淺表血栓性靜脈炎管壁的細(xì)胞凋亡水平變化*

孫延平，吳洪娟，王磊，徐永波，唐金元，李坤，張晶晶，李虎，褚海波

（1.解放軍第89醫(yī)院普外中心，山東 濰坊 261021；2.濰坊醫(yī)學(xué)院電鏡室，山東 濰坊 261042；3.濰坊醫(yī)學(xué)院研究生部，山東 濰坊 261042）

·臨床論著·

淺表血栓性靜脈炎管壁的細(xì)胞凋亡水平變化*

孫延平1，吳洪娟2，王磊3，徐永波1，唐金元1，李坤1，張晶晶1，李虎1，褚海波1

（1.解放軍第89醫(yī)院普外中心，山東 濰坊 261021；2.濰坊醫(yī)學(xué)院電鏡室，山東 濰坊 261042；3.濰坊醫(yī)學(xué)院研究生部，山東 濰坊 261042）

目的檢測(cè)淺表血栓性靜脈炎管壁的細(xì)胞凋亡水平變化，探討細(xì)胞凋亡與靜脈管壁擴(kuò)張的相關(guān)性。方法收集大隱靜脈曲張標(biāo)本50例，其中淺表血栓性靜脈炎（血栓組）和單純靜脈曲張標(biāo)本各25例（曲張組）。正常大隱靜脈標(biāo)本15例（對(duì)照組）。采用末端標(biāo)記法（TUNEL）、免疫熒光法、免疫組織化學(xué)法及電鏡，觀察細(xì)胞凋亡水平和超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果血栓組和曲張組管壁內(nèi)膜和中膜凋亡細(xì)胞比率明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；血栓組和曲張組管壁Bcl-xl陽(yáng)性蛋白呈高表達(dá)，對(duì)照組管壁Bax陽(yáng)性蛋白呈高表達(dá)。電鏡顯示，3組凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征為線粒體嵴模糊、髓樣變、核染色質(zhì)邊集。結(jié)論淺表血栓性靜脈炎和曲張靜脈通過(guò)內(nèi)源性通道引發(fā)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)異常，導(dǎo)致靜脈管壁擴(kuò)張、增厚，推測(cè)其可能是靜脈曲張的發(fā)病機(jī)制之一。

淺表血栓性靜脈炎；靜脈曲張；隱靜脈；細(xì)胞凋亡

研究表明，下肢靜脈曲張管壁的改變先于瓣膜功能不全[1]。血管重塑理論的提出為研究靜脈曲張的病理發(fā)生、發(fā)展過(guò)程奠定理論基礎(chǔ)[2]。細(xì)胞凋亡參與曲張靜脈管壁重塑過(guò)程，兩者關(guān)系密切。檢測(cè)靜脈管壁細(xì)胞凋亡的方法諸多，如細(xì)胞核凋亡、細(xì)胞蛋白凋亡、酶的裂解及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化，但曲張靜脈管壁細(xì)胞凋亡的結(jié)果尚未一致（增加或減少）[3-9]。本研究通過(guò)末端標(biāo)記法（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）、免疫熒光染色法、Bax和Bcl-xl免疫組織化學(xué)法以及電鏡觀察、檢測(cè)靜脈曲張合并淺表血栓性靜脈炎、單純靜脈曲張以及正常大隱靜脈管壁細(xì)胞凋亡水平，探討細(xì)胞凋亡與靜脈管壁擴(kuò)張的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2012年1月-2014年8月在本院行高位結(jié)扎剝脫加旋切治療的大隱靜脈曲張患者50例，分為淺表血栓性靜脈炎（血栓組）和單純靜脈曲張（曲張組），每組25例。其中，血栓組男性14例，女性11例；平均年齡35歲（28～45歲）。曲張組男性13例，女性12例；平均年齡36歲（27～46歲）。對(duì)照組為創(chuàng)傷行截肢術(shù)而大隱靜脈無(wú)損傷患者15例，男性9例，女性6例；平均年齡32歲（20～39歲）。術(shù)前50例患者經(jīng)彩色多普勒超聲檢查，確診為原發(fā)性大隱靜脈曲張。血栓組為慢性血栓性靜脈炎（血栓形成時(shí)間＞30 d），按臨床、病因、解剖、病理生理分類為C2、C3。排除標(biāo)準(zhǔn)：下肢嚴(yán)重水腫，靜脈曲張伴皮膚改變，急性或亞急性血栓性靜脈炎（血栓形成時(shí)間＜14或30 d），非血栓性靜脈炎，動(dòng)脈疾病及糖尿病患者。

1.2實(shí)驗(yàn)方法與試劑

1.2.1標(biāo)本收集和處理術(shù)中取膝關(guān)節(jié)下方大隱靜脈主干標(biāo)本3～4 mm，10%福爾馬林溶液固定，常規(guī)脫水、包埋，4μm厚連續(xù)切片，備1張行蘇木精-伊紅染色。每個(gè)標(biāo)本切片15份，每組5份分別行TUNEL染色、免疫熒光及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)。獲取新鮮標(biāo)本1 mm3，置3%戊二醛中固定24～48 h，常規(guī)脫水、包埋、烘干。采用超薄切片，厚70 nm，切片經(jīng)水洗后放入醋酸鈾飽和水溶液浸泡，雙蒸水清洗后放入枸櫞酸鉛溶液浸泡，最后用雙蒸水清洗干凈。采用日本日立公司生產(chǎn)的H-7500型透射電鏡觀察內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。

1.2.2TUNEL染色、免疫熒光及免疫組織化學(xué)法具體方法分別參考DUCASSE[9]和HEISING等[10]的研究。在400倍光鏡下對(duì)每張切片選取5個(gè)視野進(jìn)行組織學(xué)分析。依據(jù)核染色強(qiáng)度、密度及染色質(zhì)形態(tài)確定凋亡細(xì)胞的免疫組織化學(xué)表達(dá)。結(jié)果判斷由兩位病理醫(yī)師采用雙盲法讀取。采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析處理圖像，計(jì)算每個(gè)高倍視野中管壁內(nèi)膜和中膜凋亡的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。取同一標(biāo)本5個(gè)視野中靜脈管壁內(nèi)膜和中膜測(cè)量值凋亡的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)之和，計(jì)算平均數(shù)，得出同一標(biāo)本凋亡陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)。細(xì)胞凋亡率（%）=每個(gè)高倍視野中凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。羊血清由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，微波緩沖液自配，試劑由北京化工廠提供，Roche細(xì)胞凋亡試劑由瑞士羅氏生物科技公司提供，Bax和Bcl-xl試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1靜脈管壁凋亡細(xì)胞分布

TUNEL法和免疫熒光法結(jié)果一致。血栓組和曲張組管壁內(nèi)膜和中膜偶見單個(gè)的凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞在兩組的分布基本相同（見圖1A、B、D、E）；對(duì)照組靜脈管壁內(nèi)膜和中膜可見較多凋亡細(xì)胞，以內(nèi)膜和中膜內(nèi)層明顯（見圖1C、F）。

2.2靜脈管壁凋亡細(xì)胞比率比較

血栓組和曲張組管壁內(nèi)膜和中膜的凋亡細(xì)胞比率明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；血栓組與曲張組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；3組內(nèi)膜、中膜的凋亡細(xì)胞比率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見附表。

2.3靜脈管壁凋亡蛋白的陽(yáng)性表達(dá)分布

血栓組與曲張組管壁內(nèi)膜和中膜可見散在分布的Bax凋亡蛋白陽(yáng)性表達(dá)，較多的Bcl-xl凋亡蛋白陽(yáng)性表達(dá)（見圖2A、B、D、E）；對(duì)照組的內(nèi)膜和中膜中，Bax和Bcl-xl凋亡蛋白陽(yáng)性表達(dá)的分布與血栓組和曲張組相反（見圖2C、F）。

2.4靜脈管壁凋亡蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率比較

血栓組和曲張組管壁的內(nèi)膜和中膜中，Bax凋亡蛋白陽(yáng)性表達(dá)率減少，Bcl-xl凋亡蛋白陽(yáng)性表達(dá)率增加；對(duì)照組管壁的內(nèi)膜和中膜中，Bax凋亡蛋白陽(yáng)性表達(dá)率增加，Bcl-xl凋亡蛋白陽(yáng)性表達(dá)率減少。見圖3。

圖1 靜脈管壁TUNEL和免疫熒光染色法（×400，bar=20μm）

附表3組靜脈管壁內(nèi)膜和中膜的凋亡細(xì)胞比率比較（%±s）

附表3組靜脈管壁內(nèi)膜和中膜的凋亡細(xì)胞比率比較（%±s）

組別內(nèi)膜中膜t值P值凋亡細(xì)胞比率凋亡細(xì)胞比率血栓組（n=25）2.60±0.872.80±0.880.660.515曲張組（n=25）2.80±1.222.88±1.050.250.860對(duì)照組（n=15）12.67±2.2911.60±1.501.510.143

圖2 靜脈管壁Bcl-xl和Bax免疫組織化學(xué)法（×400，bar=20μm）

2.5靜脈管壁凋亡細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化

3組靜脈管壁內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）和平滑肌細(xì)胞（smooth muscle cells，SMCs）凋亡形態(tài)學(xué)特征為線粒體模糊、嵴斷裂、髓樣變、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增寬、脫顆粒、核染色質(zhì)邊集（見圖4A～C和E～G）。正常形態(tài)學(xué)特征為線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核染色質(zhì)正常（見圖4D、H）。

圖3 靜脈管壁Bcl-xl和Bax凋亡蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率

圖4 靜脈管壁ECs和SMCs的超微結(jié)構(gòu)變化

3 討論

在多細(xì)胞生物體中，細(xì)胞的增殖與死亡平衡是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要環(huán)節(jié)[11]。細(xì)胞凋亡是一種生理性、程序性的細(xì)胞死亡方式。細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特征是核質(zhì)濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解成180～200 bp片段，胞膜結(jié)構(gòu)仍然完整，最終可將凋亡細(xì)胞遺骸分割包裹為幾個(gè)凋亡小體[12]。研究表明，細(xì)胞凋亡失調(diào)與靜脈疾病的病理變化密切相關(guān)[13]。細(xì)胞凋亡包括內(nèi)源性和外源性兩條通道。內(nèi)源性通道又稱線粒體通道，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡啟動(dòng)蛋白（Bax或Bcl-2）及半胱天冬酶（Caspase）刺激線粒體釋放細(xì)胞色素C進(jìn)入胞漿與凋亡蛋白酶活化因子-1（apoptotic protease activating factor 1，APAF-1）結(jié)合，引發(fā)細(xì)胞凋亡。外源性通道又稱跨膜通道，在細(xì)胞凋亡信號(hào)的刺激下，F(xiàn)asl和腫瘤壞死因子-α作用于相應(yīng)的受體，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14-16]。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡下調(diào)，縮短細(xì)胞周期，引起靜脈壁的平滑肌細(xì)胞過(guò)度增生，由此引發(fā)靜脈管壁重塑[4，17]。當(dāng)Bax基因蛋白下降時(shí)，平滑肌細(xì)胞凋亡下調(diào)，曲張靜脈管壁細(xì)胞凋亡明顯低于正常靜脈[3]。正常情況下，一氧化氮和γ-干擾素能促進(jìn)靜脈管壁的細(xì)胞凋亡。組織內(nèi)存在高鐵離子時(shí)，T細(xì)胞增殖會(huì)替代細(xì)胞凋亡[18]?？梢娗鷱堨o脈管壁細(xì)胞凋亡使內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞代謝失衡，內(nèi)源性凋亡通道抑制，出現(xiàn)細(xì)胞堆積、老化、結(jié)構(gòu)異常，管壁的成分與結(jié)構(gòu)發(fā)生相應(yīng)改變。

關(guān)于曲張靜脈管壁細(xì)胞凋亡的文獻(xiàn)已有報(bào)道，但結(jié)果不一，各持己見。DUCASSE等[9]研究表明，曲張靜脈管壁結(jié)構(gòu)紊亂，其膠原纖維和彈性纖維比例失調(diào)。TUNEL染色顯示，中膜細(xì)胞凋亡明顯減少。在正常靜脈中，過(guò)氧化物酶、Bax和Caspase-9凋亡蛋白表達(dá)明顯降低。ASCHER等[3]研究發(fā)現(xiàn)，曲張組Bax凋亡蛋白呈低表達(dá)，正常組Bcl-x凋亡蛋白呈高表達(dá)。曲張組內(nèi)膜和中膜聚合酶呈低表達(dá)，外膜不表達(dá)；正常組聚合酶則呈高表達(dá)，結(jié)果表明，在靜脈高壓和缺氧條件下，控制細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性通道失調(diào)，導(dǎo)致靜脈壁擴(kuò)張和增厚。有學(xué)者認(rèn)為，細(xì)胞凋亡與年齡有關(guān)。＞50歲患者靜脈管壁內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞凋亡明顯增多，這可能與其他信號(hào)通道開放有關(guān)[19-20]。FILIS等[6]則發(fā)現(xiàn)，曲張靜脈管壁Bax、Caspase-3、Bcl-xl、Bcl-xs及Ki-67表達(dá)升高，細(xì)胞凋亡增多，遠(yuǎn)端主干比近端主干更明顯。由此可見，細(xì)胞凋亡與靜脈管壁重塑密切相關(guān)，并受諸多因素影響。

本實(shí)驗(yàn)行TUNEL染色和免疫熒光檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，血栓組和曲張組管壁（內(nèi)膜和中膜）中可見散在的凋亡細(xì)胞，其分布基本相同。對(duì)照組管壁（內(nèi)膜和中膜）則見較多的凋亡細(xì)胞。血栓組和曲張組管壁Bax凋亡蛋白陽(yáng)性表達(dá)減少，Bcl-xl凋亡蛋白陽(yáng)性表達(dá)增加；對(duì)照組則與血栓組和曲張組相反。定量分析表明，血栓組和曲張組管壁（內(nèi)膜和中膜）凋亡細(xì)胞比率明顯低于對(duì)照組。電鏡顯示，3組靜脈管壁存在ECs和SMCs凋亡，其形態(tài)學(xué)特征為線粒體模糊、嵴斷裂、髓樣變、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增寬、脫顆粒、核染色質(zhì)邊集。本研究結(jié)果與DUEASSE等[21]報(bào)道一致。結(jié)果提示，靜脈高壓和缺氧可能導(dǎo)致靜脈管壁內(nèi)源性通道細(xì)胞凋亡失調(diào)，以降低細(xì)胞的更新[4，22-23]。一方面組織缺氧會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激，增加抗凋亡蛋白（Bcl-2），減少Caspase-9裂解作用及線粒體外膜的滲透性，由此阻斷內(nèi)源性線粒體通道[24-25]；另一方面Fas和Caspase-8激活，導(dǎo)致跨膜通道受阻[26-27]。本研究結(jié)果證實(shí)，血栓組和曲張組管壁細(xì)胞凋亡與靜脈管壁結(jié)構(gòu)改變關(guān)系密切，該結(jié)論符合筆者前期的研究結(jié)果（光鏡下血栓組和曲張組內(nèi)皮細(xì)胞異常或不連續(xù)，平滑肌細(xì)胞肥大或增生，膠原纖維大量增多，滋養(yǎng)血管增多和異常。電鏡下內(nèi)皮細(xì)胞變性或缺失，平滑肌細(xì)胞去分化由收縮型轉(zhuǎn)為分泌型）[28]。筆者認(rèn)為，靜脈管壁組織學(xué)和形態(tài)學(xué)改變是細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)平衡基礎(chǔ)。凋亡的上調(diào)和下調(diào)是組織本身一種代償性、生理性自我保護(hù)。血栓性靜脈炎和曲張靜脈管壁細(xì)胞凋亡水平明顯下降，提示靜脈管壁內(nèi)源性凋亡通道抑制，推測(cè)靜脈高壓可能是影響細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)因素之一。本研究存在一定的局限性，觀察者間和觀察者內(nèi)的差異性及人口學(xué)因素均可影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另外，單中心的結(jié)果有待多中心研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

致敬本課題得到濰坊醫(yī)學(xué)院病理教研室張寶剛教授和電鏡室張圣明教授的大力幫助，在此表示衷心的感謝！

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（童穎丹 編輯）

Changes in levels of apoptosis in walls of superficial thrombophlebitis*

Yan－ping SUN1,Hong－juan WU2,Lei WANG3,Yong－bo XU1,Jin－yuan TANG1, Kun LI1,Jing－jing ZHANG1,Hu LI1,Hai－bo CHU1
(1.Department of General Surgery,the 89th Hospital of PLA,Weifang,Shandong 261021, P.R.China;2.Department of Electron Microscope,3.Department of Postgraduate, Weifang Medical College,Weifang,Shandong 261042,P.R.China)

【Objective】To investigate the relationship between apoptosis and great saphenous varicose veins by detecting the changes in levels of apoptosis in venous walls.【Methods】Totally 50 specimens of great saphenous veins[25 specimens with superficial thrombophlebitis(thrombosis group)and 25 specimens of simple varicose veins(varicose group)]as well as 15 specimens of normal great saphenous veins(control group)were collected.Apoptosis as well as Bax and Bcl－xl protein expressions were evaluated by the TUNEL assay and immunofluorescence staining.The morphology of apoptotic cells was observed with electromicroscope.【Results】In the thrombosis and varicose groups,the apoptotic cell rates in the venous walls(intima and media)were significantly lower than those in the corresponding regions in the control group(P＜0.01).The high expression of Bcl－xl protein was detected in the thrombosis and varicose groups,while the high expression of Bax protein was observed in the control group.Electromicroscopic observation confirmed that endothelial and smooth muscle cells in the three groups exhibited apoptotic morphologic features,such as fuzzy mitochondrial cristae,medullary changes and margination of the nuclear chromatin.【Conclusions】Our results showed that dysregulation of apoptosis via the intrinsic pathways in varicose veins leads to the downregulation of apoptosis,which results in wall thickening and an increase in the lumen.This may be one of the mechanisms of venous diseases.

superficial thrombophlebitis;varicose vein;saphenous vein;apoptosis

R543.6；Q253

A

1005-8982（2015）32-0049-006

2015-08-12

濰坊市科技發(fā)展計(jì)劃（No：2014zj1058）；解放軍第89醫(yī)院科研資助基金（No：yz2013890201）

褚海波，E-mail：haibochuwf@163.com；Tel：0536-8439081；13863679579