Ion Torrent PGMTM系統(tǒng)檢測(cè)孕婦血漿中胎兒游離DNA

劉亞楠，趙雪瑩，平原，徐慶文，黃江平，鄒凱南，周懷谷

（1.上海市公安局物證鑒定中心法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海市現(xiàn)場(chǎng)物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200083；2.上海市刑事科學(xué)技術(shù)研究院，上海 200083）

Ion Torrent PGMTM系統(tǒng)檢測(cè)孕婦血漿中胎兒游離DNA

劉亞楠1，趙雪瑩2，平原1，徐慶文1，黃江平1，鄒凱南1，周懷谷1

（1.上海市公安局物證鑒定中心法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海市現(xiàn)場(chǎng)物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200083；2.上海市刑事科學(xué)技術(shù)研究院，上海 200083）

目的探討Ion Torrent PGMTM系統(tǒng)用于孕婦外周血血漿中胎兒游離DNA的Y-STR檢測(cè)的可行性。方法采集8例孕晚期（38周）和8例孕中期（12周）的無(wú)關(guān)孕婦外周血血漿，提取胎兒游離DNA，對(duì)DYS390、DYS391、DYS393、DYS438、DYS437、DYS456、DYS635共7個(gè)基因座進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，在Ion Torrent PGMTM系統(tǒng)進(jìn)行Y-STR測(cè)序分析和毛細(xì)管電泳分析，并將兩者結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果在分娩男性胎兒的孕晚期及中期孕婦血漿中均檢測(cè)到Y(jié)-STR片段，測(cè)序檢測(cè)得出的基因座比毛細(xì)管電泳檢測(cè)得出的多，且與分娩胎兒的Y-STR基因型相一致。結(jié)論Ion Torrent PGMTM系統(tǒng)用于孕婦外周血血漿胎兒游離DNA的Y-STR檢測(cè)，具有高靈敏度、高通量的特點(diǎn)，且有較好的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。

法醫(yī)遺傳學(xué)；Y染色體；孕婦；胎兒；短串聯(lián)重復(fù)序列；Ion Torrent PGMTM系統(tǒng)

在各類刑事案件中，會(huì)遇到因?yàn)閺?qiáng)奸致孕而涉及需要在妊娠期間進(jìn)行親子鑒定的案件。在實(shí)際偵查辦案中，一方面，被害人希望及時(shí)終止妊娠，另一方面，為了確保獲得胎兒的遺傳信息以便確認(rèn)犯罪嫌疑人，偵查部門(mén)希望受害者能在孕齡12周后流產(chǎn)取證。

自上世紀(jì)70年代第一代測(cè)序技術(shù)的問(wèn)世，DNA測(cè)序技術(shù)發(fā)展突飛猛進(jìn)，到2010年美國(guó)Thermo Fisher公司推出了一款個(gè)人化操作基因組測(cè)序儀——Ion Torrent Personal Genomic MachineTM（Ion Torrent PGMTM），該測(cè)序儀是基于半導(dǎo)體芯片的新一代測(cè)序技術(shù)，單次反應(yīng)可檢測(cè)幾十至幾百萬(wàn)條DNA分子，具有反應(yīng)速度快、操作簡(jiǎn)便、數(shù)據(jù)質(zhì)量較高等優(yōu)點(diǎn)。本研究旨在利用Ion Torrent PGMTM測(cè)序系統(tǒng)，對(duì)孕晚期和孕中期孕婦外周血中胎兒游離DNA的Y-STR基因型進(jìn)行檢測(cè)，比較

基于傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳的熒光檢測(cè)方法和新一代測(cè)序方法在無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前親子鑒定中的優(yōu)劣，探索孕婦外周血在強(qiáng)奸致孕案件中的應(yīng)用價(jià)值，建立孕婦外周血胎兒游離DNA的Ion Torrent檢測(cè)方法，為強(qiáng)奸致孕案件中親子鑒定技術(shù)的發(fā)展提供基礎(chǔ)性研究和新手段。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源

按照知情同意原則，采集8例孕晚期（38周）和8例孕中期（12周）孕婦外周血樣本各2mL（EDTA抗凝），并采集其分娩后胎兒的臍帶組織作為對(duì)照。

1.2 DNA提取及分組

實(shí)驗(yàn)組：在4℃條件下，取8例孕晚期孕婦和8例孕中期孕婦外周血樣本各2mL，1600×g離心10min，吸取600μL上清液。在4℃條件下，將吸取的600μL上清液，16000×g離心10min，取上清液。應(yīng)用血漿、血清游離核酸提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取孕婦外周血游離DNA。

對(duì)照組：取8例孕晚期和8例孕中期孕婦分娩后胎兒臍帶組織各1cm×1cm。應(yīng)用EZ1 DNA Investigator提取試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司）提取臍帶組織DNA。

1.3 聚合酶鏈反應(yīng)

1.3.1 引物

選取Y-STR基因座DYS390、DYS391、DYS393、DYS438、DYS437、DYS456、DYS635，以Primer 3 Plus軟件針對(duì)每一基因座設(shè)計(jì)引物。引物序列見(jiàn)表1。

表1 Y染色體STR基因座的引物序列

1.3.2 PCR擴(kuò)增

實(shí)驗(yàn)組：應(yīng)用GlobalFilerTM試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher公司）對(duì)8例孕晚期和8例孕中期孕婦外周血DNA樣本進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，反應(yīng)體系均為15 μL，引物混合液0.17mol/L，反應(yīng)混合液20μL。反應(yīng)條件均為：95℃1 min；94℃3 s，60℃30 s，共32個(gè)循環(huán)；60℃8min，4℃保存。

對(duì)照組：應(yīng)用Yfiler誖PCR擴(kuò)增試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher公司）對(duì)8例孕晚期和8例孕中期孕婦分娩后胎兒臍帶組織DNA樣本進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)液10 μL，引物混合液5 μL，金牌酶0.5μL。反應(yīng)條件：95℃11min；94℃1min，61℃1min，72℃1 min，共35個(gè)循環(huán)；60℃80 min，4℃保存。

1.4 文庫(kù)構(gòu)建

應(yīng)用Qubit dsDNA HS Assay試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher公司）在Qubit 2.0定量平臺(tái)（美國(guó)Thermo Fisher公司）測(cè)定PCR產(chǎn)物濃度。采用Ion Plus Fragment Library試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher公司）和Ion Xpress Barcode Adapter試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher公司），在片段兩端分別連接有標(biāo)簽序列（Barcode）的接頭和測(cè)序接頭構(gòu)建文庫(kù)，并純化。

1.5 模板制備和測(cè)序

模板制備采用Ion PGMTMTemplate OT2 400試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher公司），利用Ion OneTouchTM2.0系統(tǒng)進(jìn)行乳濁液PCR以及產(chǎn)物富集。

測(cè)序采用Ion PGMTMSequencing 400試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher公司），選擇Ion 316 v2芯片，利用Ion Torrent PGMTM系統(tǒng)完成測(cè)序反應(yīng)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序數(shù)據(jù)使用Ion Torrent PGMTM系統(tǒng)配套分析設(shè)備Torrent Suite（4.0）進(jìn)行分析。根據(jù)Barcode和引物序列對(duì)有效測(cè)序片段進(jìn)行拆分及序列比對(duì)，通過(guò)聚類分析讀取STR核心序列，STR基因型的命名參考STRBase[1]。毛細(xì)管電泳數(shù)據(jù)采用GeneMapper軟件進(jìn)行分析。本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)組的孕婦外周血樣本和對(duì)照組的胎兒臍帶組織樣本分別讀取Y-STR核心序列并進(jìn)行一一比對(duì)，以此檢驗(yàn)Ion Torrent PGMTM系統(tǒng)用于孕婦外周血胎兒游離DNA Y-STR檢測(cè)的可靠性。

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)序結(jié)果

本研究采用Ion Torrent PGMTM系統(tǒng)對(duì)孕中期和孕晚期樣本進(jìn)行測(cè)序，以其中一塊Ion 316 v2芯片為例，結(jié)果如圖1。芯片中有效區(qū)域達(dá)87%，其中連接文庫(kù)為100%。除去28%的多克隆、35%的低質(zhì)量文庫(kù)和0%的測(cè)試片段，最終有效文庫(kù)為47%，共2.5×106個(gè)讀取片段，片段平均讀長(zhǎng)為156bp。產(chǎn)生的原始測(cè)序數(shù)據(jù)總量為378Mb。

圖1 Ion Torrent PGMTM系統(tǒng)的測(cè)序結(jié)果

2.2 測(cè)序結(jié)果遺傳學(xué)分析

8 名孕晚期孕婦和8名孕中期孕婦外周血血漿樣本中，8例孕晚期和5例孕中期均檢測(cè)出Y-STR等位基因，3例孕中期未檢測(cè)出Y-STR等位基因。胎兒出生后證實(shí)8例孕晚期孕婦的胎兒均為男胎，8例孕中期孕婦的胎兒中5例為男胎，3例為女胎（表2）。

7 個(gè)基因座擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度均為220 bp以下，以DYS393基因座擴(kuò)增產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度最?。s117bp），擴(kuò)增效果好，檢出率最高；以DYS437基因座產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度最大（約213bp），擴(kuò)增效果好，檢出率較低。據(jù)文獻(xiàn)[2]報(bào)道，分娩男嬰的孕婦外周血血漿樣本中游離DNA含量在妊娠中期平均為36基因組當(dāng)量/mL，在妊娠晚期為176基因組當(dāng)量/mL。受胎兒結(jié)構(gòu)完整性的限制，即當(dāng)胎兒細(xì)胞經(jīng)過(guò)胎盤(pán)屏障，細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)被母體的免疫系統(tǒng)所破壞，胎兒的有核紅細(xì)胞破裂，DNA進(jìn)入孕婦血液循環(huán)[3]，這可能是片段大的等位基因擴(kuò)增效果差的原因之一。

本實(shí)驗(yàn)選取了7個(gè)Y-STR基因座進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用Ion Torrent PGMTM系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序，并選取孕婦分娩后男性胎兒臍帶組織DNA作為對(duì)照，同時(shí)應(yīng)用Yfiler誖PCR擴(kuò)增試劑盒對(duì)上述樣本進(jìn)行Y-STR的毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)分析以驗(yàn)證孕婦外周血胎兒游離DNA分型結(jié)果的準(zhǔn)確性。孕晚期和孕中期孕婦外周血的游離DNA在Ion Torrent PGMTM系統(tǒng)測(cè)序方法檢測(cè)出等位基因的基因座比毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)出的基因座多，說(shuō)明Ion Torrent PGMTM系統(tǒng)靈敏度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于熒光檢測(cè)平臺(tái)。對(duì)比孕晚期和孕中期，發(fā)現(xiàn)孕晚期檢測(cè)出的基因座比孕中期多（表3），這可能與孕婦外周血的胎兒游離DNA量隨著孕期延長(zhǎng)而增加有關(guān)[4]。表3中，孕晚期檢出的7個(gè)Y-STR基因座，毛細(xì)管電泳檢測(cè)到的Y-STR樣本數(shù)量為0～3個(gè)，平均（1.57±0.98）個(gè)，測(cè)序法檢測(cè)到的Y-STR樣本數(shù)量為7～8個(gè)，平均（7.14±0.69）個(gè)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。孕中期檢出的7個(gè)Y-STR基因座，毛細(xì)管電泳檢測(cè)到的Y-STR樣本數(shù)量為0～1個(gè)，平均（0.43±0.54）個(gè)，測(cè)序法檢測(cè)到的Y-STR樣本數(shù)量為2～5，平均（4.43±1.13）個(gè)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 孕中期孕婦外周血血漿和分娩后臍帶組織Ion Torrent PGMTM測(cè)序等位基因分型結(jié)果

表3 孕中、晚期孕婦外周血血漿和臍帶組織中Y-STR的毛細(xì)管電泳和Ion Torrent PGMTM測(cè)序檢出結(jié)果比較

2.3 Y-STR的等位基因分型

應(yīng)用Ion Torrent PGMTM系統(tǒng)測(cè)序得到Y(jié)分型與男性胎兒檢測(cè)分型相一致，準(zhǔn)確性達(dá)到100%，但是存在個(gè)別樣本位點(diǎn)少量缺失的現(xiàn)象，這可能與孕婦外周血血漿中的游離DNA量極少，且游離DNA完整性受限制有關(guān)[3]。

對(duì)Y-STR的毛細(xì)管電泳檢測(cè)分析結(jié)果顯示，每例樣本只能獲得0～3個(gè)基因座的等位基因，無(wú)法明確判定基因型。而測(cè)序結(jié)果顯示，7個(gè)基因座中共檢測(cè)出21個(gè)等位基因，具體序列見(jiàn)表4。

結(jié)果顯示，采用Ion Torrent PGMTM測(cè)序法進(jìn)行Y-STR檢測(cè)，能夠同時(shí)獲取Y-STR長(zhǎng)度多態(tài)性及序列多態(tài)性信息，極大地提高其應(yīng)用于親子鑒定的識(shí)別率。

表4 Ion Torrent PGMTM測(cè)序檢測(cè)Y-STR基因座的等位基因分型結(jié)果

2.4 結(jié)論

本研究建立了Ion Torrent PGMTM系統(tǒng)對(duì)孕婦外周血中的游離DNA進(jìn)行Y-STR測(cè)序檢測(cè)的方法，可以通過(guò)Ion Torrent PGMTM系統(tǒng)盡早檢測(cè)被害人外周血游離DNA的Y-STR基因分型，為確定犯罪嫌疑人提供佐證。我們將進(jìn)一步對(duì)孕婦外周血游離胎兒DNA常染色體STR基因座的檢測(cè)進(jìn)行研究，為其在法庭科學(xué)中的應(yīng)用提供更大價(jià)值。

[1]Ruitberg CM，Reeder DJ，Butler JM.STRBase：a short tandem repeat DNA database for the human identity testing community[J].Nucleic Acids Res，2001，29（1）：320-322.

[2]Levine RJ，Qian C，Leshane ES，et al.Two-stage elevation of cell-free fetal DNA in maternal sera before onset of preeclampsia[J].Am J Obstet Gynecol，2004，190（3）：707-713.

[3]Pertl B，Bianchi DW.Fetal DNA in maternal plasma：emerging clinical applications[J].Obstet Gynecol，2001，98（3）：483-490.

[4]Lo YM，Zhang J，Leung TN，et al.Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma[J].Am J Hum Genet，1999，64（1）：218-224.

Application of Ion Torrent PGMTMSystem in Detection of Fetal DNA in Maternal Plasma

LIU Ya-nan1,ZHAO Xue-ying2,PING Yuan1,XU Qing-wen1,HUANG Jiang-ping1,ZOU Kai-nan1,ZHOU Huai-gu1
（1.Shanghai Key Laboratory of Crime Scene Evidence,Key Laboratory of Forensic Evidence and Science Technology,Ministry of Public Security,Institute of Forensic Science,Shanghai Public Security Bureau, Shanghai 200083,China;2.Shanghai Research Institute of Criminal Science and Technology,Shanghai 200083,China）

Objective To explore the feasibility of detecting of Y-STR of fetal DNA in maternal plasma using Ion Torrent PGMTMSystem.Methods A total of 16 fetal DNA samples from maternal plasmas（8 cases from 38 weeks gestational age and 8 ones from 12 weeks）were prepared and a multiplex assay with 7 STR loci（DYS390,DYS391,DYS393,DYS438,DYS437,DYS456,DYS635）was designed for multiplex-PCR amplification.Using Ion Torrent PGMTMSystem,the results of Y-STR sequences and capillary electrophoresis were obtained and compared.Results Y-STR specific alleles were detected in the maternal plasma of all the pregnant women having male babies of second and third trimester,which were higher than that detected by capillary electrophoresis.Consistent Y-STR genotypes were observed between fetal DNA from maternal plasma and genomic DNA from the newborn babies.Conclusion Based on Ion Torrent PGMTMSystem,the prenatal Y-STR detection method may provide a high-sensitive and high-throughput choice for prenatal STR detection in forensic testing.

forensic genetics;Y chromosome;pregnant women;fetus;short tandem repeat sequences; Ion Torrent PGMTMSystem

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.06.005

1004-5619（2015）06-0432-04

2015-07-31）

（本文編輯：李成濤）

公安部科技強(qiáng)警基礎(chǔ)工作專項(xiàng)資助項(xiàng)目（2013GABJC 005）

劉亞楠（1981—），男，碩士，主檢法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)DNA分析技術(shù)的應(yīng)用和研究；E-mail：dyndai@sina.cn

周懷谷，男，博士，主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)DNA分析技術(shù)的應(yīng)用和研究；E-mail：hgzhou803@hotmail.com