．youxian．2014．0043．html

（MWCNTs）．The target analytes were separated by Waters C18column with gradient elution using acetonitrile and 10mmol／L ammonium acetate（pH 4．5）as mobile phases．The analytes were detected by tandem quadrupole mass spectrometry after positive electrospray ionization by multiple reaction monitoring（MRM）．Internal standard method with matrix was used to determine the results．The correlation coefficient is greater than 0．99for each drugs．The limits of quantitation（LOQ）are 0．1－10．0μg／kg．The mean recoveries at the three spiked levels are 72．0％－110％．The relative standard deviations（RSDs）are 1．83％－9．33％．The results indicated that using multi－walled carbon nanotubes as solid phase extraction adsorbent is efficient for the purification．The simplicity，sensitivity and good precision of the method made it is well suitable for determination of penicillin residues in milk．